苎麻品种湘苎3号(湘品审第67号)由湖南农业大学郭清泉等选育, 取成熟期的苎麻茎段提取总RNA。SV Total RNA Isolation Kit购自Promega; M-MLV First Strand Kit购自Invitrogen; 3° 和5° -Full RACE Kit、Ex Taq DNA聚合酶、pMD18-T Vector、2× SYBR Premix Ex Taq购自TaKaRa; DNA Marker购自Fermentas; Gel Extraction Kit购自OMEGA; Stratagene Mx3005 System购自Agilent。

按SV Total RNA Isolation试剂盒说明书, 提取苎麻茎段的混合总RNA, 并用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性, 紫外分光光度计检测总RNA的浓度和质量。

按Gel Extraction Kit说明书回收纯化PCR产物; 将PCR产物与pMD18-T载体连接, 转化大肠杆菌DH5α , 以目标引物验证阳性克隆, 送铂尚生物技术有限公司测序, 并比对分析测序结果, 确认含目的基因cDNA序列片段的克隆。

根据湘苎3号转录组测序数据^[18]中2个CCR基因的序列信息, 分别记为CCR1、CCR2, 采用Primer Premier 5.0软件分别设计1对特异引物, CCR1上游引物为5′ -CTGCTGGAGCGATGAATCACTATGC-3′ , CCR1下游引物为5′ -CCAATGAACCCGTGCCACA AAT-3′ , CCR2上游引物为5′ -CCACTGGAGTTGACC GACA-3′ , CCR2下游引物为5′ -CCCTTGAGCGACA GGTTTAT-3′ 。按照反转录试剂盒M-MLV First Strand Kit说明书合成cDNA第1链, 以cDNA为模板进行PCR, 经多因素试验将反应体系和反应程序优化, 反应体系为20 μ L, 包含cDNA 1 μ L、上下游引物(10 μ mol L^-1)各1.04 μ L、10× Ex Taq缓冲液2.0 μ L、dNTP 2.0 μ L、Ex Taq酶0.16 μ L、ddH₂O 12.76 μ L。反应程序为94℃ 5 min, 94℃ 30 s、57℃ 30 s (CCR1 57℃、CCR2 52℃)、72℃ 1 min、30个循环, 72℃ 10 min, 反应终止于4℃。PCR产物经纯化、连接、转化和测序获得目的片段。

在CCR基因核心序列靠近3° 末端和5° 末端位置分别设计3° 和5° -RACE巢式PCR引物, CCR1 3° RACE IN Primer为5° -CTAAGATTTGTGGCACGGGTTCAT TGG-3′ , CCR1 3° RACE OUT Primer为5′ -ATAGAGCA GAGAAGGCAGCGT-3′ , CCR1 5° RACE IN Primer为5′ -CCTGCTCATTGCCTCAAACAC-3′ , CCR1 5° RACE OUT Primer为5′ -TGTGTCGCCCAATGAACCCGTG- 3′ , CCR2 3° RACE IN Primer为5′ -CCGAGGCTTTGA ACATTTTGCGACAG-3′ , CCR2 3° RACE OUT Primer为5′ -GCAACCAACCGTTAATCTCACT-3′ , CCR2 5° RA CE IN Primer为5′ -GCTGTCGCAAAATGTTCAAAG CCTCG-3′ , CCR2 5° RACE OUT Primer为5′ -CCCTTG AGCGACAGGTTTAT-3′ 。然后按照3° 和5° -Full RACE Kit说明书, 将提取的总RNA反转录合成3° 和5° RACE cDNA第1链, 并以这2种cDNA为模板, 分别完成3° 端和5° 端序列的RACE扩增。PCR产物经纯化、连接、转化后测序比对分析获得目的片段。

将RACE测序结果和核心序列用DNAStar软件拼接得到BnCCR基因全长cDNA序列; 然后利用在线分析网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf. html)预测BnCCR基因的开放读码框, 并通过NCBI网站对BnCCR基因核苷酸和氨基酸序列进行Blast比对分析; 最后利用ExPASy Protparam预测与分析BnCCR基因编码蛋白的理化性质、ExPASy SMART预测与分析蛋白功能结构域、Swiss-Model和PyMOL预测与分析蛋白三维结构。

分别取湘苎3号快速生长期、成熟期和成熟后期茎秆木质部与韧皮部的材料, 参照1.2方法提取总RNA, 以苎麻肌动蛋白(Actin 1)基因为内参, 利用Stratagene Mx3005 System进行实时荧光定量PCR (表1), 研究不同时期、不同部位BnCCR基因的表达情况。按照2× SYBR Premix Ex Taq说明书, 反应体系为12.5 μ L, 包含2× SYBR Premix Ex Taq 6.25 μ L、cDNA 1 μ L、上下游引物(10 μ mol L^-1)各0.5 μ L, ddH₂O 4.25 μ L; 反应程序为95℃ 30 s, 95℃ 5 s、55℃ 30 s (CCR1 55℃、CCR2 55.9℃)、40个循环, 每个样品设4个重复, 利用2^{-Δ Δ CT}法计算目的基因的表达量。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时荧光定量PCR检测BnCCR基因表达所用引物 Table 1 List of primers used in BnCCR expression with qPCR 引物名称 Primer name 产物长度 Product (bp) 上游引物 Forward sequence (5° -3° ) 下游引物 Reverse sequence (5° -3° ) CCR1 152 GCTGGAGCGATGAATCACTATG GCAAAACTCAGGGCCGGTA CCR2 142 GACCGACAGGCAGAACTGATTG GCGTCAGAGGTCTCCCGTTTA Actin 1 137 CGTTGAACCCTAAGGC ATCCAGCACGATACCAG

表1 实时荧光定量PCR检测BnCCR基因表达所用引物 Table 1 List of primers used in BnCCR expression with qPCR

从电泳图谱上看到, RNA条带清晰, 可见28S、18S两条带, 且28S条带的亮度是18S的2倍(图1), 表明RNA基本无降解且没有蛋白质的污染。经紫外分光光度计检测表明, RNA浓度为2084 μ g mL^-1, OD_260/280=1.95, 可见RNA提取质量满足分子克隆实验需求。

图1

Fig. 1

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	图1 苎麻茎段总RNA电泳图Fig. 1 Electrophoresis analysis of total RNA of ramie’ s stem

以苎麻cDNA为模板, 经PCR扩增、电泳检测 (图2), 获得CCR1基因核心序列约400 bp, 测序后实际长度为404 bp; CCR2基因核心序列约600 bp, 测序后实际长度为593 bp。

图2

Fig. 2

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	图2 苎麻CCR1基因和CCR2基因核心序列电泳图Fig. 2 Electrophoresis profile of core sequence of CCR1gene and CCR2gene in ramie

CCR1基因3° RACE和5° RACE PCR产物经凝胶电泳检测(图3)长度大约分别为300 bp和700 bp, 测序得到实际片段长度分别为280 bp和687 bp。

图3

Fig. 3

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	图3 苎麻CCR1基因3° RACE和5° RACE电泳图Fig. 3 Electrophoresis profile of 3° RACE and 5° RACE of CCR1 gene in ramie

CCR2基因3° RACE和5° RACE PCR产物经凝胶电泳检测(图4)长度大约分别为450 bp和1000 bp, 测序得到实际片段长度分别为402 bp和914 bp。

图4

Fig. 4

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	图4 苎麻CCR2基因3° RACE和5° RACE电泳图Fig. 4 Electrophoresis profile of 3° RACE and 5° RACE of CCR2 gene in ramie

通过DNAStar软件拼接CCR1基因序列, 得到全长为1057 bp的核苷酸序列, 其中开放阅读框长831 bp, 5° 非翻译区78 bp, 3° 非翻译区144 bp, 其编码的蛋白含277个氨基酸(图5), 命名为BnCCR1 (GenBank登录号为KP001344。将BnCCR1基因序列进行BlastN比对分析, 发现其核苷酸序列与白桦(Betula platyphyllaJF732912)、蓖麻(Ricinus communis XM_002524605)CCR基因核苷酸序列相似性均为70%。将BnCCR1基因编码氨基酸序列进行BlastP比对分析, 发现其氨基酸序列与蓖麻(Ricinus communisXP_002524651)、蒺藜状苜蓿(Medicago truncatula KEH24813)、白桦(Betula platyphyllaAEO45117) CCR基因氨基酸序列相似性分别为77%、75%、74%。

图5

Fig. 5

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	图5 BnCCR1基因cDNA序列及推测的氨基酸序列Fig. 5 cDNA sequence and its putative amino acid sequences of BnCCR1 gene

通过DNAStar软件拼接CCR2基因序列, 得到全长为1291 bp的核苷酸序列, 其中开放阅读框长747 bp, 5° 非翻译区341 bp, 3° 非翻译区203 bp, 其编码的蛋白含248个氨基酸(图6), 命名为BnCCR2 (GenBank登录号为KP001342。BnCCR2基因核苷酸序列的BlastN比对表明, 其与毛果杨(Populus trichocarpaXM002314017)、蓖麻(Ricinus communisXM_002524605) CCR基因核苷酸序列相似性分别为74%、72%。BnCCR2基因编码氨基酸序列的BlastP 比对表明, 其与蓖麻(Ricinus communisXP_002517 775.1)、毛果杨(Populus trichocarpaXP_002314052.1)氨基酸序列相似性均为81%。

图6

Fig. 6

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	图6 BnCCR2基因cDNA序列及推测的氨基酸序列Fig. 6 cDNA sequence and its putative amino acid sequences of BnCCR2 gene

2.4.1 BnCCR1基因编码蛋白理化性质和结构的预测与分析 理化性质分析结果表明, BnCCR1基因所编码蛋白中含量较高的氨基酸有Ala (9.4%)、Val (9.0%)、Glu (9.0%)、Thr (8.3%)、Ser (7.9%)、Arg (6.5%)、Leu (6.5%)、Gly (6.5%); 其中Asp和Glu为碱性氨基酸, Arg和Lys为酸性氨基酸; 该蛋白分子量为30.6667 kD、理论等电点为5.84; 总平均疏水指数为-0.299, 脂肪系数为69.35; 蛋白质不稳定指数为35.30, 这一分类的蛋白稳定。

NCBI中Conserved Domains数据库中分析显示, BnCCR1基因编码蛋白具有其他植物肉桂酰辅酶A还原酶共有的FR-SDR-e [flavonoid reductase (FR), Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR), extended (e), 类黄酮还原酶-短链脱氢酶/还原酶]保守结构域模型, 在相同的蛋白质序列中生成的重叠为SDR superfamily。蛋白功能结构域分析结果表明, 在BnCCR1基因编码蛋白的N端存在一个脱氢酶/差向异构酶/NAD结合蛋白的结构域, 即与3 Beta-HSD/ Epimerase/NAD-binding-10等保守域具有很高的同源性(图7)。

图7

Fig. 7

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	图7 BnCCR1蛋白结构域的预测Fig. 7 Predicted domain sites of BnCCR1

采用Swiss-Model在线软件对BnCCR1基因编码蛋白质的三维结构进行同源建模, 选择矮牵牛^[19]CCR蛋白为建模模板, 并用PyMOL对建模结果进行处理。结果表明, BnCCR1蛋白的三维结构与矮牵牛CCR蛋白相似性约为30.66% (图8)。

图8

Fig. 8

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	图8 BnCCR1蛋白三维结构模型的预测Fig. 8 Three-dimensional structure prediction of BnCCR1 protein

2.4.2 BnCCR2基因编码蛋白理化性质和结构的预测与分析 理化性质分析结果显示, BnCCR2基因所编码蛋白中含量较高的氨基酸有Leu (11.3%)、Val (9.7%)、Ser (8.1%)、Glu (6.9%)、Ile (6.9%)、Gly (6.0%)和Lys (6.0%); 其中Asp和Glu为碱性氨基酸, Arg和Lys为酸性氨基酸; 该蛋白分子量为27.3345 kD、理论等电点为5.64; 总平均疏水指数为0.045, 脂肪系数为104.88; 蛋白质不稳定指数为31.70, 这一分类的蛋白稳定。

NCBI中Conserved Domains数据库中分析显示, 其具有FR-SDR-e的保守结构域模型, 在相同的蛋白质序列中生成的重叠为SDR superfamily。功能结构域的分析结果表明, 在BnCCR2基因编码蛋白的N端存在一个脱氢酶/差向异构酶/NAD结合蛋白的结构域, 即3 Beta-HSD/Epimerase/NAD-binding-4等保守域具有很高的同源性(图9)。

图9

Fig. 9

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	图9 BnCCR2蛋白结构域的预测Fig. 9 Predicted domain sites ofBnCCR2

BnCCR2基因编码蛋白质三维结构的同源建模模板选择矮牵牛^[19]CCR蛋白, 结果表明, BnCCR2蛋白的三维结构与矮牵牛CCR蛋白相似性约为44.77% (图10)。

图10

Fig. 10

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	图10 BnCCR2蛋白三维结构模型的预测Fig. 10 Three-dimensional structure prediction of BnCCR2 protein

BnCCR1基因的扩增曲线趋势正常、基线平整、熔解曲线峰值单一(图11-A); 从不同时期来看, BnCCR1基因在木质部和韧皮部的相对表达量成熟后期较高、快速生长期居中、成熟期较低; 从不同部位来看, BnCCR1基因于快速生长期和成熟后期时在木质部的相对表达量均高于韧皮部, 于成熟期时在韧皮部的相对表达量高于木质部(图12)。

图11

Fig. 11

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	图11 BnCCR1基因和BnCCR2基因表达定量RT-PCR溶解曲线图(Actin1为内标分子)Fig. 11 Melting curve in quantitative RT-PCR of BnCCR1 and BnCCR2(Actin1 is internal reference)

图12

Fig. 12

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	图12 BnCCR基因在苎麻木质部和韧皮部的表达分析Fig. 12 Differential expression of BnCCR1 and BnCCR2 in xylem and phloem of the ramie

BnCCR2基因的扩增曲线趋势正常、基线平整、熔解曲线峰值单一(图11-B); 从不同时期来看, BnCCR2基因在木质部和韧皮部的相对表达量成熟期较高、成熟后期居中、快速生长期较低; 从不同部位来看, 3个时期BnCCR2基因在韧皮部的相对表达量均高于木质部(图12)。

因此可知, BnCCR1基因和BnCCR2基因在木质部与韧皮部中均有表达, 说明两基因均不具有组织表达特异性, 但不同组织中表达量具有差异; BnCCR1和BnCCR2基因在不同时期表达规律不一致, 说明两基因在不同时期具有表达差异, 可能在不同部位的表达时间不同, 其相互关系尚不明确, 正在进一步研究中。