选用3个青稞品种, 其中来自青海省的昆仑12用于基因克隆和基因功能验证, 该品种由北青1号(母本)和昆仑1号(父本)通过有性杂交选育而成, 中抗条纹病和散黑穗病, 较抗倒伏, 抗落粒性强, 具较强的耐旱、耐寒性; 来自四川省的旱地紫具有较强的抗旱性和耐冷性, 来自甘肃省的大麻, 其抗旱和耐冷性较弱, 这两个品种用于基因功能验证。2013年春, 将3个品种同时种植于青海省农林科学院试验田(青海西宁), 2013年秋收获种子进行室内试验。

1.2.1 引物设计

根据GenBank (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/nuccore/U63993.1)公布的大麦blt4.9基因序列设计引物P1 (F: 5′ -CGGGATCCCGAACCCA ATGGACGCAATAC-3′ ; R: 5′ -CGAGCTCGACTCAT AGGTCCCCTCAAAG-3′ ), 由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.2.2 blt4.9基因的克隆与测序

将青稞种子置于铺3层湿润滤纸的培养皿中, 在人工气候箱中培养, 温度为(25± 1)℃, 光照强度为433 μ mol m^-2 s^-1, 每天光照14 h, 其间每天向滤纸加数滴蒸馏水, 浸透滤纸并稍有剩余, 以避免干旱。待幼苗长至约10 cm高时(约2周), 以4℃低温处理12 h, 取其叶片提取植物总RNA, 经PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)试剂盒反转录后用于目标基因的扩增模板。PCR体系为20 μ L, 包括10× buffer 2.0 μ L, 25 mmol L^-1 Mg²⁺ 1.5 μ L, cDNA模板1 μ g, 10 mmol L^-1 dNTP 0.5 μ L, Taq DNA聚合酶1 U, 10 μ mol L^-1上、下游P1引物各0.5 μ L。反应参数为94℃ 5 min; 94℃ 1 min, 56℃ 1 min, 72℃ 1 min 40 s, 35个循环; 72℃ 延伸8 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测, 并回收、纯化目的片段, 与pMD20-T载体连接, 连接体系含pMD20-T Vector 1 μ L, Insert DNA 0.1~0.3 pmol, 加ddH₂O至5 μ L; 再加5 μ L (等量)的Solution I; 16℃反应30 min。将连接好的重组DNA全量(10 μ L)加至100 μ L Top10感受态细胞中, 冰浴30 min, 42℃热激45 s, 再在冰上放置1 min; 加入800 μ L LB液体培养基(无抗生素)。混匀, 37℃、150转 min^-1摇床振荡1 h; 取200 μ L菌液铺于含Amp (50 μ g μ L^-1)的LB固体培养基上, 37℃平放20 min, 后倒置培养12~14 h。挑取阳性克隆于含有Amp的LB液体培养基上, 37℃、250转min^-1摇床振荡8~10 h, 用TIANpure Midi Plasmid Kit试剂盒(天根)提取质粒DNA, 分别通过PCR检测和BamH І 、SacІ 酶切鉴定, 并将5个克隆送至生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.3 青稞blt4.9基因分析及结构特性预测

采用ExPasy网站的在线工具ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)计算克隆基因编码蛋白质的等电点和分子量, 预测蛋白的性质和结构; 通过蛋白质预测服务器(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi- bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)分析蛋白质二级结构, 通过DNAstar7.1软件的Protean模块, 分别应用Garnier-Robson、Deleage- Roux、Hydropathy-Kyte-Doolittle、Karplus-Schulz、Emini计算氨基酸残基的特定结构域、蛋白质的二级结构、蛋白质的疏水区和亲水区、蛋白质骨架区的柔韧性以及蛋白质表面的可能性。

1.3.1 胁迫处理

按前述方法在人工气候箱中培养青稞幼苗, 待幼苗长至约10 cm高时(约2周)分别进行干旱(PEG-6000)、低温(4℃)和ABA处理, 胁迫处理期间, 每天向滤纸加相应溶液数滴, 以浸透滤纸并稍有剩余为标准, 尽量减少水势变动。PEG- 6000 (0、5%、10%、15%、20%、25%、30%)和ABA (0、5、10、50、100、200、500 μ mol L^-1)处理1 d后, 低温处理0、12、24、48 h后, 分别提取叶片总RNA, 用PrimeScriptRT Master Mix (TaKaRa)试剂盒反转录合成cDNA, 用于检测blt4.9基因的表达量。

1.3.2 引物设计

根据测得的blt4.9序列, 在开放阅读框(ORF)内设计荧光定量PCR引物P2 (F: 5′ - AAACCGCCTGTGACCT-3′ ; R: 5′ -CACGCCGCTTG CTTGT-3′ ), 利用稳定表达的18SrRNA作为内参基因, 其引物(P3)序列为F: 5′ -AAACCGCCTGTGA CCT-3′ ; R: 5′ -GCTGGAATTACCGCGGCT-3′ 。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.3.3 Real-time PCR反应程序

采用Bio-Rad公司iQ5荧光定量PCR仪, 按照生工生物(上海)有限公司的荧光试剂盒Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent Kits (SYBR Green I)分别建立目的基因和内参基因的反应体系, 其组成为cDNA 42.5 ng, 10 μ m L^-1P2/P3上下游引物各0.5 μ L, Hotstart Fluo-PCR mix 12.5 μ L, 加ddH₂O至25 μ L。反应参数为, 95℃ 3 min; 95℃ 10 s, 61℃ 30 s, 95℃ 1 min, 61℃ 1 min, 40个循环。

1.3.4 基因表达分析

采用2^{-Δ Δ Ct}法计算基因相对表达量^[13], 干旱和低温胁迫以旱地紫无胁迫处理的表达量为1; ABA胁迫以0 μ mol L^-1 ABA处理昆仑12的表达量为1。用Stst2与SPSS13.0进行方差分析和多重比较。用Origin 8.0制作柱状图。

用设计的特异引物扩增得到一条约800 bp的特异性片段, 与预期结果相符。将该条带纯化后与pMD20-T克隆载体连接, 并转入大肠杆菌, 在含有Amp的LB培养基上通过蓝白斑筛选得到阳性克隆。分别对阳性克隆进行PCR和酶切鉴定, 随机选取5个经鉴定为阳性的克隆进行测序。

测序结果表明, blt4.9基因全长为720 bp, 其ORF为348 bp, 编码115个氨基酸(图1)。氨基酸组分分析结果显示, blt4.9富含Ala (23.48%)、Ser (11.3%)、Val (8.7%)、Gly (8.7%)、Cys (6.96%)、Ile (6.09 %)和Lys (6.09 %), 不含Trp、Glu和Phe。这与已报道的其他冷诱导基因编码蛋白氨基酸组成^{[14, 15]}相似。

图1

Fig. 1

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	图1 青稞品种昆仑12中blt4.9基因的序列Fig. 1 Sequence of blt4.9 gene from hulless barley variety Kunlun 12

Blast分析结果表明, 青稞blt4.9基因编码的氨基酸序列与几个大麦blt基因编码产物的同源性很高(图2-A), 均在96%以上, 尤其与大麦blt4.9编码蛋白的同源性最高, 达98.3%; 其次是与硬粒小麦、黑麦(blt4.9)和普通小麦blt4编码蛋白的同源性, 分别为81%、77%和72%; 与粳稻blt4.9编码蛋白的同源性最低, 仅为62%。通过DNAStar得到分离自不同物种blt4.9基因的系统进化树(图2-B)显示了与Blast比对一致的结果, 其原因可能是青稞与大麦同属大麦属, 而且blt家族的基因都报道是低温反应相关的基因。

图2

Fig. 2

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	图2 不同物种blt4基因编码氨基酸序列的同源性比较(A)和系统进化树分析(B)Fig. 2 Analysis of amino acid sequences (A) and phylogenetic tree (B) ofblt4 genes from different species

利用DNAStar7.1软件中的Protean模块计算得知, blt4.9是编码115个氨基酸的小分子蛋白质, 分子量为11.2 kD, 等电点为9.04, 是一个碱性蛋白, 其分子量介于9.9~11.9 kU之间, 推测属于LTP I家族^[16]。利用软件预测blt4.9编码蛋白的性质和结构, 表明该蛋白的不稳定系数为28.41, 说明这是一个稳定的蛋白质; 脂肪系数为92.78, 总平均亲水性为0.597。且蛋白二级结构主要由α -螺旋(48.70%)、β -折叠(7.83%)和无规则卷曲(43.48%)构成(图3); 绝大多数结构位于疏水区, 没有形成较大的亲水区(图4)。

图3

Fig. 3

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	图3 SOPMA软件预测blt4.9的二级结构 卷曲、螺旋、延伸链分别用粉、蓝和红线条表示。Fig. 3 Secondary structure of theblt4.9analyzed by SOPMA Curly, helix and extension chain are indicated with pink, blue, and red lines, respectively.

图4

Fig. 4

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	图4 blt4.9编码蛋白质二级结构、疏水性以及抗原分析Fig. 4 Secondary structure, hydrophilicity, and antigenic analysis of blt4.9

2.3.1 blt4.9在干旱和低温胁迫下的表达

以PEG-6000模拟干旱胁迫24 h, 当PEG-6000浓度在5%~15%时, blt4.9表达量虽有提高, 但增加幅度不明显; 随着干旱胁迫程度的增加, 当PEG-6000浓度为20%时基因表达量显著增加(P< 0.05); 当25% PEG-6000处理时, 基因表达量达到峰值, 约为对照的53.04倍(旱地紫)和24.18倍(大麻); 当PEG-6000浓度为30%时, 表达量仍显著高于对照。并且在模拟干旱胁迫下, blt4.9基因在抗旱性强的品种(旱地紫)中的表达量显著高于在抗旱性弱的品种(大麻)中(图5-A)。

图5

Fig. 5

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	图5 blt4.9基因在模拟干旱胁迫下(A)和低温下(B)的表达Fig. 5 Expressions of blt4.9 gene under drought (A) and low temperature (B) stresses

4℃低温胁迫0~48 h, 旱地紫和大麻两品种的blt4.9基因表达量都随胁迫时间的延长而显著增加, 并且在耐冷性较强的旱地紫中表达量高于在耐冷性较弱的大麻中(图5-B)(P< 0.05)。

2.3.2 blt4.9在ABA胁迫下的表达 0~500 μ mol L^-1 ABA胁迫处理下, 随着外源ABA浓度的增加, blt4.9基因表达量呈先增加后降低的趋势, 50 μ mol L^-1 ABA处理的表达量最高, 为对照的8.96倍(P< 0.05); 100~500 μ mol L^-1 ABA胁迫下, blt4.9基因表达量均低于对照, 但与对照差异不显著(图6)。

图6

Fig. 6

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	图6 blt4.9基因在ABA胁迫下的表达Fig. 6 Expression level of blt4.9 gene under ABA stress