黄绿叶突变体萌发至三叶期前期为白化表型, 三叶期后期开始转为黄绿苗, 突变体生长较野生型缓慢且矮化, 分蘖数减少, 只有2~4个, 整个生命周期延长近60 d。

分别取突变体和野生型材料的分蘖期叶片, 测定其叶绿素含量, 重复3次, 取平均值。测定方法参照文献[16], 并略加修改。

取分蘖期的野生型及突变体叶片, 用4%戊二醛(以pH 7.2的磷酸缓冲溶液配置) 4℃过夜固定, 磷酸缓冲溶液冲洗3次, 1%锇酸固定1 h, 磷酸缓冲溶液冲洗3次, 用30%、50%、70%、80%、95%、100%的乙醇和丙酮逐级脱水5 min, 最后用树脂包埋, 切片后用醋酸铀染色, 透射电镜下观察。

选取6株黄绿叶突变单株, 与籼稻品种黄华占杂交, 获得F₁种子。播种F₁后, 自交繁殖获得F₂种子, 分株系种植F₂群体, 作为定位群体。

采用SDS法^[17]分别提取24株黄绿植株叶片总DNA, 用于基因初步定位。根据初步定位结果, 采用快速打叶法^[18]对定位群体植株进行两侧标记检测, 并利用内部In/Del引物进一步精细定位。

用于基因定位的In/Del分子标记, 一部分为本实验室已有的, 另一部分为根据已公布的水稻品种93-11和日本晴全基因组序列自行开发。这些标记均匀分布于水稻12条染色体上, 共147对。

取分蘖期的叶片提取RNA, 并反转录cDNA, 由于叶绿体Rubisco基因表达受到影响, 因此利用β -Actin (Os03g0718100)作为内参基因, 以64对引物检测野生型与突变体中叶绿体基因组基因的表达量。β -Actin引物序列为, F: 5′ -CACATTCCAGCAGAT GTGGA-3; R: 5′ -ACCACAGGTAGCAATAGGTA-3′ 。根据Bio-Rad公司的《荧光定量PCR应用指南》数据处理, 通过计算2^{-Δ Δ CT}值来确定每个基因在野生型和突变体的相对表达量。

正常的自然条件下, 黄绿叶突变体种子萌发后子叶为白色, 从真叶长出至三叶期叶片完全为白色, 从三叶期后突变体逐渐转为黄绿色(图1)。

图1

Fig. 1

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	图1 野生型(左)和突变体(右)表型 A, C: 苗期; B, D: 分蘖期。Fig. 1 Phenotypes of wild type (left) and ygl8951 mutant (right) A, C: seedling stage; B, D: tillering stage.

黄绿叶突变体的叶绿素a/b几乎不变, 但叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量下降明显, 表明突变体的叶绿素合成受到明显抑制(表1)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 野生型和ygl8951突变体中色素含量 Table 1 Photosynthetic pigments contents in wild type (WT) and ygl8951 mutant 材料 Material 叶绿素a含量 Chlorophyll a content (mg g-1) 叶绿素b含量 Chlorophyll b content (mg g-1) 类胡萝卜素含量 Carotenoids content (mg g-1) 叶绿素a/b Chlorophyll a/b WT ygl8951 3.83± 0.27 1.22± 0.10 * * 1.3± 0.12 0.4± 0.03 * * 0.78± 0.03 0.33± 0.02 * * 2.97± 0.07 3.03± 0.04 * * P< 0.01

表1 野生型和ygl8951突变体中色素含量 Table 1 Photosynthetic pigments contents in wild type (WT) and ygl8951 mutant

利用透射电镜(TEM)观察发现, 野生型材料细胞中叶绿体含量丰富, 基粒结构清晰, 而突变体叶绿体中没有清晰的基粒类囊体, 仅有类似间质类囊体结构(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 野生型(A, C)和ygl8951突变体(B, D)分蘖期的超微结构 1: 叶绿体; 2: 类囊体; 3: 类似间质类囊体。Fig. 2 Transmission electron microscopy observation of wild type (A, C) and ygl8951 mutant (B, D) on tillering 1: chloroplast; 2: thylakoid; 3: stroma thylakoids-like.

通过定量结果可以看出, 该叶色突变对叶绿体基因的影响是全面的, 并且上调基因明显多过下调基因, 共有30个基因明显上调(上调倍数> 2), 上调基因主要为核糖体结构基因(chl44, chl63, chl42, chl43, chl45)和RNA聚合酶亚基基因(chl10, chl09, chl08); 表达量明显降低的基因多为光系统基因(chl06, chl16, chl01, chl05)以及Rubisco大亚基基因(chl23)(图3)。

图3

Fig. 3

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	图3 部分叶绿体编码基因在野生型和ygl8951突变体的表达比较Fig. 3 Expression analysis of some chloroplast-encoded genes in wild type and ygl8951 mutant

突变材料M₁中, 野生型植株与黄绿突变植株分别为38株和11株, 符合3∶ 1的分离关系(χ ²_c= 0.06 < χ ²_0.05= 3.84; P > 0.05)。单株收获M₁叶色正常的植株种子, 种植M₂代, 约有1/3的植株后代全部叶色正常, 不再分离, 其余2/3的植株后代又表现出大致3∶ 1的分离比。选取6株黄绿叶单株与籼稻亲本黄华占杂交, F₁种子自交获得F₂群体, 分别统计正常植株与黄绿苗数目, 正常植株与黄绿突变植株分别为334株和102株, 分离比例符合3∶ 1 (χ ²_c= 0.517 < χ ²_0.05=3.84; P > 0.05), 因此确定该突变为单基因隐性遗传。

选取在两亲本间有多态性的In/Del标记, 共有147对, 均匀分布于水稻12条染色体上。用24株黄绿苗, 将黄绿基因初步定位在第6染色体的短臂上, 分子标记In/Del 606949与In/Del 607611之间, 物理距离约为662 kb。

为了进一步缩小定位区间, 选取F₂群体中1121株黄绿植株和2380株正常表型植株做精细定位群体。根据公布的粳稻日本晴与籼稻93-11序列, 在In/Del标记606949与607611之间, 找到了8对在2个亲本有差异的新标记(表2), 并最终将黄绿叶基因ygl8951定位在In/Del标记607420与607611之间, 物理距离约为191 kb (图4)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 用于精细定位的新In/Del标记 Table 2 New In/Del markers for mapping 标记 Marker 正向引物 Forward primer (5′ -3′ ) 反向引物 Reverse primer (5′ -3′ ) 607075 TGAGGATGGTTTTGGATGGG CAATAGGGCAAACCTCAAC 607212 GAGTGAGCACTTACATTCGGT ATCCTCCCTACACAAGGAGT 607420 GTCATTGCCAGGTAGATC CTTCGGGACCAAATACAC 607489 AAATGTCCATGTGTTTGCTTC CATGTGTGGAATGTGGTTG 607511 GTACCATCATTCTCCTACTCAC TTCTACCTGAACCTGGAGTTC 607551 AAACGAGATCAGCCACGGAC CTAGTGGAAGAGGTGGCTAC 607611 TATGGTAGGTGGGACCAAG ACATCAACCACTTGCCACC 606949 ACATGTCATGATGCCACGTCA GTGCTCCCTAATAGGAGAAAG

表2 用于精细定位的新In/Del标记 Table 2 New In/Del markers for mapping

图4

Fig. 4

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	图4 ygl8951 在水稻第6染色体的定位Fig. 4 Location of ygl8951 on rice chromosome 6