枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析

引用本文

韩泽刚, 赵曾强, 李会会, 张析, 李潇玲, 张薇. 枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析. 作物学报, 2015, 41(8): 1201-1211
HAN Ze-Gang, ZHAO Zeng-Qiang, LI Hui-Hui, ZHANG Xi, LI Xiao-Ling, ZHANG Wei. Expression Profiling Analysis between Resistant and Susceptible Cotton Cultivars ( Gossypium hirsutum L.) in Response to Fusarium Wilt . Acta Agronomica Sinica, 2015, 41(8): 1201-1211 复制到剪切板

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作物学报编辑部

枯萎病菌诱导感、抗陆地棉品种的基因表达谱分析

韩泽刚, 赵曾强, 李会会, 张析, 李潇玲, 张薇^*

石河子大学农学院 / 棉花分子育种实验室, 新疆石河子 832000

^*通讯作者(Corresponding author): 张薇, E-mail: zhw_agr@shzu.edu.cn

收稿日期:2015-05-04

基金:本研究由国家自然科学基金项目(31260358)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2011ZX08005-005)项目资助

摘要

选用陆地棉抗枯萎病品种中棉所12和感枯萎病品种新陆早7号, 利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗受到枯萎病菌侵染后3 h和6 h根部组织的基因表达谱。中棉所12受病菌侵染后3 h与0 h相比, 6 h与0 h相比以及6 h与3 h相比, 分别鉴定出4447、5481和2559个差异表达基因; 新陆早7号分别鉴定出8615、6727和2078个差异表达基因; 2个品种比较, 在3 h和6 h分别鉴定出1879个和500个差异表达基因。基因功能分析表明, 差异表达基因划分为生物学过程、细胞组分和分子功能注释本体, 并进一步细分为48个功能类别。代谢通路分析显示, 中棉所12和新陆早7号在枯萎病菌侵染后的6 h与0 h相比鉴定出的代谢通路(Pathway)最多, 均有126条; 在枯萎病菌侵染后6 h, 2个品种相比鉴定出的代谢通路最少, 仅有89条。各个比对组的代谢通路涉及的基因可被划分为次生代谢产物的生物合成、多糖的生物合成和代谢、环境适应和免疫系统等13类。在环境适应和免疫系统分类中存在着植物与病原菌相互作用代谢通路, 涉及到996个已知功能的差异表达基因, 有444个基因上调表达, 552个基因下调表达。其中, 差异表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因, 其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因, 而DNA损伤修复/耐受性蛋白, JAZ1、RAR1和RPM1互作蛋白, S位点的特异性糖蛋白S6前体以及钙牵引蛋白等6类基因参与该代谢通路的数目最少。最后随机抽取6个基因进行实时荧光定量PCR验证, 其结果与测序结果一致。

关键词: 陆地棉; 枯萎病; Solexa; 基因表达谱

Expression Profiling Analysis between Resistant and Susceptible Cotton Cultivars ( Gossypium hirsutum L.) in Response to Fusarium Wilt

HAN Ze-Gang, ZHAO Zeng-Qiang, LI Hui-Hui, ZHANG Xi, LI Xiao-Ling, ZHANG Wei^*

Agricultural College of Shihezi University / Laboratory of Cotton Molecular Breeding, Shihezi 832000, China

Abstract

Fusarium Wilt resistant cotton cultivar Zhongmiansuo 12 and susceptible cultivar Xinluzao 7 were used to analyze the gene expression profiling of root tissues at three hours and six hours after the seedlings infection by Fusarium Wilt using Solexa sequencing technology. Compared with no infection, 4447 and 5481 differential genes after three hours and six hours infected by Fusarium Wilt were identified, and compared six hours with three hours, 2559 differential genes were identified in Zhongmiansuo 12; while 8615, 6727, and 2078 was respectively identified in Xinluzao 7. There were 1879 and 500 differential genes in three hours and six hours after infection when the two cultivars were compared. According to the Gene Ontology, these genes were divided into these groups of biological process, cellular component and molecular function; then further subdivided into 48 functional categories. By analyzing the pathways, the most of them were identified in 6 h/0 h after infection between Zhongmiansuo 12 and Xinluzao 7, which were 126 each in the two cultivars; the least of pathways were at 6 h after infection in two cultivars, which was 89 only. However, all the pathways in each comparison group could be classified into 13 categories, such as biosynthesis of other secondary metabolites, glycan biosynthesis and metabolism, environmental adaptation, and immune system. A pathway, named plant-pathogen interaction in the environmental adaptation and immune system category, was involved in 996 differential genes; and the number of up regulated genes was 444 and that of down regulated genes was 552. The most differential genes were in WRKY transcription factor family, the serine/threonine kinase had the medium number of differential genes, while DNA damage-repair/toleration protein, JAZ1, RAR1, RPM1-interacting protein, S locus specific glycoprotein S6 precursor and caltractin had the least genes. Finally, six random genes were subjected to RT-PCR and the results validated the Solexa sequencing conclusions.

Keyword: Gossypium hirsutum; Fusarium wilt; Solexa; Expression profiling

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棉花枯萎病是一种危害严重的世界性病害。病菌侵染棉花后, 前期往往大量死苗, 后期叶片及蕾铃大量脱落, 甚至造成棉花植株的死亡, 严重影响棉花的品质及产量^{[1, 2]}。在植物体内存在极其复杂和完善的自我防卫系统。当植物受到病原菌侵染, 植物抗病基因编码蛋白与病原无毒基因编码蛋白相互识别和作用, 激活信号传导途径, 导致下游一系列抗病防卫反应基因的启动, 产生快速的抗病代谢, 这一过程涉及大量相关基因表达量的改变。刘坤^[3]利用qPCR技术分析棉花受到黄萎病菌侵染后, 29个ERF家族基因的表达变化, 发现除一个基因基本没有变化外, 其余基因均明显改变, 有的基因表达水平甚至增加7倍以上。韩庆典等^[4]利用基因芯片技术对水稻细菌性条斑病感抗品种分别进行检测, 共检测到956个差异表达基因, 其中12个基因在2个品种中一致上调, 54个基因在2个品种中一致下调, 20个基因在2个品种中表达变化方向相反。此外, 一些研究发现, 植物受到病原菌侵染后, 同一基因在感抗品种中的表达存在明显差异。何兰兰等^[5]发现ERF-B3亚组转录因子基因GhB301, 在受到枯萎病菌诱导后, 其表达量在抗病品种与感病品种中均明显增加, 但在抗病品种中表达量的增加显著高于感病品种; 在抗病品种中, 病菌处理后3 h表达量达到最大, 早于感病品种的6 h。

近年来, 人们在棉花抗病分子机制方面已做了大量研究工作, 并克隆了多个抗病相关基因。但由于陆地棉尚没有完成基因组测序, 对完整的转录组信息了解不足, 前人的研究多是对单个基因相对独立地分析, 难以获得系统的认识。Solexa测序技术通过对样品中数以百万计的mRNA标签进行序列测定, 捕获样品中低表达的基因, 克服了以往DNA微矩阵芯片等技术的不足, 在研究差异表达基因方面显示出强大的优势^[6]。Wu等^[7]通过Solexa高通量测序对葡萄霜霉病侵染和对照样品进行转录组测序, 发现了大量的差异表达基因, 并找到参与调控与核糖体结构、光合作用、氨基酸和糖代谢途径有关的基因, 初步揭示了葡萄霜霉病病程发展的调控机制。Bai等^[8]利用Solexa测序技术研究感抗香蕉枯萎病品种在枯萎病菌诱导后不同时间的基因表达谱, 发现抗病品种对香蕉枯萎病的防御响应更快, 并且在代谢通路(Pathway)分析中发现了大量抗病相关基因, 初步揭示了香蕉抗枯萎病的抗病机制。目前, Solexa高通量测序技术在研究植物的逆境胁迫方面得到广泛应用^{[9, 10, 11, 12, 13, 14]}, 本研究利用Solexa高通量测序技术构建感、抗棉花品种在枯萎病菌诱导后不同时间的基因表达谱, 分析枯萎病菌侵染早期不同时间及不同感、抗品种间基因在转录组水平上的差异表达, 旨在为揭示棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料和培养条件

陆地棉抗病品种中棉所12和陆地棉感病品种新陆早7号由石河子大学棉花所提供。挑选经浓硫酸脱绒后的籽粒饱满的种子, 经0.1%氯化汞浸泡15 min消毒, 无菌水冲洗4~5遍, 种植于无菌蛭石, 待棉苗长至3 cm左右移入盛有Hoagland营养液的塑料盒(用带有孔洞的泡沫板漂浮棉苗), 于25℃、光照16 h、黑暗8 h的培养箱中继续培育, 每周换一次培养液^[15]。

1.2 枯萎病菌和接种方法

将生长于PDA培养基的枯萎病菌[Fusarium oxysporumf. sp. vasinfectum(Atk.) Snyder & Hansen]菌落(菌种为枯萎病7号生理小种的强致病力菌系F430, 由石河子大学植保系张莉老师提供)接种到装有已灭菌的查氏培养液中, 28℃振荡培养4 d, 配制成浓度为7× 10⁶个mL^-1的孢子悬浮液。将长至二叶一心的棉花幼苗根部浸泡到孢子悬浮液接种病菌, 处理45 min后转入Hoagland营养液中, 采集中棉所12和新陆早7号两品种接菌后0、3和6 h的棉花根部组织, 并分别标记为Z-0、Z-3、Z-6和X-0、X-3、X-6。液氮速冻后保存于-80℃冰箱。

1.3 RNA提取及cDNA的合成

采用改良的CTAB法^[16]提取棉花根部组织RNA, 用ND-100 Nanopo spectrophotometer and Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品的质量。检测合格的RNA样品, 加热打开二级结构后用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA, 向得到的mRNA中加入适量打断试剂, 高温条件下使其片段化, 再以片段后的mRNA为模板, 合成cDNA, 利用磁珠纯化双链cDNA。

1.4 标签文库的构建及Solexa测序

对所得的双链cDNA经过末端修复、3° 末端加碱基A及加测序接头后, 进行PCR扩增富集测序样本, 从而完成整个文库制备。对构建好的文库用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI Step One Plus Real-time PCR System进行质量和产量检测, 合格后使用Illumina HiSeq 2000测序, 得到Raw reads。

1.5 测序数据的生物信息学分析

将测序得到的Raw reads, 去除含有接头的序列、未知序列的比例大于10%的以及低质量的reads, 得到clean reads, 以备后续试验。再使用短reads比对软件SOAPalingner/soap 2将clean reads比对到最新雷蒙德氏棉参考基因序列及雷蒙德氏棉参考基因组序列, 最多允许2个碱基错配。对测序结果进行饱和度分析, 随机性分析及在参考基因组上的分布分析, 合格后运用RPKM法(Reads per kb per million reads)计算基因表达量^[17]。

基于Audic和Claverie^[18]描述的方法, 对表达谱中每个基因进行显著性分析。错配率(false discovery rate, FDR)则被用于确定P值的阈值^[19]。符合P< 0.005, FDR≤ 0.001以及│log₂ ratio│≥ 1的基因被定义为差异表达基因, 对所有差异表达基因进行GO功能注释及分类, 并利用KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库定位分析Pathway。

1.6 实时荧光定量PCR的检测

从Solexa测序获得的差异表达基因中, 随机挑选6个差异表达明显的基因进行实时荧光定量PCR测定, 采用改良CTAB法提取总RNA。按照Fermentas公司生产的第一链cDNA合成试剂盒说明书上的步骤合成cDNA。依据数字化基因表达谱测序所得序列库对应的代表序列, 使用Primer premier 5.0软件设计实时荧光定量PCR引物, 以棉花的GhUBQ7 (DQ116441)基因作为内参基因(表1)。引物由北京六合华大基因科技有限公司合成, 所用染料为TaKaRa公司的SYBR, 实时荧光定量PCR的反应体系及程序参见TOYOBO公司的SYBR Green Realtime PCR Master Mix (QPK-212)说明书, 设3个重复, 采用2^{-∆ ∆ Ct}法计算基因相对表达量。

表1 用于实时荧光定量PCR的引物 Table 1 Primers for real-time PCR

2 结果与分析

2.1 测序饱和度分析

测序饱和度是用来衡量样品测序量的多少是否能够达到分析标准。当测序量(reads数量)增加时, 所能检测到的基因数量也随之增多, 但是当测序量达到某一阈值后, 检测到的基因数量增加的趋势趋于平缓, 证明检测到的基因趋于饱和。以Z-3为例(图1, 其他处理时间的测序饱和度趋势与之类似), 当测序样品的clean reads的数目达到2M时, 检测到的基因数目趋于饱和, 说明测序量已基本覆盖细胞中表达的全部基因, 可用于后续的研究分析。

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	图1 Z-3的Solexa测序饱和度分析Fig. 1 Solexa sequencing saturation analysis of Z-3

2.2 差异表达基因统计分析

经Solexa测序后, 对差异表达基因统计分析(表2)表明, 2个品种在枯萎病菌侵染后的3 h和6 h, 分别与对照相比, 差异表达基因中的下调基因均明显多于上调基因, 且感病品种的差异表达基因明显多于抗病品种。在中棉所12中, 与对照(Z-0)相比, 枯萎病菌侵染后3 h (Z-3)差异表达基因数目为4447个。其中上调基因数目为1300个, 下调基因数目为3147个。枯萎病菌处理后6 h (Z-6), 与对照相比, 差异表达基因数目为5481个。其中上调基因数目为1494个, 下调基因数目为3987个。而Z-6与Z-3相比, 差异表达基因的数目较少, 为2559个。其中上调基因数目为1020个, 下调基因数目为1539个。在新陆早7号中, 与对照(X-0)相比, 枯萎病菌侵染后3 h (X-3)的差异表达基因数目为8615个。上调基因数目为2118个, 下调基因数目为6497个。枯萎病菌处理后6 h (X-6)与X-0相比, 差异表达基因数目为6727个。上调基因数目为2038个, 下调基因数目为4689个。而X-6与X-3相比, 差异表达基因的数目为2078个。其中上调基因数目为1010个, 下调基因数目为1068个。

比较2个品种在枯萎病菌侵染同一时间点的差异表达基因(表2)表明, 下调基因数目依然多于上调基因, 但是差异表达基因的总数迅速下降。其中, 在受到枯萎病菌侵染后的3 h (Z-3 vs. X-3), 抗病品种相对于感病品种的差异表达基因数目为1879个。上调基因数目为874个, 下调基因数目为1005个。而在受到枯萎病菌侵染后的6 h (Z-6 vs. X-6), 抗病品种相对于感病品种的差异表达基因数目为500个。上调基因数目为314个, 下调基因数目为186个。

表2 差异表达基因 Table 2 Number of differentially expressed genes

2.3 差异表达基因GO功能分析

GO分析将104 610个差异表达基因分为3个功能注释本体, 分别描述基因的生物学过程、细胞组分和分子功能。中棉所12比对组Z-3 vs. Z-0、Z-6 vs. Z-0和Z-6 vs. Z-3分别有15 578、21 581和9683个, 而新陆早7号比对组分别有33 462、27 728和7377个unigene至少含有一种功能注释。2个品种相同处理时间的比对组Z-3 vs. X-3和Z-6 vs. X-6分别有7052个和1750个unigene至少含有一种功能注释。生物学过程、细胞组分和分子功能又可被进一步划分为48个类别(表3), 依次为23、14和11个类别。其中催化活性, 代谢过程和蛋白结合注释到的差异表达基因最多, 分别为12 397、12 158和11 678个, 而翻译调控活性类别最少, 仅有1个差异表达基因。

表3 差异表达基因的功能分类 Table 3 Functional categorization of the differentially expressed genes

功能类别 Class	基因数量The number of genes								合计 Total
功能类别 Class	Z-3 vs. Z-0	Z-6 vs. Z-0	Z-6 vs. Z-3	X-3 vs. X-0	X-6 vs. X-0	X-6 vs. X-3	Z-3 vs. X-3	Z-6 vs. X-6	合计 Total
生物学过程Biological process
代谢过程 Metabolic process	1560	2139	977	3155	2686	773	703	165	12158
细胞过程 Cellular process	1333	1822	869	2686	2273	643	578	144	10348
刺激反应 Response to stimulus	682	913	429	1244	1085	333	316	91	5093
单生物过程 Single-organism process	633	870	418	1345	1083	272	282	71	4974
定位 Localization	341	470	218	648	575	149	161	43	2605
定位建立 Establishment of localization	332	456	213	630	557	147	158	43	2536
生物调节 Biological regulation	286	407	194	610	507	126	126	33	2289
发育过程 Developmental process	232	337	170	585	471	122	127	26	2070
生物过程调控 Regulation of biological process	208	318	147	487	402	95	103	28	1788
细胞组分组织生物合成 Cellular component organization or biogenesis	176	247	124	438	340	72	82	13	1492
多细胞有机体过程 Multicellular organismal process	175	244	113	419	336	81	90	26	1484
信号相关 Signaling	170	240	116	354	304	69	75	21	1349
复制 Reproduction	115	156	85	294	227	59	77	11	1024
复制过程 Reproductive process	108	146	78	280	217	56	72	9	966
多/有机进程 Multi-organism process	61	80	41	114	104	28	32	5	465
生长 Growth	25	36	22	54	56	16	14	0	223
免疫系统过程 Immune system process	21	28	17	38	39	13	15	2	173
生物过程负调节 Negative regulation of biological process	14	29	18	46	31	11	14	0	163
生物过程正调节 Positive regulation of biological process	14	15	6	24	24	7	5	2	97
节律性过程 Rhythmic process	9	6	2	18	14	4	0	3	56
生物粘连 Biological adhesion	0	0	0	2	2	0	0	0	4
细胞死亡 Cell killing	0	1	1	0	1	1	0	0	4
运动 Locomotion	0	0	0	1	1	0	0	0	2
细胞组分Cellular component
细胞 Cell	1395	1957	793	3236	2635	634	573	152	11375
细胞部分 Cell part	1395	1957	793	3236	2635	634	573	152	11375
细胞器 Organelle	1010	1400	555	2340	1876	459	404	108	8152
细胞膜 Membrane	647	975	444	1352	1169	287	325	77	5276
细胞器部分 Organelle part	325	491	175	890	710	168	144	40	2943
细胞膜组成 Membrane part	307	457	238	631	531	152	162	34	2512
大分子复合体 Macromolecular complex	167	296	83	752	588	81	81	28	2076
膜附着腔 Membrane-enclosed lumen	45	58	21	165	114	18	24	4	449
胞外区 Extracellular region	54	79	35	97	83	25	36	9	418
胞外区部分 Extracellular region part	5	4	4	6	6	2	5	2	34
细胞连接 Cell junction	5	6	3	6	6	2	1	1	30
胞外基质 Extracellular matrix	1	3	1	5	4	2	0	0	16
胞外基质部分 Extracellular matrix part	0	1	0	1	1	0	0	0	3
类核 Nucleoid	1	1	0	0	0	0	0	0	2
分子功能Molecular function
催化活性 Catalytic activity	1687	2198	1053	3027	2570	863	816	183	12397
蛋白结合 Binding	1519	2028	952	3067	2528	752	658	174	11678
转运活性 Transporter activity	196	277	142	358	308	95	97	24	1497
结构分子活性 Structural molecule activity	51	96	9	314	243	13	8	3	737
分子转导活性 Molecular transducer activity	86	120	44	184	150	32	42	8	666
核酸结合转录因子活性 Nucleic acid binding transcription factor activity	95	99	37	153	115	31	24	8	562
抗氧化活性 Antioxidant activity	49	55	18	62	49	27	18	3	281
酶调节活性 Enzyme regulator activity	30	38	17	74	47	12	25	4	247
受体活性 Receptor activity	8	19	6	27	19	6	5	0	90
蛋白结合转录因子活性 Protein binding transcription factor activity	5	6	1	7	6	5	1	0	31
翻译调控活性 Translation regulator activity	0	0	1	0	0	0	0	0	1
合计Total	15578	21581	9683	33462	27728	7377	7052	1750	124211

表3 差异表达基因的功能分类 Table 3 Functional categorization of the differentially expressed genes

2.4 差异表达基因Pathway分析

利用KEGG数据库代谢途径对差异表达基因进行功能注释和分类。通过Solexa测序, 中棉所12和新陆早7号比对组Z-6 vs. Z-0和X-6 vs. X-0鉴定出的Pathway最多, 均有126条, 且名称一致, 注释到的差异表达基因数目分别为5313个和6107个。经对比分析, 发现其余各个比对组的Pathway均少于126条, 且都在126条的基础上缺少一条或多条Pathway。Z-6 vs. X-6的Pathway数量最少, 仅有89条, 注释到的差异表达基因为456个; 缺少37条Pathway, 涉及到脂质代谢、能量代谢、氨基酸代谢、多糖的生物合成和代谢、碳水化合物代谢、辅助因子和维生素的代谢、萜类化合物和多酮类化合物代谢、次生代谢产物的生物合成以及遗传信息处理等9个方面。Z-6 vs. Z-3的Pathway有120条, 注释到的差异表达基因为2405个; 与126条相比缺少6条Pathway, 涉及到辅助因子和维生素的代谢, 氨基酸代谢, 脂质代谢以及遗传信息处理4个方面。X-6 vs. X-3的Pathway有118条, 注释到的差异表达基因为2282个; 与126条相比缺少8条Pathway, 涉及到辅助因子和维生素的代谢, 能量代谢, 次生代谢产物的生物合成以及遗传信息处理。Z-3 vs. X-3的Pathway有117条, 注释到的差异表达基因为2034个; 与126条相比缺少9条Pathway, 涉及到辅助因子和维生素的代谢, 次生代谢产物的生物合成以及遗传信息处理。此外, Z-3 vs. Z-0的Pathway有123条, 注释到的差异表达基因为4060个, X-3 vs. X-0的Pathway有125条, 注释到的差异表达基因为7281个。

各比对组的Pathway总数不同, 注释到的差异表达基因数目不同, 但是除去无法具体分类的代谢途径Pathway (ko01100)后, 剩余的125条Pathway均可划分为13类别, 将它们在6个比对组中涉及基因占注释基因的平均百分比作图(图2)。次生代谢产物的生物合成涉及基因占注释基因的百分比最高, 平均值为21.36%; 遗传信息处理相关基因所占比例次之, 平均值为15.36%; 而辅助因子和维生素的代谢的相关基因所占比例最少, 其平均值仅为1.73%。除上述代谢相关基因外, 环境信息处理相关基因平均百分比为10.11%; 萜类化合物和多酮类化合物的代谢相关基因平均值仅为4.95%; 还有平均百分比为8.70%的基因参与环境适应和免疫系统; 而这几类Pathway可作为后续研究重点, 分析这些基因在感抗品种对枯萎病菌不同抗性表现中的作用。

2.5 植物-病原菌相互作用Pathway分析

在环境适应和免疫系统分类中存在着植物与病原菌相互作用Pathway (ko04626), 并且在Z-3 vs. Z-0; Z-6 vs. Z-0; Z-6 vs. Z-0; X-3 vs. X-0; X-6 vs. X-0; X-6 vs. X-3; Z-3 vs. X-3以及Z-6 vs. X-6比对组中分别涉及到232、290、159、421、323、133、113和34个差异表达基因(含重复), 去除未知、预测及未命名基因后统计汇总(表4)表明, 该Pathway中的996个差异表达基因有444个基因上调表达, 552个基因下调表达; 共涉及到61类差异表达基因, 其中差异表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因, 共有162个(79个上调表达, 83个下调表达), 所占比例为16.3%; 其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因, 共有82个(38个上调表达, 44个下调表达), 所占比例为8.2%; 而DNA损伤修复/耐受性蛋白, JAZ1、RAR1、RPM1互作蛋白, S位点的特异性糖蛋白S6前体以及钙牵引蛋白等6类基因参与该Pathway的数目最少, 分别只有1个, 所占比例仅为0.1%。此外, 值得注意的是, 在这些差异表达基因中有38个与NBS- LRR类抗病蛋白相关, 25个与bHLH转录因子相关, 22个与bZIP转录因子相关, 22个与抗病相关蛋白相关, 7个与抗黄萎病蛋白相关。

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	图2 13类代谢通路在6个比对组中涉及基因占注释基因的平均百分比Fig. 2 Percentage of genes in the total annotated genes of 13 pathways in six comparison groups

表4 植物-病原菌相互作用Pathway中涉及的差异表达基因 Table 4 Differentially expressed genes of plant-pathogen interaction Pathway

基因名称 Gene name	上调Up regulation		下调 Down regulation		总数 Total
基因名称 Gene name	数目 Number	log₂Ratio平均值 Mean of log₂ Ratio	数目 Number	log₂Ratio平均值 Mean of log₂Ratio	总数 Total
WRKY转录因子 WRKY transcription factor	79	2.29	83	-2.56	162
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Serine/threonine protein kinase	38	2.32	44	-3.62	82
钙结合蛋白 Calcium binding protein	43	2.31	23	-2.83	66
LRR受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 LRR receptor serine/threonine protein kinase	30	2.31	17	-3.09	47
ATP 结合蛋白 ATP binding protein	14	2.02	29	-3.05	43
富含亮氨酸重复蛋白 Leucine rich repeat protein	16	1.93	23	-3.42	39
有丝分裂活化蛋白激酶 Mitogen activated protein kinase	12	2.05	27	-2.63	39
NBS-LRR类抗病蛋白 NBS-LRR resistance protein	9	2.71	29	-3.10	38
蛋白激酶 Kinase	26	2.36	12	-1.98	38
钙依赖型蛋白激酶 Calcium dependent protein kinase	19	1.64	13	-2.15	32
油菜素甾醇不敏感型1相关受体激酶前体 Brassinosteroid insensitive 1 associated receptor kinase precursor	14	3.40	13	-4.25	27
bHLH转录因子 bHLH transcription factor	3	1.56	22	-2.46	25
热激蛋白 Heat shock protein	14	2.95	11	-1.75	25
调钙蛋白 Calmodulin	17	2.52	8	-1.68	25
bZIP转录因子 bZIP transcription factor	11	2.77	11	-2.54	22
抗病相关蛋白 Disease resistance protein	8	2.78	14	-2.46	22
受体蛋白激酶 Receptor kinase	10	2.25	11	-2.89	21
呼吸爆发氧化酶 Respiratory burst oxidase	9	2.49	6	-4.32	15
OCS元件结合因子 Ocs element binding factor	13	1.81	1	-1.88	14
钾离子通道蛋白 Potassium channel	4	2.13	10	-2.20	14
铁螯合还原酶 Ferric chelate reductase	0	0.00	14	-5.65	14
TIFY蛋白 TIFY protein	7	3.26	6	-2.85	13
受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶 Receptor serine-threonine protein kinase	3	1.64	10	-2.08	13
呼吸爆发氧化酶同源蛋白 Respiratory burst oxidase homolog protein	4	2.29	8	-1.76	12
LRR受体蛋白激酶 LRR receptor protein kinase	0	0.00	11	-5.88	11
DNA结合蛋白 DNA binding protein	1	1.21	8	-2.96	9
环核苷酸门控离子通道 Cyclic nucleotide-gated ion channel	0	0.00	9	-1.70	9
LRR类受体蛋白激酶EXS前体 LRR receptor protein kinase EXS precursor	0	0.00	8	-3.60	8
多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白 Polygalacturonase-inhibiting protein	5	1.91	3	-7.52	8
抗黄萎病蛋白 Verticillium wilt resistance protein	4	3.45	3	-4.93	7
壁相关受体蛋白激酶 Wall associated receptor kinase	5	3.61	1	-1.27	6
GbVe	3	1.53	2	-2.28	5
SGT1同源蛋白 SGT1 homolog protein	0	0.00	5	-1.45	5
SRF蛋白 SRF protein	0	0.00	5	-4.83	5
富含半胱氨酸受体蛋白激酶 Cysteine rich receptor like protein kinase	4	1.52	1	-1.27	5
bmk蛋白激酶 Big map kinase/bmk	3	1.87	1	-1.50	4
丙三醇激酶同工酶 Glycerol kinase isoform	0	0.00	4	-1.41	4
受体蛋白 Receptor protein	1	1.50	3	-1.83	4
体细胞胚胎发育受体蛋白激酶 Somatic embryogenesis receptor kinase	2	1.53	2	-2.12	4
细胞附着蛋白 Cytohesin	0	0.00	4	-1.28	4
型态形成蛋白 Pattern formation protein	0	0.00	4	-1.38	4
油菜素甾醇LRR受体激酶前体 Brassinosteroid LRR receptor kinase precursor	0	0.00	4	-3.03	4
C型凝集素受体样酪氨酸蛋白激酶 C-type lectin receptor-like tyrosine protein kinase	0	0.00	3	-2.67	3
GHDEL61	0	0.00	3	-5.58	3
LysM结构域蛋白前体 LysM domain protein precursor	3	2.54	0	0.00	3
壁相关蛋白激酶 Wall associated kinase	0	0.00	3	-1.72	3
蛋白结合蛋白 Protein binding protein	0	0.00	3	-4.96	3
蛋白磷酸酶 Phosphoprotein phosphatase	0	0.00	3	-2.22	3
富含脯氨酸受体蛋白激酶 Proline rich receptor protein kinase	2	1.18	1	-1.49	3
硝酸盐诱导蛋白 Nitrate induced NOI protein	1	2.25	2	-2.90	3
叶绿体茉莉酸ZIM结构域蛋白 Plastid jasmonates ZIM-domain protein	2	1.24	1	-1.27	3
诱导响应蛋白 Elicitor responsive protein	2	2.51	1	-1.91	3
L型凝集素结构域的受体激酶 L-type lectin domain containing receptor kinase	0	0.00	2	-1.47	2
酪氨酸蛋白激酶 Tyrosine protein kinase	0	0.00	2	-2.27	2
油菜素甾醇不敏感型1前体 Brassinosteroid insensitive 1 precursor	1	2.64	1	-1.47	2
DNA损伤修复/耐受性蛋白 DNA damage-repair/toleration protein	0	0.00	1	-4.40	1
JAZ1	1	1.44	0	0.00	1
RAR1	0	0.00	1	-1.18	1
RPM1互作蛋白 RPM1 interacting protein	1	1.05	0	0.00	1
S位点的特异性糖蛋白S6前体 S locus specific glycoprotein S6 precursor	0	0.00	1	-3.39	1
钙牵引蛋白 Caltractin	0	0.00	1	-1.29	1
合计Total	444		552		996

表4 植物-病原菌相互作用Pathway中涉及的差异表达基因 Table 4 Differentially expressed genes of plant-pathogen interaction Pathway

2.6 实时荧光定量PCR验证分析

以中棉所12和新陆早7号的在枯萎病菌侵染后3 h和6 h的4个cDNA作为样本, 从Solexa测序中随机挑选的3个上调和3个下调的差异表达基因进行实时荧光定量PCR检测。并根据所得数据以2为底的对数值进行标准化处理后。结果如图3所示, 黑色柱形图为Solexa测序数据结果, 白色柱形图为实时荧光定量PCR验证数据结果。可以看出, 这6个基因相对表达量与Solexa测序的结果趋势是相同的, 说明基因表达谱测序获得的信息具有较高的可靠性。

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	图3 Solexa测序和Real-time PCR的表达量比对Fig. 3 Validation of Solexa sequencing data by Real-time PCR

3 讨论

近年来, Solexa测序技术的迅猛发展给生物基因组学的研究带来了深刻的影响, 为从整体水平研究作物的基因表达变化, 阐明作物对病原菌的抗性机制提供了有力的技术支持。本试验利用Solexa高通量测序技术建立了高抗枯萎病品种中棉所12和高感枯萎病品种新陆早7号在枯萎病菌侵染后3 h和6 h的棉花根部表达谱, 在受到枯萎病菌诱导后, 探索感病品种和抗病品种在转录组水平上的差异。尽管中棉所12和新陆早7号在遗传背景上存在着区别, 但在缺少近等基因系的情况下, 选用2个对枯萎病抗性存在明显差异的陆地棉品种作为研究材料, 利用Solexa测序技术研究不同侵染时间后基因的表达谱差异, 对进一步阐明棉花与枯萎病互作的分子调控机制仍具有指导意义。

通过对感抗品种差异表达基因分析表明, 与对照相比, 2个品种在枯萎病菌侵染后3 h和6 h, 许多基因的表达量发生改变; 其中下调基因的数目明显多于上调基因。这一结果与王刚等的研究类似^{[20, 21, 22]}。此外, 感抗品种在枯萎病菌侵染后相同时间, 其差异表达基因中下调基因仍多于上调基因, 但差异表达基因总数迅速下降。这些差异表达基因是否与这2个品种对于枯萎病表现出不同抗性有关仍需要后续试验验证。另外, 在差异表达基因中有一部分是没有功能注释、没有报道的基因, 推测可能是棉花全基因组测序未完成, 可供参考的数据信息比较有限, 加之很多数据信息来自于棉花纤维发育, 抗病相关信息还非常缺乏, 但它们的重要性不可忽略。

通过GO功能分析发现6个比对组中的差异表达基因在3个注释本体中所占的比例大致相同, 即分子功能约占20%, 生物学过程约占40%, 细胞组分则约占30%。同时大部分基因富集在分子功能本体中的蛋白结合和催化活性, 细胞组分中的的细胞、细胞部分、细胞器上, 并主要参与细胞过程和代谢过程等生物学过程; 这与陈欢等^[21]关于大豆籽粒不同发育时期表达谱研究的结果类似。仅从分子功能的转录因子活性类别中就找到了许多目前已证实与抗病相关的bZIP类、WRKY类、AP2/EREBP类、NAC类等以及研究不多的homeodomain和HSF等转录因子调控的基因^[23], 这为后续抗病相关基因的挖掘工作指明方向。

Pathway中可以找到许多已证实与抗病相关的萜类、黄酮类, 生物碱类等小分子化合物的合成^[24]。如萜类骨干生物合成(ko00900), 单萜的生物合成(ko00902), 倍半萜类和三萜类生物合成(ko00909), 黄酮类的生物合成(ko00941、ko00944等)以及多种生物碱的合成(ko00950、ko00960等)。此外, 已有研究表明, 植物内源激素在植物受到生物胁迫和非生物胁迫时发挥重要作用, 多种植物激素曾被报道参与调控植物对病原菌的抗性^{[25, 26]}, 而环境信息处理中恰好存在植物激素信号转导Pathway (ko04075), 其涉及到的差异表达基因也具有重要的研究意义。

在植物与病原菌相互作用Pathway中涉及到996个已知功能的差异表达基因, 其中WRKY、bHLH及bZIP三类转录因子家族分别有162、25和22个差异表达基因参与, 而已经证实它们与植物的抗病反应有关, 其可以与相应基因启动子中的顺式作用元件发生DNA-蛋白的特异性互作, 从而激活防卫反应基因的转录表达^[23]。另有82个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因, 47个LRR受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因, 38个蛋白激酶基因, 38个NBS-LRR类抗病蛋白, 13个受体丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶基因, 11个LRR受体蛋白激酶基因以及3个蛋白磷酸酶基因参与该Pathway。大量研究表明, 蛋白激酶和蛋白磷酸酶对植物-病原菌互作反应起调节作用, 并且与抗病基因也存在联系^[27]。Song等^[28]曾克隆水稻抗白叶枯病基因Xa21, 其结构与拟南芥中的受体蛋白激酶类似, 属于丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶家族。蛋白质序列分析表明在其氨基端含有LRR区(leucine-rich region), 参与蛋白质相互作用, 表明LRR蛋白与蛋白激酶可以在植物抗病信号传递过程中相互作用, 参与植物的抗病反应^[29]。还有22个与抗病相关蛋白基因, 7个抗黄萎病蛋白基因, 上述结果表明植物与病原菌相互作用Pathway中涉及到的差异表达基因具有重要的研究意义, 除重点研究单个基因对棉花枯萎病抗性的功能外, 更应该分析多个基因之间的相互作用以深入了解植物的抗病机制。同时剩余的大量未知、未命名基因也可作为后续研究的重点。

实时荧光定量PCR检测Solexa测序后6个基因的相对表达量, 发现二者上调或者下调的趋势是相同的, 但其结果并不完全一致, 主要由2个技术在检测灵敏性上的差异造成^[30], 依然可说明Solexa测序获得的结果具有较高的可靠性。

本研究利用Solexa高通量测序技术对枯萎病菌侵染早期不同时间、不同感抗品种的基因的表达变化进行了全面、深入的检测, 无论是差异基因的筛选, GO功能分析以及Pathway分析等都表明感抗枯萎病品种在枯萎病菌诱导后抗性机制有差别, 而大量的差异表达基因也为筛选抗枯萎病相关基因提供丰富的数据资源, 为进一步研究棉花抗枯萎病的分子调控机制奠定了基础。

4 结论

选用中棉所12和新陆早7号, 利用Solexa高通量测序技术分析棉花幼苗受到枯萎病菌侵染后3 h和6 h根部组织的基因表达谱, 从中筛选出大量差异表达基因。已注释的差异表达基因依据功能, 可划分为生物学过程、细胞组分和分子功能3个功能注释本体, 进一步细分为48个功能类别。代谢通路分析鉴定出从89条到126条不等的Pathway, 涉及到的基因可以划分为次生代谢产物的生物合成, 多糖的生物合成和代谢, 环境适应和免疫系统等13类。996个已知功能的差异表达基因参与植物与病原菌相互作用Pathway, 涉及差异表达基因最多的是WRKY转录因子家族基因, 其次为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因; 而DNA损伤修复/耐受性蛋白、JAZ1及钙牵引蛋白等6类基因参与该Pathway的数目最少。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献

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Effect of Fusarium wilt on the cotton yield and fiber quality.

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对2002年长江流域棉花区试的10个新品种进行了抗枯萎病(Fusarium wilt)鉴定,并从每个品种中各选择30个单株,分株计产,按株取样检验其纤维品质.分析棉株不同的枯萎病级别对棉花产量和品质的影响.结果表明:(1)有2个品种抗枯萎病;6个耐病;2个感病.(2)枯萎病株的皮棉产量比健株减产的百分率分别为:Ⅰ级26.48%,Ⅱ级45.50%,Ⅲ级54.57%,Ⅳ级77.76%,减产极显著.(3)病株纤维的长度、整齐度、比强度和伸长率也均显著或极显著低于健株.棉株枯萎病级别与纤维长度呈极显著负相关,与比强度和麦克隆值呈显著负相关.

... 病菌侵染棉花后, 前期往往大量死苗, 后期叶片及蕾铃大量脱落, 甚至造成棉花植株的死亡, 严重影响棉花的品质及产量^[1,2] ...

2002

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徐秋华, 张献龙, 聂以春, 冯纯大. 我国棉花抗枯萎病品种的遗传多样性分析. 中国农业科学, 2002, 35: 272-276

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Genetic diversity evaluation of cultivars (G. hirsumtum L. ) resistant to Fusarium wilt by RAPD markers.

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利用RAPD标记从分子水平上对在生产上有较大影响的51个抗枯萎病陆地棉品种进行了遗传多样性分析.51个陆地棉品种在41个具多态性的随机引物上扩增得到82个多态性位点.应用NTSYS-pc 1.80数据分析软件,非加权组平均法(UPGMA)聚类.51个品种之间的平均成对Jaccard's相似系数为0.598.有17.1%的品种对在遗传上相似性较大,相似系数大于0.700.品种对相似系数在平均值附近[0.500,0.700]区间上所占的比例最大,为66.9%.遗传差异较大(相似系数小于0.500)的品种所占的比例仅为16%.总体来说,我国抗枯萎病棉花品种之间的相似性较高.我国陆地棉品种资源整体上遗传多样性水平低下,以及我国抗枯萎病品种资源狭窄的遗传基础是导致陆地棉品种遗传多样性较贫乏的重要因素.从亚洲棉、海岛棉和其它棉属种内引进抗病基因成为棉花抗枯萎病育种取得突破性进展的关键.研究同时以相似系数矩阵为基础,构建了51个抗枯萎病陆地棉品种的UPGMA树状聚类图.

... 病菌侵染棉花后, 前期往往大量死苗, 后期叶片及蕾铃大量脱落, 甚至造成棉花植株的死亡, 严重影响棉花的品质及产量^[1,2] ...

2011

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... 刘坤^[3]利用qPCR技术分析棉花受到黄萎病菌侵染后, 29个ERF家族基因的表达变化, 发现除一个基因基本没有变化外, 其余基因均明显改变, 有的基因表达水平甚至增加7倍以上 ...

2008

0.0

0.805

... 韩庆典等^[4]利用基因芯片技术对水稻细菌性条斑病感抗品种分别进行检测, 共检测到956个差异表达基因, 其中12个基因在2个品种中一致上调, 54个基因在2个品种中一致下调, 20个基因在2个品种中表达变化方向相反 ...

2013

0.0

0.947

何兰兰, 柴蒙亮, 韩泽刚, 赵曾强, 张薇. 棉花抗枯萎病相关ERF-B3亚组转录因子的克隆与表达. 西北植物学报, 2013, 33: 2375-2381

He L

, Chai M

, Han Z

, Zhao Z

, Zhang

Cloning and expression of ERF-B3 subgroup transcription factor related to resistance Fusarium Wilt in cotton.

Acta Bot Boreali-Occident Sin, 2013, 33: 2375-2381 (in Chinese with English abstract)

BLAST searches of cotton EST database were performed using the AP2/ERF domain of the ERF-B3 subgroup transcription factors from Arabidopsis thaliana as a query sequence.Through the method of in silico cloning and RT-PCR, GhB 301,an ERF-B3 subgroup transcription factor related to resistant Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum ( Fov ) was cloned from the roots of ‘Zhongmiansuo 12’ which was a high resistant cultivar to the infection of Fov .Sequence analysis indicated that the full length cDNA of GhB 301 was 593 bp,with 384 bp ORF encoding 127 amino acids and a conserved AP2/ERF domain.qRT-PCR analysis indicated that, GhB 301 gene highly expressed in roots and resistant cultivar after the treatment of Fov .The expression level of GhB30 1 also changed under the treatment of ET,SA,drought,low temperature and high salinity.The results suggested that GhB 301 gene might participate in the response of plants to the pathogenic-bacteria,hormone and abiotic stresses.

以拟南芥ERF-B3亚组转录因子的AP2/ERF结构域为探针,利用NCBI中的棉花( Gossypium hirsutum )EST数据库,通过电子克隆结合RT-PCR方法,从枯萎病菌诱导后的高抗枯萎病品种‘中棉所12’克隆到1个与抗枯萎病相关的ERF-B3亚组转录因子基因 GhB 301。序列分析结果显示, GhB 301基因cDNA全长593 bp,开放阅读框384 bp,编码127个氨基酸,含有一个保守的AP2/ERF结构域。实时荧光定量PCR检测该基因的表达显示,枯萎病菌诱导后, GhB 301基因在棉花根中、抗病品种中优势表达;在乙烯、水杨酸、干旱、低温及高盐的诱导下表达量均发生变化。研究结果表明, GhB3 01基因可能参与了棉花对病原菌、激素及非生物胁迫的应答反应。

... 何兰兰等^[5]发现ERF-B3亚组转录因子基因GhB301, 在受到枯萎病菌诱导后, 其表达量在抗病品种与感病品种中均明显增加, 但在抗病品种中表达量的增加显著高于感病品种 ...

2010

0.0

... Solexa测序技术通过对样品中数以百万计的mRNA标签进行序列测定, 捕获样品中低表达的基因, 克服了以往DNA微矩阵芯片等技术的不足, 在研究差异表达基因方面显示出强大的优势^[6] ...

2010

3.942

0.0

... Wu等^[7]通过Solexa高通量测序对葡萄霜霉病侵染和对照样品进行转录组测序, 发现了大量的差异表达基因, 并找到参与调控与核糖体结构、光合作用、氨基酸和糖代谢途径有关的基因, 初步揭示了葡萄霜霉病病程发展的调控机制 ...

2013

3.534

0.0

... Bai等^[8]利用Solexa测序技术研究感抗香蕉枯萎病品种在枯萎病菌诱导后不同时间的基因表达谱, 发现抗病品种对香蕉枯萎病的防御响应更快, 并且在代谢通路(Pathway)分析中发现了大量抗病相关基因, 初步揭示了香蕉抗枯萎病的抗病机制 ...

2012

0.0

... 目前, Solexa高通量测序技术在研究植物的逆境胁迫方面得到广泛应用^{[9,10,11,12,13,14]}, 本研究利用Solexa高通量测序技术构建感、抗棉花品种在枯萎病菌诱导后不同时间的基因表达谱, 分析枯萎病菌侵染早期不同时间及不同感、抗品种间基因在转录组水平上的差异表达, 旨在为揭示棉花抗枯萎病的分子调控机制及筛选抗枯萎病相关基因奠定基础 ...

2013

0.0

2013

2.374

0.0

2013

3.534

0.0

2013

2.374

0.0

2013

3.534

0.0

2008

0.0

彭姗, 吕学莲, 高峰, 李国英, 李晖. 一种新的棉花黄, 枯萎病快速接种方法的研究. 棉花学报, 2008, 20: 174-178

Peng

, Lü X

, Gao

, Li G

, Li

Study on a new rapid inoculation method for verticillium wilt and Fusarium wilt of cotton.

Cott Sci, 2008, 20: 174-178 (in Chinese with English abstract)

A rapid and effective inoculation method is the basic technique for identifying cotton varieties’ resistance to Verticillium wilt and/or Fusarium wilt and differentiating the pathogenicity of these pathogens. This study was carried out to search a new inoculation method with high efficiency for cotton Verticillium wilt and/or Fusarium wilt. The experiment was developed in the field and the greenhouse whose temperature and light was adjustable. Three non-injured cotton root inoculation methods: the whole stage field disease plot appraisal, dipping cotton seedling roots cultured in liquid with spore suspension, and irrigation cotton seedling roots cultured in soil with spore suspension,were compared for their effectiveness in infection and development of Verticillium wilt and/or Fusarium wilt of cotton. Results showed that, among the three inoculation methods, entire test period with method of field disease plot appraisal needed six months or more, method of irrigation cotton seedling roots cultured in soil with spore suspension needed two months, but dipping cotton seedling roots cultured in liquid with spore suspension (the inoculation concentration was 10 7 conidia·mL -1 ) needed only 30 days. Besides,by the third inoculation method, not only the cotton varieties’ resistance to Verticillium wilt and/or Fusarium wilt, but also the strains’ pathogenicity of Verticillium dahliae and/or Fusarium oxysporum f.sp. Vasinfectum could be appraised. The result was accorded with the field appraisal. Furthermore, for this method need not injure any parts of the plant,so it can make the result more accurate and the plants were suitable for the quite precise research. The different inoculation times（20 min，30 min，40 min，60 min） were also optimized, and the results were showed that the inoculation time lasted for 40 min was the most optimum and got the consistent results with that by field disease plot. Dipping cotton seedling roots cultured in liquid with spore suspension is a rapid, reliable and steady inoculation method for Verticillium wilt and/or Fusarium wilt of cotton. Presently, improvement of this method is tried to use in the screening of cotton mutant for resistance to Verticillium wilt and/or Fusarium wilt and in the testing of function for pathogenicity genes.

1. Department of Plant Protection , Shihezi University , Shihezi 832003, China ;2. Key Oasis Eco-Agriculture Laboratory of Xinjiang , Shihezi University , Shihezi 832003, China

3种不伤根的棉花黄、枯萎病接种方法，即全生育期的田间病圃鉴定法、液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法和土壤种植棉花苗期孢子悬浮液灌根法进行对比，结果表明，液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法（接种浓度为10 7 个分生孢子·mL -1 ）全周期只需要30 d。通过这种方法，不仅可以鉴定出棉花品种对黄、枯萎病菌的抗、感病性，还可以鉴定不同黄、枯萎病菌菌株的致病力。对比不同浸根接种时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）对结果的影响，发现浸根接种40 min可加快发病，鉴定结果和田间病圃鉴定的比较一致。

... 1%氯化汞浸泡15 min消毒, 无菌水冲洗4~5遍, 种植于无菌蛭石, 待棉苗长至3 cm左右移入盛有Hoagland营养液的塑料盒(用带有孔洞的泡沫板漂浮棉苗), 于25℃、光照16 h、黑暗8 h的培养箱中继续培育, 每周换一次培养液^[15] ...

2007

0.0

1.318

胡根海, 喻树迅. 利用改良的CTAB法提取棉花叶片总RNA. 棉花学报, 2007, 19: 69-70

Hu G

, Yu S

Extraction of high-quality total RNA in cotton leaf with improved CTAB method.

Cotton Sci, 2007, 19: 69-70 (in Chinese with English abstract)

由于棉花基因组中含有大量的内含子,直接利用由基因组克隆的基因十分困难,目前国内外主要采用由棉花的cDNA作模板克隆基因并进行遗传转化.得到完整的cDNA必须有高质量的RNA,由于棉花组织中棉酚、多糖的含量较高,因此用通用的提取RNA的方法提取棉花RNA比较困难,国内外的许多学者针对棉花的具体情况已经发展形成几种比较有效的棉花总RNA的提取方法,如:高离子强度、高pH值提取法、热CTAB法、异硫氢酸胍法、Trizol reagent kit法、CTAB/酸酚法、热酚法和热硼酸法等;这些方法都能提出棉花的总RNA,但相比较而言,异硫氢酸胍法和Trizol试剂比较昂贵,高离子强度、高pH值提取法步骤繁琐,本文借鉴热CTAB法并进行了改良,提出一套完整可行的提取棉花叶片总RNA的经济简便的方法.

... 3 RNA提取及cDNA的合成采用改良的CTAB法^[16]提取棉花根部组织RNA, 用ND-100 Nanopo spectrophotometer and Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA样品的质量 ...

2008

0.0

... 对测序结果进行饱和度分析, 随机性分析及在参考基因组上的分布分析, 合格后运用RPKM法(Reads per kb per million reads)计算基因表达量^[17] ...

1997

13.852

0.0

... 基于Audic和Claverie^[18]描述的方法, 对表达谱中每个基因进行显著性分析 ...

2001

3.391

0.0

... 错配率(false discovery rate, FDR)则被用于确定P值的阈值^[19] ...

2011

0.0

... 这一结果与王刚等的研究类似^[20,21,22] ...

2012

0.0

1.087

陈欢, 杨美英, 王真慧, 孙旸, 王刚, 魏玮, 关瑜, 王法微, 李海燕, 陈光. 大豆籽粒不同发育时期基因表达谱分析. 中国油料作物学报, 2012, 34: 129-135

Chen

, Yang M

, Wang Z

, Sun

, Wang

, Wei

, Guan

, Wang F

, Li H

, Chen

Gene expression profile of developing soybean seeds.

Chin J Oil Crop Sci, 2012, 34: 129-135 (in Chinese with English abstract)

以花后15d的大豆籽粒作为对照,通过Solexa高通量测序方法对花后35d、55d和65d的大豆籽粒进行转录水平上的检测,并结合GO功能注释和pathway分析,共有差异表达unigene为9905个,其中调控脂肪酸合成途径的显著差异表达基因12个,蛋氨酸代谢途径关键基因6个.以花后55d的cDNA为样本,荧光定量PCR检测了12个差异表达基因,其结果可与测序结果互为印证.

... 这一结果与王刚等的研究类似^[20,21,22] ...

... 这与陈欢等^[21]关于大豆籽粒不同发育时期表达谱研究的结果类似 ...

2013

2.356

0.0

... 这一结果与王刚等的研究类似^[20,21,22] ...

2011

0.0

0.618

罗红丽, 陈银华. 植物抗病反应相关转录因子的研究进展. 热带生物学报, 2011, 2: 83-88

Luo H

, Chen Y

Advance on transcription factors involved in plant disease resistance response.

Chin J Trop Crops, 2011, 2: 83-88 (in Chinese with English abstract)

概述了植物抗病反应相关转录因子的研究进展,以及转录因子在植物抗病性改良中存在的问题和应用前景.

... 仅从分子功能的转录因子活性类别中就找到了许多目前已证实与抗病相关的bZIP类、WRKY类、AP2/EREBP类、NAC类等以及研究不多的homeodomain和HSF等转录因子调控的基因^[23], 这为后续抗病相关基因的挖掘工作指明方向 ...

... 在植物与病原菌相互作用Pathway中涉及到996个已知功能的差异表达基因, 其中WRKY、bHLH及bZIP三类转录因子家族分别有162、25和22个差异表达基因参与, 而已经证实它们与植物的抗病反应有关, 其可以与相应基因启动子中的顺式作用元件发生DNA-蛋白的特异性互作, 从而激活防卫反应基因的转录表达^[23] ...

2012

2.77

0.0

郭艳玲, 张鹏英, 郭默然, 陈靠山. 次生代谢产物与植物抗病防御反应. 植物生理学报, 2012, 48: 429-434

Guo Y

, Zhang P

, Guo M

, Chen K

Secondary metabolites and plant defence against pathogenic disease.

Plant Physiol J, 2012, 48: 429-434 (in Chinese with English abstract)

次生代谢产物是由植物次生代谢产生的许多结构不同的小分子有机化合物,它们广泛参与植物的生长、发育、防御等生理过程。次生代谢产物在植物的抗病防御反应中发挥着重要作用,可以作为生化壁垒防御病原物侵染,还可以作为信号物质参与植物的抗病反应;在植物与病原物互作中,植物合成新的抗菌物质植保素,原有的抗菌物质也会增加。植物次生代谢产物的积累受到病原物、发育、环境等多种因素的调节。本文重点介绍次生代谢产物在植物抗病防御中的相关作用以及影响其合成的各种因素。

... Pathway中可以找到许多已证实与抗病相关的萜类、黄酮类, 生物碱类等小分子化合物的合成^[24] ...

2009

13.217

0.0

... 此外, 已有研究表明, 植物内源激素在植物受到生物胁迫和非生物胁迫时发挥重要作用, 多种植物激素曾被报道参与调控植物对病原菌的抗性^[25,26], 而环境信息处理中恰好存在植物激素信号转导Pathway (ko04075), 其涉及到的差异表达基因也具有重要的研究意义 ...

2004

9.575

0.0

2011

1.567

0.0

张春宝, 赵丽梅, 赵洪锟, 董英山. 植物蛋白激酶研究进展. 生物技术通报, 2011, (10): 17-23

Zhang C

, Zhao L

, Zhao H

, Dong Y

Advances in plant protein kinase.

Biol Bull, 2011, (10): 17-23 (in Chinese with English abstract)

蛋白激酶是一类磷酸转移酶,其在细胞信号转导过程中起到较为重要作用。目前,在不同植物中分离了各种蛋白激酶基因。相关研究报道表明,这一类蛋白酶基因参与了植物的抗逆性、生长发育以及信号转导等一系列生命活动进程。着重从植物蛋白激酶分类、结构及其功能研究几个方面进行综述。

... 大量研究表明, 蛋白激酶和蛋白磷酸酶对植物-病原菌互作反应起调节作用, 并且与抗病基因也存在联系^[27] ...

1995

0.0

... Song等^[28]曾克隆水稻抗白叶枯病基因Xa21, 其结构与拟南芥中的受体蛋白激酶类似, 属于丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶家族 ...

2003

0.0

0.56

周庆红, 李成琼, 匡全. 植物蛋白激酶研究进展. 生物学杂志, 2003, 20(3): 1-4

Zhou Q

, Li C

, Kuang

Advances in plant protein kinase.

J Biol, 2003, 20(3): 1-4 (in Chinese with English abstract)

近年来,在分子生物学技术不断完善和在酵母与动物蛋白激酶研究的基础上,植物蛋白激酶的研究已取得了很大的进展.就近十年来国内外学者对植物蛋白激酶的发现,家族分类,磷酸化过程及其生理功能等方面的研究进行综述.最后分析了存在的问题并对今后的研究提出了展望.

... 蛋白质序列分析表明在其氨基端含有LRR区(leucine-rich region), 参与蛋白质相互作用, 表明LRR蛋白与蛋白激酶可以在植物抗病信号传递过程中相互作用, 参与植物的抗病反应^[29] ...

2008

0.0

... 实时荧光定量PCR检测Solexa测序后6个基因的相对表达量, 发现二者上调或者下调的趋势是相同的, 但其结果并不完全一致, 主要由2个技术在检测灵敏性上的差异造成^[30], 依然可说明Solexa测序获得的结果具有较高的可靠性 ...