2013年10月至2015年3月, 在中国农业科学院茶叶研究所内实验基地种植特早生国家级茶树品种龙井43。于茶树盛花期, 取茶树的根、茎、叶、花等组织。从茶树进入休眠期开始, 根据芽的发育情况, 分别于2013— 2014年11月2日、12月1日、1月2日、2月14日、3月3日、3月14日、3月27日, 2014— 2015年11月4日、12月2日、1月5日、2月5日、3月3日、3月18日、3月23日采摘茶树顶芽, 以液氮速冻所有样品并迅速置-80℃冰箱保存待用。

SMART RACE cDNA Synthesis Kit和Advantage 2 PCR Kit、Universal Primer Mix购于Clontech公司(Mountain View, CA, USA); SYBR Premix Ex Taq (Perfect Real Time)试剂盒、Prime Script Reagent试剂盒、克隆载体PCR2.1 vector、IPTG、X-gal、大肠杆菌DH5α 感受态细胞和rTaq酶均为TaKaRa公司产品(大连); 逆转录酶SuperScript III购自Invitrogen公司(Carlsbad, USA); DNA Marker、琼脂糖凝胶回收试剂盒为购自Axygen公司(California, USA)的AxyPrep DNA Gel Extraction Kit。其余试剂为国产分析纯。由杭州擎科生物技术有限公司合成PCR引物, 由上海华津生物技术有限公司测序。

取0.2~0.5 g不同休眠阶段的茶树样品, 参考Chang等^[17]方法提取茶树总RNA。使用NanoDrop ND100微量核酸蛋白测定仪(Pittsburgh, PA, USA)测定吸光值, 确定RNA浓度, 用1.0%变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量, 最后调整RNA浓度至1 μ g μ L^-1, 于-80℃保存备用。

以1 μ g提取的龙井43顶芽总RNA为模板, 参照SMART RACE cDNA Synthesis Kit操作步骤, 合成5′ 和3′ 的cDNA链, 用于RACE-PCR; 以1 μ g顶芽总RNA为模板, 根据SuperScript III试剂盒的操作说明合成第1链cDNA用于反转录PCR (RT-PCR)来扩增ORF; 用1 μ g不同休眠阶段顶芽提取的总RNA按照Prime Script Reagent试剂盒的操作说明合成cDNA, 稀释10倍后作为模板进行荧光定量PCR (qRT-PCR)检测。

本实验室前期对茶树冷驯化样品做了转录组测序(NCBI登录号为: SRA061042)^[18], 在此基础上筛选出与生长素外运载体PIN高度同源的EST序列, 以DNAStar软件拼接, 获得一条序列。根据序列设计5′ 和3′ 特异引物(表1), 按照SMART-RACE试剂盒的要求进行5′ -和3′ -RACE-PCR反应, 得到该基因的5′ 和3′ 端扩增序列。RACE-PCR条件为94℃、30 s, 68℃、30 s, 72℃、3 min, 30个循环。RACE-PCR产物经AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒纯化回收后, 连接到PCR2.1 vector上, 转化至大肠杆菌DH5α , 蓝白斑筛选挑取白色单菌落鉴定, 对每个连接产物至少挑选3个阳性菌落的菌液送上海华津生物科技有限公司测序。

测序得到的序列去载体、比对拼接, 得到基因的5′ 端和3′ 端序列, 再与原EST序列拼接, 初步得到PIN的cDNA全长序列。在开放阅读框(ORF)上、下游区域设计RT-PCR特异引物(表1), 以PCR扩增得到ORF序列。反应条件为94℃ 4 min, 94℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 2 min, 30个循环; 72℃ 10 min。PCR产物经回收、连接、转化、测序后, 得到茶树完整的PIN全长cDNA序列^[19]。

试验中所用核酸及氨基酸序列均从NCBI网站下载, 利用NCBI的BlastX工具进行同源性比对分析; 利用DNAStar软件进行序列拼接和开放阅读框查询; 利用ClustalW软件进行多序列对齐和排序, 使用GenDOC和MEGA5.0软件输出同源比对和进化树构建结果^[20]; 用SingaIP进行信号肽预测^[21]; 用ProtParam计算蛋白质的相对分子质量和理论等电点^[22]; 利用ProtScale进行蛋白质疏水性分析; 利用SOPMA进行蛋白质的二级结构分析^[23]; DictyOGlyc 1.1 Server预测O-糖基化位点^[24]; NetPhos 2.0 Serve软件预测磷酸化位点, PSORT进行蛋白质的亚细胞定位^[25]; 利用TMHMM预测蛋白质的跨膜结构域并用TMRPres2D软件作图^[26]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 试验引物及其序列 Table 1 Sequence of primers used in this study 引物名称 Primer 上游引物序列 Forward sequence (5′ → 3′ ) 下游引物序列 Reverse sequence (5′ → 3′ ) PIN3 3′ RACE CCAGTGCATCACCCGTGTCGGAAGG TGTCTGTGTCTGTGGCTGTGATGGT PIN3 ATCTCTTGGCACGACCTCTACACCG TGCAGGATGAACATTATATTCTTTGG PIN3 qRT-PCR ACACCCTAAAATGGCCGGAG CATAGCAACATGCCACCTGC PTB TGACCAAGCACACTCCACACTATC TGCCCCCTTATCATCATCCACAA

表1 试验引物及其序列 Table 1 Sequence of primers used in this study

以茶树CsPTB基因作为内参基因^[27], 根据目的基因序列设计荧光定量PCR引物(表1)。以龙井43不同休眠阶段的顶芽总RNA为材料, 按照Prime Script Reagent试剂盒的操作说明合成cDNA, 稀释10倍作为模板。荧光定量反应体系为SYBR Premix Ex Taq 10 μ L, 上、下游引物(10 μ mol L^-1)各0.8 μ L, ROX Dye II 0.4 μ L, cDNA 2 μ L, 加水至终体积20 μ L。反应在ABI PRISM 7500实时定量PCR仪上进行, 95℃变性30 s, 95℃变性5 s, 60℃退火延伸34 s, 40个循环^[27]。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线。每个反应重复3次, 采用2^{-Δ Δ Ct}算法^[28]分析结果。

从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到1条PIN的EST序列, 在NCBI中进行BlastX同源性比对, 结果显示该序列与其他植物中的PIN序列高度相似, 但无完整的开放阅读框。根据此中间序列分别设计RACE特异引物, 分别扩增得到约1.2 kb的3′ 端序列和约1 kb的5′ 端序列(图1), 测序后经BlastX显示两端序列均编码PIN, 然后将两序列片段与原EST序列拼接, 能够查找到编码PIN氨基酸序列的完整开放阅读框(ORF), 在ORF两端设计引物, 进行RT-PCR检测并测序验证, 最后获得了长为2654 bp的cDNA序列, 其5′ 端有114 bp的非编码区(5′ -UTR), 3′ 端有624 bp的非编码区(3′ -UTR), 终止子TGA后具有非常保守的多聚腺苷酸加尾结构。依据上述特征, 判断本研究获得了茶树PIN的完整cDNA全长序列。该序列全长2654 bp, 包含1926 bp的ORF, 编码641个氨基酸。对氨基酸序列分析表明, 其含有PIN3蛋白的2个重要保守域, 即NPNXY内在保守结构域和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点— — TPRXS(N/S)结构域, 由此推测克隆到的基因属于PIN3, 命名为CsPIN3, GenBank登录号为KP896474 (图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 CsPIN3 5′ 和3′ -RACE(左)及RT-PCR(右)电泳结果Fig. 1 Electrophoresis results of 5′ and 3′ fragments (left) and ORF fragment (right) of CsPIN3

图2

Fig. 2

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	图2 茶树生长素外运载体基因CsPIN3全长cDNA的核苷酸序列和推测氨基酸序列Fig. 2 Full length cDNA and putative amino acid sequences of CsPIN3 in tea tree

将茶树CsPIN3序列的全长cDNA在NCBI中进行BlastX同源比对, 结果显示它编码的氨基酸序列与其他物种中报道的生长素外运载体PIN蛋白的相似性均在80%左右, 其中与杨树(Populus trichocarpa, XP002308100.1)的相似性最高, 达85%。与葡萄(Vitis vinifera, XP002284302.1)、柑橘(Citrus sinensis, XP006469168.1)、烟草(Nicotiana tomentosiformis, XP 009601548.1)、番茄(Solanum lycopersicum, NP00123 4184.1)、马铃薯(Solanum tuberosum, XP006344239.1)和芝麻(Sesamum indicum, XP011070630.1)等的相似性分别为82%、82%、82%、81%、81%和80%。

图3

Fig. 3

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	图3 茶树CsPIN3与其他植物PIN氨基酸序列比对Fig. 3 Mutiple aligement of deduced amino acid sequence of CsPIN3 with other plant PIN protein

在NCBI上筛选出与茶树CsPIN3基因氨基酸序列相似性较高的8个不同物种的生长素外运载体PIN蛋白, 并将其与茶树CsPIN3基因预测的氨基酸序列进行多序列比对。结果显示, 茶树CsPIN3与其他PIN氨基酸序列有较高的保守性, 特别是可变结构域、磷酸化位点及糖基化位点等重要功能位点的序列保守型更高。此外, 所有PIN蛋白都存在调控其内吞作用的NPNXY保守内在构型(inner motif, IM)(图3)。在MEGA5.0软件中用邻接相对法绘制CsPIN3与拟南芥及其他物种的18个PIN氨基酸序列之间的进化树(图4), 结果显示茶树的CsPIN3蛋白与茄科植物的亲缘关系最近。此外, 在拟南芥PINs蛋白中, AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近, 处于不同于其他AtPINs的一个大的进化分支上。

图4

Fig. 4

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	图4 CsPIN3与其他植物PIN氨基酸序列的系统进化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of CsPIN3 and PIN in other species

2.3.1 CsPIN3理化性质

经Protparam程序预测, CsPIN3的理论分子量为70.15 kD, 理论等电点(pI)为8.42。含量最丰富的氨基酸有10.3% Ser、9.0% Leu和7.6% Gly。CsPIN3中的酸性氨基酸(Asp + Glu)有44个, 碱性氨基酸(Arg + Lys)有47个; 利用SignaIP- 4.1分析CsPIN3蛋白信号肽和预测信号肽位点表明, 其平均分小于0.500, 利用最大Y值预测表明CsPIN3蛋白不存在信号肽及切割位点, 属于非分泌蛋白(图5); 作为蛋白质折叠的主要驱动力, 蛋白质的亲水、疏水氨基酸的组成能够影响蛋白质的结构和特性, 经在线软件ProtScale采用Hyhob/Kyte & Doolittle的方法分析显示(图6), 最大正值为2.989, 最小负值为-3.100。CsPIN3蛋白是由N端和C端的疏水区和中间第181氨基酸(N端)至第477氨基酸(C端)的亲水区构成; 蛋白质的功能与亚细胞的定位存在着非常密切的联系, 以往的研究表明, 生长素外运载体PIN家族均为膜蛋白, 利用PSORT分析显示CsPIN3蛋白主要位于质膜上, 内质网上也有少量的分布, 属于典型的膜蛋白。

图5

Fig. 5

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	图5 CsPIN3蛋白的信号肽分析Fig. 5 Signal peptide analysis of CsPIN3

图6

Fig. 6

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	图6 CsPIN3亲水性/疏水性预测Fig. 6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of CsPIN3

2.3.2 CsPIN3蛋白的跨膜结构

利用在线软件TMpred预测CsPIN3蛋白跨膜结构(图7), 显示该蛋白在N端和C端疏水区各有一个跨膜结构域, 属于跨膜蛋白。其中N端有5个跨膜螺旋, 分别位于第10~29、第42~61、第71~93、第100~122、第132~154位氨基酸之间; C端有4个跨膜螺旋, 分别位于第526~548、第558~580、第585~607、第617~639位氨基酸之间。这表明CsPIN3蛋白是以膜结合蛋白的形式存在的, 这与其作为转运载体的功能是相适应的。

图7

Fig. 7

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	图7 CsPIN3蛋白跨膜区预测Fig. 7 Prediction model of transmenbrane domain of CsPIN3 protein

2.3.3 CsPIN3蛋白磷酸化和糖基化位点

蛋白质的磷酸化和糖基化是对蛋白质的重要修饰, 可以调节蛋白质的活力和功能。分别运用NetPhos 2.0 Serve、DictyOGlyc 1.1 Server在线软件预测CsPIN3基因翻译后磷酸化、O-糖基化修饰情况, 结果显示CsPIN3蛋白有可能发生磷酸化修饰的位点有35个, 其中色氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能发生磷酸化修饰的位点分别有25、6、4个(图8); 有可能发生O-糖基化修饰的位点有2个, 均为苏氨酸(Thr), 分别在肽链的第220、第281位(图9)。糖基化、磷酸化位点均集中分布在中间亲水区。

图8

Fig. 8

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	图8 CsPIN3蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测Fig. 8 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of CsPIN3 protein

图9

Fig. 9

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	图9 CsPIN3蛋白氨基酸序列翻译后O-糖基化修饰位点预测Fig. 9 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of CsPIN3 protein

2.3.4 CsPIN3蛋白结构

运用SOPAM预测蛋白二级结构显示, CsPIN3蛋白含有23.34%的α -螺旋、15.23%的延伸链和48.52%的随机卷曲。经SMART在线查询后在NCBI上进行保守域分析表明, 茶树CsPIN3蛋白第331~356氨基酸、第431~448氨基酸位之间存在2个可变结构域, 将亲水区分割成3个恒定区。CsPIN3蛋白在第9~636氨基酸位之间是个高度保守的结构功能域— — 生长素外运载体蛋白家族PIN的保守结构域, E值为4.5e-184。此外, 在第495~499氨基酸位置存在CsPIN3蛋白IM保守结构NPNXY, 在第241、第281氨基酸位点还存在着PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点— — TPRXS(N/S)结构域。利用SWISS- MODEL Workspace软件在线预测CsPIN3蛋白的三维结构模型显示(图10), CsPIN3蛋白具有类似运输载体的结构, 充分说明该基因确为茶树生长素外运载体蛋白家族的一员。

图10

Fig. 10

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	图10 CsPIN3蛋白三维结构模型Fig. 10 Tertiary structure homology-modeling of CsPIN3

图11显示, CsPIN3在茶树的根、茎、叶片和花中均有表达, 但表达具有明显的组织差异性; CsPIN3在茶树花中的表达量最高, 在根中的表达量最低, 在茎、叶中的表达量略高于根部, 在花中的表达量是根中的5倍左右。

图11

Fig. 11

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	图11 CsPIN3基因在茶树不同组织中的表达Fig. 11 Expression of CsPIN3 gene in various tea plant organs

利用荧光定量PCR技术分析CsPIN3基因从秋季茶树顶芽开始休眠到春季萌发期间不同时间点的相对表达发现, 该基因在茶树顶芽休眠萌发的不同时期均有表达, 且在萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间)。与休眠初期相比, 随着休眠程度的加深, 该基因的表达量维持在一个较低的水平, 随着芽发育程度即茶树顶芽由生理休眠向生态休眠继而向一芽一叶转变的过程中, CsPIN3基因的表达量持续上调, 到芽叶期表达量为休眠阶段的3倍以上, 且在茶芽萌动过程中表达上调的速度较明显(图12)。说明该基因与茶树越冬芽的休眠维持与解除关系密切。

图12

Fig. 12

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	图12 顶芽不同阶段CsPIN3基因的相对表达量Fig. 12 Relative expression of CsPIN3 gene at different stages of terminal buds