植物表达载体pLGN及根癌农杆菌菌株LBA4404由本实验室保存, 胭脂碱型菌株GV3101由美国康奈尔大学Leon Kochian实验室惠赠。转GhHMGR基因棉花及拟南芥所用的表达载体pBI121- PGhHMGR::GUS均由作者构建。

棉花的遗传转化受体材料冀棉14 (Gossypium hirstutumL.)受赠于河北农业大学马峙英教授; 拟南芥遗传转化受体材料背景为Columbia型, 购于Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)。

参照Luo等^[9]的方法进行棉花的遗传转化; 采用浸花法^[10]进行拟南芥遗传转化。

采用EASY Spin植物RNA快速提取试剂盒提取棉花材料总mRNA, 反转录获得cDNA。以GhHIS为内标基因, 以获得的cDNA为模板进行实时定量PCR, 程序为95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 40个循环; 72℃ 5 min。引物序列为GhHIS-F: 5'-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3', GhHIS-R: 5'-C TACCACTACCATCATGGC-3; GhHMGR-F: 5'-CCTT GGAAACATCCTTGCTAGACC-3', GhHMGR-R: 5'- CTTCCATTGAGGTTGGCACTGTTG-3'。

参照Bradford^[11]、Ge和Wu^[12]的方法提取HMGR及测定含量。

参照Beasley和Ting的方法^{[13, 14]}离体培养棉花胚珠。

参照《现代植物生理学实验指南》^[15]提取及测定可溶性糖。取适量新鲜植物材料(约1.5~3.0 g), 110℃杀青处理15 min, 37℃烘干; 用球磨机将烘干材料磨成细粉, 过筛(80目)后用滤纸包裹置密闭容器中进行水分平衡3~4 d, 转移样品粉末至指形管, 置近红外仪NIRFIex N-500测定总脂质、总蛋白含量。

2.1.1 GhHMGR及其启动子序列的克隆及同源性分析 克隆了棉花GhHMGR基因, ORF长1758 bp, 编码585个氨基酸, 理论分子量为62.7 kD, pI 5.99。用(DNAMAN 6.0.3.99)软件进行序列比对, 发现GhHMGR蛋白与龙眼、荔枝、可可、椴树、毛白杨和拟南芥的HMGR蛋白同源性较高(图1), 与龙眼HMGR相似性100%, 一致性79%; 与荔枝HMGR相似性97%, 一致性77%; 与可可HMGR相似性100%, 一致性89%; 与椴树HMGR相似性为100%, 一致性86%; 与拟南芥HMGR相似性65%, 一致性75%。

图1

Fig. 1

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图1 棉花GhHMGR蛋白与其他物种HMGR蛋白的序列比对 DlHMGR: 龙眼; LcHMGR: 荔枝; TcHMGR: 可可; TmHMGR: 椴树; PtHMGR: 毛白杨; AtHMGR: 拟南芥。Fig. 1 Comparison of cotton GhHMGR and other species HMGR protein DlHMGR: from Dimocarpus longan (GenBank: AET72045.1); LcHMGR: Litchi chinensis (GenBank: ABF56518.2); TcHMGR: Theobroma cacao (GenBank: XP_007043108.1); TmHMGR: Tilia miqueliana (GenBank: AAY68034.1); PtHMGR: Populus trichocarpa (GenBank: XP_002301898.1); AtHMGR: Arabidopsis thaliana (GenBank: AY143930.1).

系统进化树分析发现, 棉花HMGR与龙眼、荔枝、可可、椴树和毛白杨HMGR有较近的亲缘关系, 而与拟南芥HMGR亲缘关系较远(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 GhHMGR蛋白与其他物种HMGR蛋白的系统进化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of GhHMGR protein in different species

根据已公布雷蒙德氏棉基因组序列, 扩增获得了该基因的启动子序列P_GhHMGR。在PlantCARE网站分析发现该启动子不仅包含大量转录起始位点(TATA-box), 转录增强子(CAAT-box), 还含有大量光反应、激素反应、组织特异表达、胁迫反应和转录结合位点等相关顺式作用元件(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 PGhHMGR存在的顺式作用元件 Table 1 cis-acting element of PGhHMGR 功能Function 元件Motif 双链Strand Light responsive element Box I 3 Light responsive element Sp1 1 Part of a light responsive element GA-motif 1 Part of a light responsive element GATA-motif 1 Part of a light responsive element TCT-motif 1 cis-acting element involved in light responsiveness ACE 2 cis-acting regulatory element involved in light responsiveness G-box 1 cis-acting regulatory element involved in light responsiveness G-Box 7 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness ATCT-motif 1 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness Box 4 6 Part of gapA in (gapA-CMA1) involved with light responsiveness ACA-motif 1 Auxin-responsive element TGA-element 1 cis -acting element involved in ABA and VP1 responsiveness CE3 1 cis -acting element involved in salicylic acid responsiveness TCA-element 1 cis -acting element involved in the abscisic acid responsiveness ABRE 3 Elicitor-responsive element EIRE 1 Gibberellin-responsive element GARE-motif 1 cis-acting regulatory element involved in circadian control circadian 2 cis-regulatory element involved in endosperm expression GCN4_motif 1 Element involved in differentiation of the palisade mesophyll cells HD-Zip 1 1 Element involved in the control of leaf morphology development HD-Zip 2 1 Involved in shoot-specific expression and light responsiveness as-2-box 2 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction ARE 1 cis-acting element involved in defense and stress responsiveness TC-rich repeats 1 cis-acting element involved in heat stress responsiveness HSE 1 Ethylene-responsive element ERE 1 MYB binding site involved in drought-inducibility MBS 2

表1 PGhHMGR存在的顺式作用元件 Table 1 cis-acting element of PGhHMGR

2.1.2 GhHMGR在棉花中的表达模式 对野生型棉花中GhHMGR基因的表达分析发现其在棉花的根、胚珠等非光照部位中表达量相对较低, 而叶柄和铃壳等光照部位表达量相对较高(图3)。在胚珠不同发育时期, 其GhHMGR表达量随开花天数的增加而增高, 在10 DPA时达到最高(图4)。纤维中GhHMGR基因表达量总体随着开花天数增加而增高(图5)。对转基因植株暗处理后检测叶片中GhHMGR表达量发现(图6), 随处理时间的延长GhHMGR的表达量急剧下降, 推测光照是GhHMGR表达的必要条件。

图3

Fig. 3

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	图3 棉花不同器官组织GhHMGR的表达水平 R: 根; S: 茎; L: 叶; Pet: 花瓣; Sta: 雄蕊; Sti: 柱头; Car: 果柄; Peti: 叶柄; Sep: 萼片; BS: 铃壳; O: 胚珠。Fig. 3 Relative expression level of GhHMGR in different tissues and organs R: root; S: stem; L: leaf; Pet: petal; Sta: stamens; Sti: stigma; Car: carpopodium; Peti: petiole; Sep: sepal; BS: boll shell; O: ovule.

图4

Fig. 4

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	图4 不同时期胚珠GhHMGR的表达水平Fig. 4 Relative expression level of GhHMGR in developmental ovules

图5

Fig. 5

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	图5 不同时期纤维GhHMGR的表达分析Fig. 5 Relative expression level of GhHMGR in developmental fibers

图6

Fig. 6

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	图6 暗处理不同天数后叶片GhHMGR表达分析Fig. 6 Relative expression level of GhHMGR in leaf under dark

2.1.3 P_GhHMGR::GUS转基因拟南芥组织化学染色分析 以pBI121-P_GhHMGR::GUS表达载体转化拟南芥, T₂代拟南芥纯合子组织化学染色结果显示(图7)该启动子主要在拟南芥莲座叶中央、花序起始部位及角果基部表达, 果柄上部也检测到GUS基因表达信号。

图7

Fig. 7

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	图7 PGhHMGR::GUS在拟南芥T2代组织化学染色 A: 2周大的幼苗; B, D: 花序; C: 角果。Fig. 7 Histochemical analysis of tissues in transgenic Arabidopsis expressing PGhHMGR::GUS A: two-weeks seedling; B, D: inflorescence; C: silique.

将GhHMGR表达载体转入棉花, 筛选获得超量表达与反义抑制的转基因T₀代植株共138株。其中超量表达量上调较显著的6个株系, 即35S-9-1、35S-25-2、35S-25-6、35S-26-1、35S-26-2、35S-8-2;

反义抑制棉花植株中筛选出35S-5-1 (anti)、35S-9-1 (anti)、35S-12-1 (anti) 3个株系(图8)。

图8

Fig. 8

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图8 35S-GhHMGR转基因株系表达量分析 WT: 野生型; 35S-9-1, 35S-25-2, 35S-25-6, 35S-26-1, 35S-26-2, 35S-8-2, 35S-5-1 (anti), 35S-9-1 (anti), 35S-12-1 (anti)是 35S-GhHMGR棉花转基因植株。Fig. 8 Relative expression of 35S-GhHMGRin the ovule of control and transgenic cotton plants expressing GhHMGRgene WT: wild type; 35S-9-1, 35S-25-2, 35S-25-6, 35S-26-1, 35S-26-2, 35S-8-2, 35S-5-1 (anti), 35S-9-1 (anti), 35S-12-1 (anti) are 35S-GhHMGR transgenic cotton plants.

将筛选到的拟南芥hmgr纯合突变体再次种植, 用GhHMGR农杆菌菌液对其花序进行浸染转化, 相较于对照Col-0, hmgr纯合突变体的植株恢复正常, 株高已恢复与Col-0型基本一致, 但长势孱弱, 且莲座叶、花序幼小(图9)。

图9

Fig. 9

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	图9 拟南芥hmgr突变体的恢复 A: col, Columbia型拟南芥; hmgr (HM), 纯合突变体; GhHMGR, 恢复后hmgr突变表型后的植株。B: 花序; C: 莲座叶(标尺为1 cm)。Fig. 9 GhHMGR functionally complemented hmgr mutant A: col, Columbia; hmgr(HM), mutant; GhHMGR, complemented the hmgr dwarf and sterile phenotype. B: inflorescence; C: rosette leaf (bar=1 cm).

图10表明, WT胚珠HMGR含量为2.44 mg g^-1, 超量表达T₀代株系9-1^#、25-2^#、26-1^#、26-2^#胚珠HMGR含量分别为2.54、4.75、3.72、2.64 mg g^-1; 反义抑制T₀代株系9-1^#胚珠HMGR含量为1.95 mg g^-1。相较WT, 超量表达T₀代株系HMGR含量分别增加了4.28%、94.81%、52.82%、8.34%, 反义抑制T₀代株系9-1^#HMGR含量降低19.93%。可知GhHMGR基因调控决定了胚珠HMGR的含量。

图10

Fig. 10

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	图10 转基因株系和野生型株系胚珠(10 DPA) HMGR蛋白含量分析Fig. 10 Analysis of the HMGR content of transgenic and WT cotton ovule (10 DPA)

取转基因棉花开花当天的胚珠离体培养, 其培养基中分别加入10、20、50、100和200 μ mol L^-1的洛伐他汀, 32℃, 黑暗条件下培养10 d。结果显示, 20 μ mol L^-1及其以上浓度洛伐他汀条件下胚珠发育畸形, 纤维无法正常起始, 且其GhHMGR基因表达量随抑制剂浓度的增加呈上升趋势(图11), 推测原因是胚珠早期发育阶段, 抑制剂与HMGR的作用底物竞争性结合, 故棉花胚珠通过表达产生更多的HMGR来消除抑制剂带来的影响。

图11

Fig. 11

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	图11 胚珠离体培养及表达量分析 WT株系胚珠施加0、10、20、50、100和200 μ mol L-1不同浓度抑制剂处理10 d的GhHMGR基因相对表达量分析。Fig. 11 Ovule culturein vitroand relative expression level of GhHMGR The ovules of WT cotton cultured for 10 days in BT medium supplemented with 10, 20, 50, 100, and 200 μ mol L-1 Lovastatin and the relative expression of GhHMGR inovule with different treatment.

另外发现未添加抑制剂时, 超量表达转基因植株GhHMGR表达量是WT的8倍(图12), 且长势较WT好, 推测棉花胚珠通过超量表达GhHMGR基因来生成大量类异戊二烯物质, 满足胚珠早期发育需求, 从而使转基因棉花胚珠出现优势表型; 添加20 μ mol L^-1和50 μ mol L^-1抑制剂时, 超量表达GhHMGR基因的胚珠及纤维受到不同程度抑制而畸形(图12), GhHMGR基因的表达水平与上述的结果一致。

图12

Fig. 12

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	图12 胚珠离体培养(A)及表达量分析(B) WT及GhHMGR超量表达株系胚珠添加 0、20、50 μ mol L-1抑制剂处理及相对表达量分析。Fig. 12 Ovule culture in virto (A) and relative expression level (B) The ovules of GhHMGR transgenic and WT cotton cultured for 10 days in BT medium supplemented with 0, 20, and 50 μ mol L-1 Lovastatin.

表2表明, 相较WT, T₀代超量表达株系26-1^#、8-2^#可溶性总糖浓度分别下降了57.33%、60.99%, T₀代反义抑制株系5-1^#可溶性总糖浓度增加了48.3%; T₀代超量表达株系26-1^#、8-2^#总脂质含量分别升高了19.94%、28.09%, 而T₀代反义抑制株系则降低了4.52%; T₀代超量表达株系26-1^#、8-2^#总蛋白含量分别升高24.23%、32.25%, T₀代反义抑制株系则降低了6.31%。由此发现, GhHMGR促使可溶性糖转化为脂质及蛋白质。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 转基因株系和野生型(WT)株系胚珠(10 DPA)内三类物质含量 Table 2 Contents of total sugar, oil, and protein of ovule (10 DPA) in transgenic and wild-type (WT) lines (mg g-1) 株系Line 可溶性总糖Total sugar 总脂质Total oil 总蛋白Total protein WT 252.68± 11.99 10.18± 0.15 14.90± 0.65 35S-26-1 107.83± 5.96 12.21± 0.17 18.51± 0.72 35S-8-2 98.59± 2.87 13.04± 0.23 19.69± 1.86 35S-5-1(anti) 374.73± 7.01 9.72± 0.24 13.96± 0.58

表2 转基因株系和野生型(WT)株系胚珠(10 DPA)内三类物质含量 Table 2 Contents of total sugar, oil, and protein of ovule (10 DPA) in transgenic and wild-type (WT) lines (mg g-1)

序列比对分析显示, GhHMGR与龙眼、荔枝、可可、椴树、毛白杨、拟南芥等物种的HMGR蛋白具有较高的同源性。Xia等^[16]发现荔枝LcHMGR通过调控早期细胞分裂和后期细胞分化对果实最终大小起决定性的作用, 快速生长的植物组织中, HMGR活性总是很高, 而成熟组织中的活性则相对较低。我们推测GhHMGR也应具有相似的功能。GhHMGR启动子顺式作用元件分析发现序列中存在大量的光反应元件, 且在棉花中的表达分析也发现光照是GhHMGR基因发挥其功能的必要条件。

研究发现拟南芥AtHMGR突变后会使拟南芥植株矮小, 出现早衰、雄性不育等性状^[17]。我们用GhHMGR超量表达转化拟南芥hmgr突变体植株, 研究发现超量表达GhHMGR可恢复拟南芥hmgr突变体株高, 但植株长势依旧孱弱、叶片、花序幼小。说明棉花GhHMGR与AtHMGR生物学功能互补, 具有决定株高以及育性的功能, 但无法完全恢复突变体的所有性状。

3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)是MVA途径中目前研究较多的一限速酶, 调控下游异戊二烯类化合物的生物合成及其分配流向。本文选取CaMV35S组成型启动子驱动GhHMGR基因在棉花植株中表达分析发现, 相较WT, 超量表达株系胚珠内的HMGR含量升高, 反义抑制株系胚珠内的HMGR含量降低。推测GhHMGR基因正调控HMGR的合成代谢, 但仍需进一步的研究来证明。

洛伐他汀可抑制甲羟戊酸途径关键酶HMGR的活性^[18], 胚珠离体培养结果发现, 超量表达株系胚珠及纤维发育较WT好, 且其胚珠对抑制剂也更敏感, 胚珠在20 μ mol L^-1以上洛伐他汀处理时出现畸形, 纤维发育不良。由此可见HMGR在棉花胚珠及纤维发育过程中不可或缺。但洛伐他汀抑制剂如何通过抑制HMGR来促使转基因胚珠的优势表达的作用机制仍不清楚, 仍需进一步的研究。

胚珠(10 DPA)三类物质的含量测定结果表明: 相较WT, 超量表达株系可溶性总糖含量降低, 总脂质和蛋白含量升高; 而抑制株系则相反。结合以上结果推测, GhHMGR可以促进糖类物质转化为脂质或蛋白, 从而影响胚珠生长发育及种子的最终形成。与前人关于改变HMGR能够限制葡萄糖或丙酮酸在MVA途径中的代谢^[19]这一研究结果相一致。但GhHMGR如何调控其下游代谢产物的产率及物质相互间的分配转变比例还不清楚, 需进一步研究。