耐盐碱野生大豆(Glycine soja L. G07256)由吉林省农业科学院大豆研究所王跃强研究员提供; 野生型拟南芥(哥伦比亚生态型)及突变体(SALK_031685C)购自Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC, Nottingham, UK)。大肠杆菌DH5α 、根瘤农杆菌GV3101和植物表达载体pCAMBIA3300 35Su均由东北农业大学生命科学学院植物生物工程研究室保存。

利用同源克隆法获得野生大豆GsMIPS2全长cDNA。将饱满的野生大豆种子浸没于98%的浓H₂SO₄中处理10 min以除去泥膜, 用无菌ddH₂O冲洗4~5遍后用1/4 Hoagland培养液进行液体培养, 待幼苗长至3周龄取材, 并于-80℃保存。用RNA提取试剂盒RNAprep Plant Kit (TIANGEN, Beijing, China)提取材料总RNA, 取1.5 μ L总RNA为模板, 以Oligo dT为引物, 采用SuperScript III Reverse Transcriptase Kit (Invitrogen, USA) 合成cDNA第1条链。根据大豆同源基因(Glyma18g 02210.1), 设计GsMIPS2全长基因PCR扩增引物(5° -ATGTTCATC GAGAATTTTAAGGTAGAG-3° 和5° -TCACTTGTAC TCGAGAATCATGTTATTC-3° ), 以野生大豆cDNA为模板, 采用PrimeSTAR HS DNA Polymerase进行PCR扩增。将大小符合要求的电泳条带回收、克隆至pGEM-T载体, 转化大肠杆菌DH5α 后送交测序, 每段序列至少测3个转化子, 分析测序结果以确定GsMIPS2的全长序列。

利用Mega 5.0进行多重序列比对, 并用Neighbor- Joining法构建系统发育树; 利用MEME在线软件(http://meme.nbcr.net/meme/)分析目的蛋白所具有的保守结构域。

将3周龄的野生大豆幼苗, 置含有50 mmol L^-1 NaHCO₃的1/4 Hoagland培养液中, 分别处理0、1、3、6、12和24 h后迅速剪取根尖部分, 于-80℃保存; 按1.2所述方法提取RNA及合成cDNA第1条链。根据SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japan)试剂盒操作说明进行实时荧光定量PCR。采用比较CT法(2^{-Δ Δ Ct})分析结果, 以GAPDH作为内参基因。本试验进行3次独立的生物学重复和3次技术重复, 取3次重复的平均值。原始数据标准化处理的方法参见文献^[13]。

取1/4 Hoagland培养液培养的野生大豆各个时期的组织, 包括种皮、根、幼茎、老茎、上胚轴、下胚轴、叶和花, 参见1.3方法提取RNA, 并进行实时荧光定量PCR分析。

利用不依赖酶切位点的植物超量表达载体pCAMBIA330035Su^[14], 根据GsMIPS2基因序列设计带U碱基的引物(5° -GGCTTAAUATGTTCATCGA GAATTTAAGG-3° 和5° -GGTTTAAUTCACTTGTAC TCGAGAATCATG-3° ), 转化根瘤农杆菌GV3101, 利用农杆菌介导的Floral dip法^[15]对野生型拟南芥进行遗传转化; 通过连续3代的草胺膦筛选(25 μ g L^-1)、PCR检测及半定量RT-PCR检测, 确定超量表达目的基因的转基因纯合体株系。

采用PCR技术鉴定拟南芥T-DNA插入突变体atmips2(SALK_031685C)。使用基因特异性引物FP: 5° -TGATCCCACTTCCTGGTATCTATG-3° 及T-DNA特异性引物LB: 5° -GAGATTAACCTATGGCTCCC CTT-3° 验证T-DNA是否插入到基因中; 使用基因特异性引物FP: 5° -TGATCCCACTTCCTGGTATCTAT G-3° 和RP: 5° -CCGGGTGGAAAGAGTGAAAC-3° , 验证突变体是否为T-DNA插入纯合突变体。

将同一批获得的野生型、转基因纯合体及突变体拟南芥种子用5% NaClO消毒6 min, 其间反复振荡, 用灭菌的ddH₂O清洗6~8次, 放于4℃避光保存3 d用于萌发期表型分析。将春化后的种子同时播种在添加10 mmol L^-1 NaHCO₃(pH 8.5)的1/2 MS固体培养基上, 以播种在不含NaHCO₃的1/2 MS固体培养基的种子作为对照。由于前3 d种子萌发率变化较快, 因此每0.5 d统计一次萌发率, 3 d后每天统计一次萌发率, 共统计5 d, 于播种第3天拍照。试验保证3次技术重复及3次生物学重复。

通过对高通量转录组测序数据的分析, 从肌醇-1-磷酸合酶家族中选取碳酸盐胁迫下显著上调表达的基因GsMIPS2 (图1)。根据与GsMIPS2同源的大豆基因(Glyma18g02210.1)序列, 设计基因特异性引物, 使用高保真酶进行PCR扩增并测序。结果表明3个转化子的测序结果完全一致, 将测序得到的序列进行ORF finder预测, 最终确定GsMIPS2的全长CDS序列, 大小为1533 bp, 编码510个氨基酸, 经ExPASy预测蛋白质的分子量为56 444.52 Da。在NCBI网站上以GsMIPS2蛋白序列为靶序列进行BlastP比对, 下载比对结果中与GsMIPS2相似度较高的蛋白序列, 使用MEGA 5.0进行多重序列比对, 并构建系统发育树。如图2, 来自多个物种的MIPS蛋白都与GsMIPS2蛋白具有极高的相似性, 与双子叶植物和单子叶植物的相似度分别为88%~100%和83%~86%。系统发育树结果表明, 单子叶与双子叶植物的MIPS蛋白位于不同的分支, GsMIPS2蛋白与大豆GmMIPS2蛋白序列完全一致, 相似度为100%。同时, 通过MEME在线软件结构域预测结合相关文献^{[16, 17]}发现, 在所选取的这几个物种的蛋白序列中都含有“ GWGGNNG” , “ LWTANTER” , “ NGSPQNTFVPGL” 和“ SYNHLGNNDG” 这4个保守的结构域(图3), 并含有由1个Rossman折叠(GXGGXXG)和1个酶催化活性区组成的NAD结合位点。在GsMIPS2蛋白中该催化活性区位于第118~510个氨基酸的区域, 其中对MIPS酶结合底物起到关键作用的氨基酸残基已用红色箭头标出。

图1

Fig. 1

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	图1 GsMIPS基因家族碳酸盐胁迫下转录组测序数据Fig. 1 RNA-seq data of GsMIPS gene family under bicarbonate stress

图2

Fig. 2

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	图2 GsMIPS2蛋白与单子叶和双子叶植物MIPS蛋白序列相似度及进化树分析Fig. 2 Similarity and phylogenetic tree analysis of GsMIPS2 with MIPS proteins from monocotyledon and dicotyledon

图3

Fig. 3

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	图3 GsMIPS2蛋白与其他物种MIPS蛋白保守结构域分析Fig. 3 Conserved motifs analysis of GsMIPS2 with MIPS proteins from other species

为研究GsMIPS2在碳酸盐胁迫条件下的表达模式, 采用实时荧光定量PCR分析了GsMIPS2基因在50 mmol L^-1 NaHCO₃胁迫下, 野生大豆根中的表达特性。结果显示(图4), GsMIPS2基因能被碳酸盐胁迫诱导表达, 并呈现先上升后下降的表达趋势。在50 mmol L^-1 NaHCO₃处理后3 h达到最高值, 比0 h增加了约18.8倍, 该结果表明GsMIPS2基因参与碳酸盐胁迫过程, 并且在短期内显著上调表达。该结果与高通量转录组测序数据相一致(图1), 同样能够说明GsMIPS2基因受碳酸盐诱导表达。

图4

Fig. 4

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	图4 GsMIPS2基因碳酸盐胁迫下表达模式分析Fig. 4 Expression pattern analysis of GsMIPS2under bicarbonate stress

同时, 我们研究了GsMIPS2基因在野生大豆组织中的表达特异性, 采用实时荧光定量PCR分析了GsMIPS2基因在野生大豆种皮、根、幼茎、叶、上胚轴、下胚轴、老茎、花等组织的表达特性。如图5所示, GsMIPS2基因的表达量在野生大豆不同组织中存在着明显的差异, 在野生大豆叶片中的表达量最高, 幼茎次之, 而在其他组织中则相对较低, 说明该基因在野生大豆组织中的分布具有特异性。综上所述, 我们推测野生大豆GsMIPS2基因在植物应答碳酸盐胁迫反应中起着重要的作用, 其组织特异性分布表明该基因行使功能的主要部位可能是在植物叶片中。

图5

Fig. 5

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	图5 GsMIPS2基因组织表达特异性分析1: 种皮; 2: 根; 3: 幼茎; 4: 叶; 5: 上胚轴; 6: 下胚轴; 7: 老茎; 8: 花。Fig. 5 Tissue specific expression analysis of GsMIPS21: episperm; 2: root; 3: young stem; 4: leaf; 5: epicotyl; 6: hypocotyl; 7: old stem; 8: flower.

为进一步研究GsMIPS2基因的功能, 采用不依赖酶切位点的USER技术构建GsMIPS2基因植物超量表达载体, 载体图谱如图6-A, 并用Flora dip法对野生型拟南芥进行侵染, 经草铵膦(25 μ g L^-1)筛选得到T₀代抗性植株, 随后进行了连续两代草胺膦筛选及PCR跟踪检测, 对T₂代不发生分离的抗性植株视为超量表达纯合体, 共获得3株纯合体植株(#4、#11和#20), 通过进一步半定量RT-PCR检测, 证明这3株植株均为GsMIPS2基因超量表达纯合体(图6-B)。

图6

Fig. 6

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	图6 GsMIPS2超量表达植株的分子鉴定A: 拟南芥超量表达GsMIPS2基因载体构建图示; B: GsMIPS2基因超量表达拟南芥半定量RT-PCR鉴定。Fig. 6 Characterization of the GsMIPS2 overexpression linesA: schematic representation of the construct for overexpressing GsMIPS2gene in Arabidopsis; B: semi-quantitative RT-PCR identification of GsMIPS2overexpression lines.

同时对拟南芥中肌醇-1-磷酸合酶2基因(AtMIPS2)的突变体atmips2(SALK_031685C)进行了分子鉴定。如图7-A所示, 该突变体插入位点为第4个外显子655 bp处。通过PCR技术, 利用基因特异性引物FP及T-DNA特异性引物LB进行PCR检测, 野生型拟南芥无条带而突变体有条带, 说明T-DNA已经插入到该基因中; 利用基因特异性引物FP和RP进行PCR检测, 野生型拟南芥有条带而突变体无条带, 则说明该突变体为纯合突变体(图7-B), 可应用于下一步表型试验。

图7

Fig. 7

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	图7 拟南芥突变体atmips2的分子鉴定A: 拟南芥突变体atmips2 T-DNA插入位点图示; B: 拟南芥突变体atmips2的PCR鉴定。Fig. 7 Characterization of Arabidopsis atmips2 mutantA: T-DNA insertion site of atmips2; B: PCR identification of atmips2.

将野生型、突变体及2个GsMIPS2基因超表达量相近的拟南芥株系(#11和#20)的种子经表面消毒后, 播于1/2 MS固体培养基或添加10 mmol L^-1 NaHCO₃(pH 8.5)的胁迫培养基上, 每12 h统计一次种子萌发率。如图8和图9-A, 在正常生长条件下转基因、突变体与野生型拟南芥种子的萌发状态及萌发率大致相同, 表明导入的GsMIPS2基因并未对拟南芥的生长、发育造成影响。在10 mmol L^-1 NaHCO₃(pH 8.5)处理下, 转基因、突变体与野生型拟南芥的萌发都受到抑制, 但是与野生型拟南芥相比, 突变体的萌发率受抑制更明显, 而转基因拟南芥2个株系种子的萌发率受NaHCO₃胁迫影响的程度明显低于野生型(图9-B), 以上结果初步说明GsMIPS2基因的超量表达增加了拟南芥的碳酸盐耐性, 而atmips2突变体则使拟南芥对碳酸盐胁迫更加敏感。

图8

Fig. 8

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	图8 碳酸盐胁迫对野生型、突变体和GsMIPS2超量表达拟南芥萌发期的影响Fig. 8 Effect of bicarbonate stress on the germination phenotype of wild type, atmips2, and GsMIPS2 overexpression lines

图9

Fig. 9

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图9 碳酸盐胁迫下野生型、突变体及GsMIPS2超量表达拟南芥萌发率统计(B, C)A: 正常条件下种子萌发率; B: 种子在10 mmol L-1NaHCO3处理下萌发率。试验包括3次技术重复及3次生物学重复, 使用t检验进行差异显著性分析, * 代表P< 0.05。Fig. 9 Germination rate statistics of wild type, atmips2, and GsMIPS2 overexpression lines under bicarbonate stress (B, C)A: seed germination rates of wild type, atmips2 and GsMIPS2 overexpression lines under normal condition; B: seed germination rates of wild type, atmips2 and GsMIPS2 overexpression lines under 10 mmol L-1 NaHCO3treatment. The experiment included three fully independent technical repeats, and three biological repeats. Significant differences analyses were conducted using t-test method and was denoted by one star corresponding to P< 0.05.