在西北农林科技大学西乡茶叶试验站种质资源圃的湄潭苔茶后代(编号51)中有1株紫色芽叶茶树, 其他均为绿色芽叶。紫色芽叶茶树编号为51-2, 另选1株正常绿色芽叶茶树作为对照, 其编号为51-1。以此2株茶树作为试验材料, 分别在春季摘取芽下第一叶、第二叶和第三叶, 立即投入液氮冷冻, 再放入-80℃冰箱保存备用。

采用手持柯尼卡美能达CR400色彩色差计, 将测试头对准茶树叶片中间部位, 按下测试键, 读取并记录L、a、b色差值。依次测量芽下第一叶、第二叶和第三叶的色差值, 每个叶位测量20片, 重复3次。

参照TaKaRa RNAiso Plus Total RNA提取试剂盒说明书提取叶片总RNA, 对总RNA进行浓度、完整性等质量检验后, 调整浓度至1 µ g µ L^-1, -80℃保存备用。采用TaKaRa Prime Script RT Reagent Kit合成cDNA第一链。

根据NCBI中登录的基因序列, 设计定量PCR引物(表1)。荧光定量在iQ5实时定量PCR仪中进行, 以茶树β -actin基因为内参, 反应体系含2.0 µ L浓度为50 ng µ L^-1的cDNA、0.8 µ L上下游引物(引物浓度为10 µ mol L^-1), 7.4 µ L ddH₂O和10 µ L SYBR Premix Ex Taq II。

反应程序为95℃预变性2 min, 95℃变性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 循环40次, 每个样品3个重复。反应结束后分析荧光值变化曲线和熔解曲线, 采用2^{-Δ Δ CT}法^[17]分析。

称取0.1 g样品, 在液氮中研磨成粉末, 加入1 mL甲醇, 振荡提取20 min, 在4℃条件下10 800× g离心10 min, 取上清液, 再用0.2 µ m滤膜过滤上清液, 用液相色谱分析儿茶素类组成及含量。色谱条件^[18]: A相是2%乙酸, B相是乙腈, 流速1 mL min^-1, 柱温30℃, 检测波长280 nm, 进样量10 µ L; 梯度洗脱, B相在16 min内由6.5%线性上升到25%, 25 min时再回到6.5%。

参照文献[19]分析花青素总量。称取1.0 g液氮磨碎样, 加入50 mL MeOH/HCl (99∶ 1, v/v)提取液, 以900转 min^-1的速度在室温下磁力搅拌4 h, 过滤后减压旋转蒸发至干。再用5 mL的蒸馏水溶解即得花青素提取液。分别吸取200 µ L花青素提取液, 依次加1.8 mL pH 1.0的0.025 mol L^-1 KCl缓冲液和pH 4.5 mol L^-1的0.4 mol L^-1乙酸钠配制成2份比色液, 分别于520 nm和700 nm测定吸光值, 以cyanidin-3- glucoside作为标品绘制标准曲线。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR 基因 Gene 登录号 Accession No. 上游引物 Forward primer (5° -3° ) 下游引物 Reverse primer (5° -3° ) 产物长度 Product length (bp) PAL D26596 TCCAATTCCTTGCCAATCC AACTGCCTCGGCTGTCTTTC 106 CHS AY169403 ACAAAGGCAATCAAAGAATGG ATGGGCGAAGACCGAGTAG 124 CHI DQ904329 TGAGACTGAACCCAAGACCG TAGATTTTGATGCCGATGCC 114 F3H AY641730 TACCATCACCCTGCTCCTCC CATTCTTGAACCTCCCATTGC 153 F3’ H KT180309 TCGACCAGAACGATTCCTACC ACTGGACCATACGCAACCCTA 134 F3’ 5’ H DQ194358 TCTCAATCTTCCCAGAGTCGC CAGTCTTCGCATTCTTTCCAC 173 DFR AB018685 ATTCCCACCAAGCCTAATCAC CCTGAGGACGCTCATACAAGA 137 ANS AY830416 TTCAAGGGTATGGGAGCAAA TGCAGGAATGTAGTCGGTTG 139 LAR GU992401 AACTCACCCTAGTCCATGCCA CACCCTCCTCTTTTCGTTGTA 134 ANR1 GU992402 CATAGCCGGTTGTGACCTTG TGACACGTTTAACCGTTCCTG 147 ANR2 GU992400 CGAGACCCAGGCAATCAGA ACCAGGTCACAACCCGCTA 131 β -actin HQ420251.1 GCCATCTTTG ATTGGAATGG GGTGCCACAACCTTGATCTT 175

表1 实时定量PCR引物 Table 1 Primers for real-time PCR

含量(μ g g^-1) = (A× K× DF)/FW, 其中A = (A_{520 nm}- A_{700 nm})_{pH 1.0}-(A_{520 nm}-A_{700 nm})_{pH 4.5}; K为由标准曲线求得的常数; DF为稀释倍数; FW为样品鲜重(g)。

采用IBM SPSS 19.0软件分析试验数据。

在亨特表色系统中, L表示亮度, a和b表示色调和度。a为正值时, 表示红的程度, 正值越大颜色越红; a为负值表示绿的程度, 其绝对值越大色泽越绿。b为正值时, 表示黄的程度, 正值越大颜色越黄; b为负值表示蓝的程度, 其绝对值越大色泽越蓝。经多重比较发现, 两株茶树相同叶位的叶片色泽上存在显著差异(表2)。对于51-2来说, 其不同叶位的叶片色泽上也存在显著差异, 51-2第一叶的a值为正值, 且最高, 表明51-2芽下第一叶叶色最红, 芽下第二叶(51-2第二叶)其次, 但芽下第三叶(51-2第三叶)的a值为负值, 说明叶色已属于绿色范围。结合图1发现, 51-2的芽下第三叶中间部分为绿色, 叶缘泛红。色差分析表明, 试验所用的材料色泽差异明显。

根据2-苯基苯并吡喃B环上羟基的数量, 茶叶中的儿茶素类可分为B环二羟基儿茶素(B-3’ , 4’ - catechins)和B环三羟基儿茶素(B-3’ , 4’ , 5’ -catechins)。前者包括儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)和儿茶素没食子酸酯(CG); 后者主要有表没食子儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和没食子儿茶素没食子酸酯(GCG)。2-苯基苯并吡喃B环3’ 和5’ 位的羟基化分别由F3’ H和F3’ 5’ H催化。由图2可以看出, 绿色芽叶植株的B环三羟基儿茶素和总儿茶素含量呈现芽下第二叶> 芽下第一叶> 芽下第三叶; B环二羟基儿茶素含量呈现芽下第一叶> 芽下第二叶> 芽下第三叶。紫色芽叶植株的B环二羟基儿茶素、B环三羟基儿茶素和总儿茶含量呈现芽下第一叶> 芽下第二叶> 芽下第三叶。不过, 紫色芽叶植株的各叶位叶片的B环三羟基儿茶素和总儿茶素均低于绿色芽叶植株。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 紫色芽叶与对照色泽 Table 2 Values of L, a, and b for purple leaves and control 样品 Sample L a b 绿色芽叶(对照) Green leaf (control) (51-1) 第一叶 1st leaf 45.72± 0.24 e -14.99± 0.37 b 28.11± 0.44 e 第二叶 2nd leaf 46.62± 0.09 e -15.66± 0.24 a 28.85± 0.49 f 第三叶 3rd leaf 42.42± 0.40 d -14.97± 0.54 b 23.92± 0.63 d 紫色芽叶 Purple leaf (51-2) 第一叶 1st leaf 30.30± 0.38 a 4.71± 0.33 e 3.91± 0.29 a 第二叶 2nd leaf 33.71± 0.26 b 2.47± 0.09 d 10.44± 0.28 b 第三叶 3rd leaf 34.92± 0.36 c -5.64± 0.24 c 15.15± 0.31 c The lightness, L, represents the darkest black at L = 0 and the brightest white at L = 100. The red/green opponent colors are represented along the aaxis, with green at negative avalues and red at positive avalues. The yellow/blue opponent colors are represented along the b axis, with blue at negative b values and yellow at positive b values. Duncan’ s multiple range test (P< 0.05, n= 20). L表示明暗度, L = 0时表示黑色, L = 0时表示白色; a表示红绿, a为正值表示红色, a为负值表示绿色; b表示黄蓝, b为正值表示黄色, b为负值表示蓝色。采用Duncan’ s 多重比较方法分析(P< 0.05, n= 20)。

表2 紫色芽叶与对照色泽 Table 2 Values of L, a, and b for purple leaves and control

图1

Fig. 1

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	图1 紫色芽叶与绿色芽叶(对照)植株 51-1: 绿色芽叶(对照); 51-2: 紫色芽叶。Fig. 1 Tea plant with purple leaf and green leaf (control) 51-1: green leaf (control); 51-2: purple leaf.

花青素含量以紫色芽叶植株的芽下第一叶最高, 达到866.08 µ g g^-1(鲜重), 芽下第二叶为183.46 µ g g^-1 (鲜重), 芽下第三叶为103.76 µ g g^-1 (鲜重), 分别是绿色植株相应叶位叶片的27.00、28.39和7.49倍(图3)。

图2

Fig. 2

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	图2 紫色芽叶中儿茶素类化合物含量 A: B环二羟基儿茶素; B: B环三羟基儿茶素; C: 总儿茶素。51-1: 绿色芽叶(对照); 51-2: 紫色芽叶。采用Duncan’ s 多重比较方法分析(P< 0.05, n= 3)。Fig. 2 Content of catechins in tea plant with purple leaf A: B-3’ 4’ -catechin; B: B-3’ 4’ 5’ -catechin; C: total catechins. 51-1: green leaf (control); 51-2: purple leaf. Duncan’ s multiple range test (P< 0.05, n= 3).

图3

Fig. 3

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	图3 紫色芽叶中花青素含量 51-1: 绿色芽叶(对照); 51-2: 紫色芽叶。采用Duncan’ s多重比较方法分析(P< 0.05, n= 3)。Fig. 3 Content of anthocyanins in tea plant with purple leaf 51-1: green leaf (control); 51-2: purple leaf. Duncan’ s multiple range test (P< 0.05, n= 3).

从图4可以看出, 紫色芽叶中PAL (苯丙氨酸解氨酶)、CHS (查耳酮合成酶)、CHI (查耳酮异构酶)、F3H (黄烷酮3’ -羟化酶)、DFR (二氢黄酮醇4’ -还原酶)、ANS (花青素合成酶)、ANR1 (花青素还原酶1)、ANR2 (花青素还原酶2)、F3’ H (类黄酮3’ -羟化酶)和F3’ 5’ H (类黄酮3’ , 5’ -羟化酶)的表达量显著高于对照相应叶位叶片, 尤其在芽下第一叶中。其中F3’ H和F3’ 5’ H上调幅度最大, 它们的表达量分别是对照芽下第一叶的9.16~30.43倍和10.69~31.82倍。此外, 上调幅度较大的还有ANS和ANR2。这与紫色芽叶植株的各叶位叶片中B环三羟基儿茶素和总儿茶素含量都低于绿色芽叶植株(图2)的结果不一致。在绿色芽叶植株(51-1)中, 除LAR (无色花色素还原酶)和F3’ H外, 其他基因的表达量都呈现芽下第二叶> 芽下第一叶> 芽下第三叶; 但在紫色芽叶植株(51-2)中, 除LAR外, 其他基因的表达量都呈现芽下第一叶> 芽下第二叶> 芽下第三叶。这与图2中紫色芽叶植株的B环二羟基儿茶素、B环三羟基儿茶素和总儿茶素含量变化趋势相吻合。LAR在紫色芽叶中上调不明显, 仅在芽下第二叶和第三叶中比对照略有上调。

图4

Fig. 4

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	图4 紫色芽叶中类黄酮生物合成相关基因相对表达量 51-1: 对照; 51-2: 紫色芽叶。采用Duncan’ s 多重比较方法分析(P< 0.05, n= 3)。Fig. 4 Expression levels of related genes involved in flavonoids biosynthesis in tea plant with purple leaf 51-1: control; 51-2: purple leaf. Duncan’ s multiple range test (P< 0.05, n= 3).

如表3所示, 紫芽茶树中, 无论是总儿茶素还是花青素, 同各相关基因(LAR除外)表达水平的相关性都较高, 且二者相关系数差异不大。而绿色茶树中, 则是总儿茶素与各基因(LAR、F3’ H除外)表达的相关系数, 明显高于花青素同各基因表达的相关系数。这说明紫色芽叶植株中类黄酮生物合成的代谢流朝向儿茶素类和花青素合成2个方向; 绿色芽叶植株中类黄酮生物合成的代谢流主要朝向儿茶素类物质合成。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 总儿茶素、花青素与相关基因表达量相关性分析 Table 3 Pearson’ s correlation analysis between total catechins (or anthocyanins) and expression levels of related genes 相关系数Correlation coefficient PAL CHS CHI F3H DFR ANS ANR1 ANR2 F3’ H F3’ 5’ H LAR 51-2 TC 0.84 0.99* 0.98* 0.99* 0.99* 0.99* 0.99* 0.90 0.85 0.94 -0.50 Antho 1.00* 0.89 0.92* 0.90 0.72 0.90 0.72 0.99* 1.00* 0.96* 0.09 51-1 TC 0.77 0.71 0.74 0.65 0.69 0.71 0.70 0.65 0.76 0.64 0.55 Antho 0.37 0.29 0.33 0.21 0.26 0.29 0.27 0.20 0.98* 0.20 0.88 51-1: green leaf (control); 51-2: purple leaf; TC: total catechins; Antho: anthocyanins. * Significant correlation (P< 0.01). 51-1: 绿色芽叶(对照); 51-2: 紫色芽叶。* 显著相关性(P< 0.01)。

表3 总儿茶素、花青素与相关基因表达量相关性分析 Table 3 Pearson’ s correlation analysis between total catechins (or anthocyanins) and expression levels of related genes