Riggs模式鉴别寄主^[16](Lee、Peking、Pickett、PI88788和PI90763)由河南省农业科学院经济作物研究所大豆课题组保存, 2012年提纯, 2013年在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地扩繁, 同年10月收获的成熟籽粒用于本试验。2012— 2013年于大豆生长期, 在河南、河北、安徽北部、山西、山东、江苏北部的大豆产区调查大豆胞囊线虫分布情况, 在有大豆胞囊线虫感染的地块取土样322份, 每份土样20~30 kg。

将采集到的土样根据土壤粘性不同, 按照病土和无菌细沙以3.0∶ 0.5~1.0的比例均匀混合制备成试验病土, 将子叶出土期(萌发约3~5 d)的Lee幼苗移栽至病土中, 每杯1株(杯子规格为6 cm × 12 cm)。于每年5月中旬至9月中下旬, 在河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地大豆胞囊线虫培养专用塑料大棚里进行试验。培养条件^[17]为自然温度; 每天浇水2次, 浇水前/后土壤含水量4%~7%/ 15%~18%; 自然湿度。约25 d后, 将大豆植株从病土中倒出, 采用淘洗-过筛法从根系中分离胞囊, 用研钵轻轻研磨, 把胞囊破碎, 以看不到白色胞囊为准, 然后将释放出来的卵冲洗入烧杯内, 用清水将虫卵悬浮备用, 取10 µ L, 在显微镜下计数虫卵密度。

将壤土和沙子以2∶ 1混合后在150℃烘干2 h, 装在塑料杯中, 每45杯装在一个67 cm × 45 cm的塑料筐中。将4个鉴别寄主及Lee在蛭石中育苗, 在子叶出土期(萌发3~5 d), 挑选生长一致的幼苗, 移栽到塑料杯中, 每杯1株, 每个鉴别寄主播种9杯。待长出新根(移栽3~5 d)后, 接种制备好的虫卵悬浮液, 约每杯4000个卵。接种后25 d左右、胞囊处于显囊盛期时, 轻轻挤压塑料杯, 待杯子中的土松动之后, 将植株拔出, 计数根部胞囊数目。

利用淘洗-过筛法从根系中分离胞囊, 使其均匀分散到一块黑布上, 用普通数码相机照相, 拍摄从每颗植株上冲洗的胞囊照片。利用本课题自主研发的PDS软件, 通过计算机扫描、分析, 自动计数每张照片上的大豆胞囊数目, 具体方法见专利2014SR060158^[18], 取在各寄主上生长的胞囊平均值, 并根据Riggs模式判别生理小种类型。Lee上平均胞囊数目大于60, 认定此次试验数据有效, 否则, 将通过再次扩繁该土样中的胞囊, 重复接种1次, 如果Lee上平均胞囊数目仍然达不到要求, 舍弃该样本。

用“ 检出频率” 表示该地区某种生理小种样本数占该地区所鉴定出生理小种样本总体的比例。本文定义为, 检出频率 = (属某一种生理小种的样本数目/鉴定出生理小种类型的所有样本数目)× 100%。

将各采样点鉴定出的小种类型, 利用统计分析软件R的Maptools包^[19]绘制生理小种分布图。

在河南、河北、安徽、山西、山东和江苏省采集大豆胞囊线虫感染的322份土样, 大豆胞囊线虫分布情况见图1。含210份因胞囊密度小而未鉴定出生理小种类型的样本和112份鉴定出生理小种类型的样本, 鉴定出的小种类型包括1号、2号、3号、4号、5号、6号和11号, 各小种构成比例见表1。分析有生理小种的112份土样表明, 2号生理小种最多, 检出频率为50.9%; 其次是5号和4号小种, 检出频率分别为23.2%、9.8%。其中, 3号、6号和11号小种是首次在黄淮地区发现。河北、安徽、山东发现的6号小种及在河南、山西发现的11号小种为国内初次报道。

图1

Fig. 1

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	图1 黄淮地区大豆胞囊线虫感染地块及生理小种分布图 N: 未鉴定出结果的样本; R1~R6: 1~6号生理小种; R11: 11号生理小种。Fig. 1 Sampling places infected by SCN and race distribution of SCN in Huang-Huai Rivers Valley N: samples without identification results; R1-R6: race 1-race 6; R11: race 11.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 黄淮地区各个生理小种所占比例 Table 1 Proportion of races in Huang-Huai Rivers Valley 小种类型 Race R1 R2 R3 R4 R5 R6 R11 地点数目 No. of sites 5 57 6 11 26 5 2 比例 Percentage (%) 4.5 50.9 5.4 9.8 23.2 4.5 1.8

表1 黄淮地区各个生理小种所占比例 Table 1 Proportion of races in Huang-Huai Rivers Valley

从图1可以看出, 1号生理小种主要分布在山西南部、山东和江苏北部; 2号和5号生理小种在这6个省份均有分布; 3号生理小种分布在河南、河北、安徽、山西和山东; 4号生理小种主要分布在山西和河北; 6号生理小种主要分布在河北、安徽和山东; 在河南和山西发现有11号生理小种。

2号生理小种在黄淮海大豆主产区均有分布, 集中分布在河北中部、南部, 江苏北部和安徽省北部, 是黄淮海地区的优势小种。

4号生理小种集中分布在山西省中部和北部地区, 占所鉴定出4号生理小种样本的90.9%。在黄淮海其他地区, 仅在河北省邯郸市平乡县鉴定出有4号生理小种。4号生理小种致病力最强, 抗源相对较少, 但是该小种分布集中。在山西省, 2号和4号生理小种检出频率分别是38.5%和38.5%。所以, 在山西省抗病育种应该以兼抗2号和4号生理小种为主要目标。

5号生理小种在黄淮海各省均有分布。在河南省和安徽省分布广泛, 在黄淮海地区, 5号生理小种分布范围仅次于2号生理小种, 是涉及黄淮海地区抗病育种工作的重点小种之一。

其他类型生理小种中, 大豆胞囊线虫1号生理小种主要有3片集中分布区域, 即山西南部的运城市、山东南部的枣庄市和江苏省西北部的徐州市沛县和新沂市, 检出频率为4.5%; 3号生理小种在河南东南部、山西北部及山东、安徽、江苏三省交界处有分布, 检出频率为5.4%; 6号生理小种在河北石家庄市井陉县、河北省保定市涿州市、安徽省毫州市涡阳县、安徽省阜阳市阜南县、山东省泰安市东平县有分布, 检出频率为4.5%; 11号生理小种在河南省永城市和山西省临汾市霍州市有零星分布, 检出频率为1.8%。

由表2可见, 在河北、江苏、安徽、山东、山西和河南, 2号生理小种检出频率分别是68.00%、61.50%、52.40%、45.50%、38.50%和37.50%; 5号生理小种在以上所在省份的检出频率分别是16.00%、23.10%、33.30%、18.18%、7.70%和50.00%。这2个小种所占比例之和, 在河南最高, 达到87.50%; 在最低的山西省, 也达到了46.20%。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 黄淮地区各省大豆胞囊线虫不同生理小种构成 Table 2 Proportions of SCN races in the six provinces of Huang-Huai Rivers Valley 生理小种类型 Race 在该省的检出频率 Percentage of different SCN races in each province (%) 河南 Henan 河北 Hebei 安徽 Anhui 山西 Shanxi 山东 Shandong 江苏 Jiangsu 1 — — — 7.70 9.10 15.40 2 37.50 68.00 52.40 38.50 45.50 61.50 3 6.25 4.00 4.80 3.85 18.18 — 4 — 4.00 — 38.50 — — 5 50.00 16.00 33.30 7.70 18.18 23.10 6 — 8.00 9.50 — 9.10 — 11 6.25 — — 3.85 — —

表2 黄淮地区各省大豆胞囊线虫不同生理小种构成 Table 2 Proportions of SCN races in the six provinces of Huang-Huai Rivers Valley

图2表明, 在安徽阜阳和亳州主要分布5号生理小种, 淮北和宿州一带主要分布有2号生理小种, 部分地区零星分布有3号和6号生理小种; 河北省主要分布有2号生理小种, 部分地区兼有5号生理小种, 零星分布有3号、4号和6号生理小种; 河南省郑州、洛阳、濮阳、安阳一带大豆胞囊线虫生理小种分布较为复杂, 2号和5号生理小种交叉分布, 局部地区零星分布有3号和11号生理小种; 江苏省淮安市、宿迁市一带主要分布有2号生理小种, 在徐州市一带主要分布有5号生理小种, 部分地区兼有1号生理小种; 在山东的菏泽、济宁、枣庄一带主要分布有2号生理小种, 局部地区零星分布有1号、3号、5号和6号小种; 山西吕梁、太原及其以北地区主要分布有4号生理小种, 兼有2号生理小种, 山西临汾、长治及其以南主要分布有2号生理小种, 局部地区零星分布有1号、3号、5号和11号生理小种。

表3表明, 在2001— 2003年调查研究中, 1号生理小种是优势小种, 其次是4号生理小种; 在2012— 2015年调查研究中, 2号生理小种是优势小种, 在黄淮海大豆主产区均有分布, 检出频率是50.9%, 集中分布在河北中部、南部, 江苏北部和安徽北部。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同年份黄淮地区大豆主产省份优势小种构成的比较 Table 3 Composition of predominant races in the main soybean producing area of Huang-Huai Rivers Valley in different years 年份 Year 优势小种 Predominant races 河南 Henan 河北 Hebei 安徽 Anhui 山西 Shanxi 山东 Shandong 江苏 Jiangsu 2001-2003 1, 4 1, 2 4, 5 4 1, 4 1, 5 2012-2015 2, 5 2 2, 5 2, 4 2 2, 5

表3 不同年份黄淮地区大豆主产省份优势小种构成的比较 Table 3 Composition of predominant races in the main soybean producing area of Huang-Huai Rivers Valley in different years

图2

Fig. 2

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	图2 黄淮地区6省份大豆胞囊线虫生理小种构成及主要小种分布区域Fig. 2 Composition and distribution of the main SCN race in six provinces of Huang-Huai Rivers Valley

在对大豆胞囊线虫生理小种类型研究过程中, 前人依据致病力将SCN分为不同类型的生理小种, 目前通用的鉴别方法有Riggs和Schmitt^[16]于1988年建立的16个小种模式以及Niblack等^[20]在2002年建立的“ HG类型” , 利用7个鉴别寄主将大豆胞囊线虫分为128个小种。其目的均是通过鉴别寄主区分致病力不同的线虫群体, 两者的不同之处在于HG模式将小种划分得更细。这两种划分方法各有其适宜的使用范畴, 而从抗病育种目标出发, 我们认为小种不宜划分过细, 加之生理小种存在区域间更替现象, 线虫分布较为复杂, 划分过细很容易给育种带来困惑。为了便于同国内不同研究者的调查结果对比, 本研究仍然选用Riggs鉴别模式^[16]探讨黄淮大豆主产区大豆胞囊线虫生理小种的分布。

在大豆胞囊线虫生理小种鉴定研究中, 无论采用Riggs鉴别模式还是HG模式都需要足够的线虫群体接种于4个或7个鉴别寄主。有研究表明, 接种虫卵数目需限定在一定范围内, 否则鉴定结果不稳定^[17]。因此, 为能繁殖出够量的胞囊, 我们采集土样时要求每个土样取20~30 kg。但由于土样采集困难, 因此国内目前已报道的研究, 多局限于对个别省份或个别地点的土样鉴定。卢为国等^[8]的调查较为系统, 但采样点较为稀疏且没有标识经纬度。本研究是在其基础上, 对黄淮大豆主产区大豆胞囊线虫生理小种分布与地域分布动态做进一步调查研究, 此次共采集病土322份, 其中112份病土鉴定出生理小种类型, 因此, 本次调查的结果比较系统全面地反映黄淮地区大豆胞囊线虫生理小种分布的概况, 而且每份土样均有精确的经纬度记录, 这为今后的进一步研究奠定了基础。从本次调查结果来看, 黄淮地区大豆胞囊线虫发生普遍, 而且小种类型多, 构成复杂。结合前人文献报道, 目前在黄淮地区发现的小种类型有1号、2号、3号、4号、5号、6号、7号、9号、11号、14号等^{[6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15]}, 2号小种为优势小种, 3号、6号和11号小种均是首次在黄淮地区发现。

在调查中, 虽然有322个地点发现胞囊线虫, 但仅有1/3 (112份)鉴定出小种类型。其余210份土样是因为没有繁殖到足够的胞囊而未获得可靠的结果。因此, 可以认为图1中彩色点代表了田间胞囊量比较大的地点, 从侧面反映了黄淮地区田间种群密度的概况。对比采集病土的取样点和鉴定结果(图1)可见, 鉴定出的生理小种集中分布在山西省、河北省和河南黄河沿岸, 这些地区属于沙性土壤, 土质适宜大豆胞囊线虫滋生, 因此鉴定出生理小种的样本较多; 在黄淮区域种植大豆较为集中的安徽阜阳、安徽亳州、河南周口和河南商丘, 采集的病土较为密集, 但由于大豆胞囊线虫种群密度较小, 因此, 鉴定出生理小种的样本较少, 推测其原因, 主要是因为这些地区属于砂姜黑土, 土质黏性较大, 不利于大豆胞囊线虫繁殖、扩散。

在相对较长的时间周期内, 优势生理小种构成是在变化的。从各生理小种在黄淮大豆主产区的分布看, 在2001— 2003年调查研究中, 1号生理小种是优势小种, 检出频率是40.0%, 集中分布在山东济南及以东地区, 河南北部的安阳、滑县、延津以及河北南部的邯郸及河南漯河、周口及安徽阜阳一带^[8]; 在2012— 2015年调查研究中, 2号生理小种是优势小种, 在黄淮海大豆主产区均有分布, 检出频率是50.9%, 集中分布在河北中部、南部, 江苏北部和安徽北部。从黄淮地区大豆主产省份生理小种构成及分布看(表3), 在2001— 2003年调查研究中, 河南、山东的优势小种均是1号和4号小种, 而在2012— 2015年调查研究中, 河南的优势小种变为2号和5号小种, 山东为2号小种; 在先后2次调查研究中, 安徽、江苏的优势小种分别从4号、5号和1号、5号均演变为优势小种为2号和5号小种; 河北的优势小种由1号、2号转变成2号小种; 山西省优势小种由4号演变成2号和4号小种。

在一定时期内, 大豆胞囊线虫生理小种分布是相对稳定的。本研究在2012— 2015年, 选择河南省农业科学院现代农业科技试验示范基地连续4年监测, 鉴定结果均为2号生理小种, 此研究结果与卢为国等^[8]研究结果相同。由于研究条件受限, 卢为国等^[8]在2001— 2003年的调查研究没有标识经纬度, 所以很多地点无法一一对应, 但从2001— 2003年和2012— 2015年这两个阶段的调查研究结果看, 大豆胞囊线虫生理小种在一定时期内是稳定的。

大豆胞囊线虫生理小种变化的可能原因, 首先, 在黄淮海生态区, 大豆的同期作物有玉米、花生和棉花等, 玉米种植面积在2014年比2002年增加313万公顷, 而大豆种植面积同比减少50万公顷(http:// zzys.agri.gov.cn/nongqing.aspx), 这些作物的轮作及种植结构的改变, 对大豆胞囊线虫群体结构有一定的影响; 其次, 农作物育种周期是十年, 在轮回的十年中, 各地抗性育种目标会随着生产中遇到的病虫害危害程度不同, 进行不同程度的调整, 这也给胞囊线虫的生存带来一定的选择压, 对抗性作物敏感的小种逐渐被淘汰, 因此大豆胞囊线虫的群体结构为了适应新的生存环境也不断地在变化。其变化周期和更详尽的原因有待进一步研究, 这也是我们下一阶段研究的重点。

从上述结果看, 黄淮地区大豆胞囊线虫生理小种构成复杂, 而且小种分布区域互相交叉。为进一步探讨不同小种间交叉分布规律, 我们在较小的范围内密集取样, 试图明确各小种的分布边界。从河北石家庄市调查取样的方圆1209 km²看(图3), 在一定的区域内, 小种分布没有绝对界限。我们在鹿泉市李村镇3502农场采集到了2号土样, 在其东南方向的藁城市堤上村和西南方向的井陉县吴家窑乡苗峪均采集到了5号土样, 而在紧临苗峪南部3.28 km但仍属于吴家窑乡的一块大豆田采集到了6号土样; 而从保定市调查取样的方圆5121 km²看, 生理小种分布在一定区域内是相对稳定的, 我们在定州市东亭镇、保定市博野县、保定市高阳县南蒲口乡北蒲村、保定市清苑县孙村乡大候乡、保定市顺平县南清醒村采集到的均是2号土样。以上研究结果表明, 由于大豆胞囊线虫是一种土传的定居性内寄生线虫, 其传播速度及传播范围具有一定的局限性, 因此具有在局部地区优势小种分布相对稳定、部分地区存在其他小种的特点。这与卢为国等^[8]的研究结果一致。

本研究结果表明, 在黄淮地区大豆胞囊线虫分布有一定的区域性。从各省大豆胞囊线虫分布情况看, 在河北省、江苏省主要分布2号小种, 在河南和安徽主要分布2号和5号小种, 山西以2号和4号为主; 山东兼有2号、3号和5号小种。

国家大豆品种区域试验在黄淮地区设3个片区^[6]。黄淮海夏大豆北组包括河北宁晋、河北石家庄、山东德州、山西北部等地, 主要分布有2号生理小种, 其次是4号和5号生理小种; 中组包括山东潍坊、河北邯郸、山西南部、河南濮阳、河南洛阳等地, 主要分布有2号和5号生理小种, 兼1号和6号生理小种; 南组包括江苏北部、安徽北部、河南郑州、河南驻马店、河南周口、山东济宁、山东菏泽等地, 主要分布2号生理小种, 其次是5号生理小种, 兼1号和6号生理小种。整个黄淮地区以抗2号小种为主要育种目标, 北组需要兼抗4号小种, 中组和南组需要兼抗5号小种。

图3

Fig. 3

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	图3 河北省大豆胞囊线虫生理小种分布图 A: 3502农场; B: 堤上村; C: 吴家窑苗峪; D: 吴家窑乡; E: 只里乡; F: 东亭镇; G: 博野县; H: 北蒲村; I: 大侯乡; J: 南清醒村。Fig. 3 Distribution of SCN race in Hebei province A: 3502 farm; B: Dishang; C: Wujiayaomiaoyu; D: Wujiayao; E: Zhili town; F: Dongting; G: Boyie county; H: Beibu; I: Dahou town; J: Nanqingxing.

SCN的抗性是受多个位点控制的数量性状, Rhg位点之间相互作用^{[21, 22, 23, 24, 25, 26]}, 多篇文献报道^{[27, 28]}: 大豆的第18染色体(G连锁群)上的rhg1位点与抗病基因紧密连锁, 控制着对多个大豆胞囊线虫生理小种的抗性, 因此培育多抗品种是可能的。鉴于生理小种的变化, 在抗线虫育种中, 我们更需要培育兼抗2个或2个以上生理小种的大豆品种。