以对褐飞虱敏感的品种9311为母本, 以WD15515为父本, 通过杂交和自交得到了F₂群体, 选取其中的100株进行抗性鉴定和分子标记分析。与此同时, 以F₁与9311回交得到BC₁F₁群体, 用于F₂群体QTL定位结果的验证。于2006年在武汉田间采集褐飞虱, 在TN1稻株上饲养繁殖。

通过测定褐飞虱在稻株上的表现值, 评价抗虫性。于塑料桶中种植供试水稻的亲本、F₂及BC₁F₁, 生长至40 d左右进行抗虫性评价。收集新近羽化的褐飞虱短翅雌虫, 制作30 mm × 30 mm蜡袋并放入雌虫1头, 然后将蜡袋绑定至水稻茎秆上, 由褐飞虱取食水稻(图1), 48 h后, 终止取食, 取下蜡袋。在褐飞虱取食前和取食后, 在十万分之一精度天平上分别称取蜡袋重量和虫体重量。取食前后蜡袋的重量差即为褐飞虱蜜露分泌量, 取食前后虫体重量之差即为虫体增重量, 用虫体增重量除以取食前虫体重量即为虫体增重比。每个单株上的放虫实验重复3次以上, 确保取得精确、可重复的结果。以蜜露分泌量、虫体增重量和虫体增重比的多重复平均值来评价每个水稻植株的抗虫性水平。

图1

Fig. 1

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	图1 水稻抗褐飞虱性能鉴定示意图Fig. 1 Schematic diagram showing BPH-resistance evaluation

以CTAB法制备水稻DNA。取新鲜水稻叶片200~300 mg至2 mL离心管, 于植物组织研磨仪中破碎, 加入800 μ L CTAB提取液, 于65℃水浴30 min, 每5 min摇匀一次; 加入800 μ L氯仿, 12 000× g离心10 min; 转移上清液至另一1.5 mL离心管, 加600 μ L异丙醇, 12 000× g离心10 min; 弃上清液, 加800 μ L 70%的乙醇, 12 000× g离心5 min; 弃70%乙醇, 于真空干燥机中烘干; 加100~200 μ L 0.1× TE, 溶解后于4℃保存备用。

根据GRAMENE网站(http://www.gramene.org/ markers/index.html)公布的水稻SSR引物信息, 合成引物。10 μ L的PCR反应体系含ddH₂O 5.8 μ L、10× buffer 1.0 μ L、dNTP (10 mmol L^-1) 0.8 μ L、PrimerF 0.15 μ L、PrimerR 0.15 μ L、TaqDNA聚合酶(5 U μ L^-1) 0.1 μ L、DNA 2 μ L。在ABI PCR仪中进行扩增反应, 95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 32个循环, 72℃延伸8 min。扩增反应完成后加入6× lodding buffer 4 μ L备用。PCR产物以8%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。利用荧光灯箱分析DNA条带, 选取在亲本间有明显多态性的标记用于F₂群体的分析。

选择覆盖水稻全基因组的1000对SSR引物检测WD15515与9311之间的多态性。再利用筛到的多态引物检测WD15515/9311 F₂群体中各单株的基因型, 按照QTL IciMapping软件的要求, 将与WD15515相同的带型记为“ 2” , 与9311相同的带型记为“ 0” , 与F₁杂种带型相同的记为“ 1” , 其他或缺失带型记为“ -1” 。

使用QTL IciMapping 3.0分析QTL^{[11, 12]}, 使用Map功能构建遗传图谱, 先用“ Group” 命令进行连锁分群, 再用“ Ordering” 命令确定各连锁群中各标记的最佳顺序, 最后以“ Rippling” 命令确定各标记在染色体上的排列顺序及间距。将LOD值定为3.0, 作图时以Kosambi函数将重组率转换为遗传距离^[13]。随后使用bip功能, 以LOD值2.5为阈值, 进行QTL扫描, 遵循McCouch等^[14]原则命名QTL。

利用覆盖水稻基因组的1000对SSR引物检测亲本WD15515与9311间的多态性, 共筛选到多态性引物320对。选取其中带型清晰、差异明显、均匀分布在12条染色体上的135对引物进行分子标记连锁图谱的构建。

以100个F₂个体构建了包含135个SSR标记的遗传连锁图谱(图2)。该图覆盖水稻基因组的1194.35 cM, 每2个标记间平均距离为9.71 cM, 标记的顺序与已发表的连锁图谱基本一致^[15]。

图2

Fig. 2

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	图2 利用9311/WD15515 F2群体构建的水稻分子标记连锁图谱Fig. 2 Molecular linkage map constructed by SSR markers based on 9311/WD15515 F2 population

在抗褐飞虱亲本WD15515植株上取食48 h后, 褐飞虱单头雌虫的蜜露分泌量为1.87 mg, 虫体增重量为-0.04 mg, 表明在抗虫植株上褐飞虱的取食受到严重抑制, 生长发育受阻。在感虫亲本9311植株上, 褐飞虱单头雌虫的蜜露分泌量达到4.94 mg, 体重增加1.88 mg, 虫体增重比为0.86, 表明褐飞虱的取食和生长发育均正常。在F₂群体中单株的抗虫性变异较广, 蜜露分泌量最小值为0.03 mg, 最大值为13.78 mg, 平均值为2.97 mg; F₂群体虫体增重量最小值为-0.43 mg, 最大值为2.60 mg, 平均值为0.71 mg; 虫体增重比最小值为-0.17, 最大值为1.15, 平均值为0.32 (表1)。3种表型值在F₂群体中表现为连续分布(图3), 提示在抗性材料WD15515中可能存在多个抗性位点。相关性分析发现, 蜜露分泌量、虫体增重和虫体增重比在0.01水平上显著相关(表2)。用QTL扫描分析结果中LOD值最高的分子标记RM16996分析F₂群体各单株的基因型, F₂群体的基因型和表型频率分布如图3, 从图中可知, 基因型为纯合和杂合WD15515的单株表现出较低的蜜露分泌量, 较低的增重量和增重比, 并且增重量和增重比出现了负增长的情况。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 亲本及F2群体的性状表现 Table 1 Performance of observed traits in the parents and F2 population 性状 Trait 亲本 Parent F2群体 F2population WD15515 9311 平均值± 标准差 Mean ± SD 偏度 Skewness 峰度 Kurtosis 变幅 Range 蜜露分泌量Honeydew weight (mg) 1.87 4.94 2.97± 2.97 1.30 1.25 0.03 to 13.78 虫体增重Weight increment of BPH (mg) -0.04 1.88 0.71± 0.79 0.49 -0.66 -0.43 to 2.60 虫体增重比 BPH weight increased ratio -0.13 0.86 0.32± 0.35 0.46 -0.74 -0.17 to 1.15

表1 亲本及F2群体的性状表现 Table 1 Performance of observed traits in the parents and F2 population

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 3种抗褐飞虱表型之间的相关系数 Table 2 Correlation coefficient between observed traits in the F2 population 蜜露分泌量 Honeydew weight 虫体增重量 Weight increment of BPH 虫体增重比 BPH weight increased ratio 蜜露分泌量 Honeydew weight 1 0.966* * 0.965* * 虫体增重 Weight increment of BPH 0.966* * 1 0.999* * 虫体增重比 BPH weight increased ratio 0.965* * 0.999* * 1 * * 表示在0.01水平(双侧)上显著相关。* * Significant at the 0.01 level (bilateral).

表2 3种抗褐飞虱表型之间的相关系数 Table 2 Correlation coefficient between observed traits in the F2 population

基于F₂群体基因型和3种表型值结果, 应用QTL IciMapping 3.0软件进行完备区间作图分析, 共检测到4个QTL (图4), 分别位于水稻第2、第4、第9染色体上, 其中在第2染色体上以蜜露分泌量为指标检测到抗性位点qBph2-1, 位于分子标记RM71-RM6911之间, LOD值为3.68, 表型贡献率为11.08%。以虫体增重量和增重比为指标检测到位于RM6911-RM521之间的抗性位点qBph2-2, 其LOD值分别为3.31、4.05, 表型贡献率分别为7.81%、9.38%。以蜜露分泌量、虫体增重量和增重比在第4染色体上检测到QTL qBph4位于分子标记RM16996-RM17075之间, LOD值分别为11.11、13.81、15.41, 表型贡献率分别达到44.38%、45.24%、52.40%。表明qBph4是一个对褐飞虱取食和生长均有显著效应的主效位点。以蜜露分泌量、虫体增重和增重比为指标在第9染色体分子标记RM219~ RM6444之间检测到qBph9, 其LOD值分别为2.59、4.04、3.63, 表型贡献率分别为10.91%、12.39%、10.01% (表3)。4个QTL来源于WD15515的等位基因均能增强对褐飞虱的抗性。

图3

Fig. 3

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	图3 9311/WD15515 F2群体的RM16996基因型和抗虫性表型频率分布图Fig. 3 Frequency distributions of BPH-resistance phenotypes and genotypes in F2population derived from the cross of 9311/WD15515

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 水稻9311/WD15515 F2群体中抗褐飞虱QTL检测结果 Table 3 Brown planthopper resistance QTLs detected in 9311/WD15515 F2 population QTL 性状 Trait 染色体 Chromosome 区间 Interval LOD值 LOD score 贡献率 PVE (%) 加性效应 ADD 显性效应 DOM Left marker Right marker qBph2-1 HW 2 RM71 RM6911 3.68 11.08 -0.85 -1.12 qBph2-2 WB 2 RM6911 RM521 3.31 7.81 -0.25 -0.12 WRB 4.05 9.38 -0.13 -0.05 qBph4 HW 4 RM16996 RM17075 11.11 44.38 -2.43 -1.45 WB 13.81 45.24 -0.72 0.01 WRB 15.41 52.40 -0.33 -0.18 qBph9 HW 9 RM219 RM6444 2.59 10.91 -0.55 1.54 WB 4.04 12.39 -0.05 0.50 WRB 3.63 10.01 -0.03 0.20 HW: honeydew weight; WB: weight of BPH; WRB: weight ratio of BPH. HW: 蜜露分泌量; WB: 虫体增重; WRB: 虫体增重比。

表3 水稻9311/WD15515 F2群体中抗褐飞虱QTL检测结果 Table 3 Brown planthopper resistance QTLs detected in 9311/WD15515 F2 population

为了进一步验证主效抗性位点qBph4, 构建了9311/WD15515//9311 BC₁F₁群体, 该群体共有94个单株。测定了在BC₁F₁各植株上褐飞虱的蜜露分泌量、虫体增重量和增重比值3种表型值, 用标记RM16996对群体各单株进行基因型检测, 得到BC₁F₁群体的基因型和表型频率分布图(图5)。结果表明, qBph4位于RM16996-RM17075之间, 这一结果和F₂群体得到的结论一致。含有WD15515基因来源的杂合基因型单株表现出较低的蜜露分泌量, 较低的增重量和增重比, 证明该抗性位点在杂合情况下也有较好的抗性水平。

图4

Fig. 4

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	图4 水稻抗褐飞虱QTL在染色体上的分布Fig. 4 Distribution of the rice brown planthopper resistance QTLs on chromosome

图5

Fig. 5

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	图5 WD15515/9311//9311 BC1F1群体中抗褐飞虱表型和RM16996基因型频率分布图Fig. 5 Frequency distributions of BPH-resistance phenotypes and genotypes of RM16996 in the BC1F1 population derived from the cross of WD15515/9311//9311