将野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)的生态型Columbia (Col)用于表型筛选, 生态型Landsberg erecta (Ler)用于图位克隆。拟南芥突变体lcf3-1是EMS (甲基磺酸乙酯)诱变Col野生型得到的低叶绿素荧光突变体。

拟南芥种子用0.01%升汞悬浮浸泡5 min, 无菌水漂洗5次后, 播种于含0.6%琼脂的MS培养基上。4℃春化2~4 d后放入培养间, 待种子萌发, 生长10 d左右移至土中继续生长。生长条件为22℃ (昼)/18℃ (夜), 光周期为16 h (光)/8 h (暗), 光强为120~130 μ mol m^-2 s^-1。

以突变体lcf3-1为母本、野生型Ler为父本, 杂交得到F₁代, F₁自交获得F₂代。观察F₂代表型, 并统计植株表型的分离比。

以野生型Col基因组DNA为模板, 以LCF31F: 5'-GGGGGATCCTCTCAGAATGCAGAATATCAGA-3'和LCF31R: 5'-CCCAAGCTTCCATGTTAACTATAT GTGTATTC-3'为引物扩增LCF3基因构建回补载体LCF3::pCAMBIA1300-COM; 以LCF32F: 5'-GGGAA GCTTCAGATATAGTTCACAGCAACAT-3'和LCF32R: 5'-CCCGGATCCGCGGAGGCAGTAAAGCTAGCC-3'为引物构建pLCF3::pCAMBIA1391-GUS载体; 以野生型Col的cDNA为模板, 分别以LCF33F: 5'-GGGG GTACCATGGCTAGCTTTACTGCCTCCG-3'和LCF3 3R: 5'-GGGGGATCCGAGTGAAAGACCAGATTCT TC-3'及LCF34F: 5'-GGGAAGCTTATGGCTAGCTTT ACTGCCTCCG-3'和LCF34R: 5'-GGGGGTACCGA GTGAAAGACCAGATTCTTC-3'为引物构建带GFP标签的永久表达载体LCF3::super1300⁺-GFP和瞬时表达载体LCF3::pHBT-GFP。将以上获得的重组载体分别以农杆菌介导^[18]或者PEG介导^[19]的方法转入突变体lcf3-1或野生型拟南芥Col, 以及野生型Col叶肉细胞原生质体。对其中永久表达植株通过潮霉素筛选获得阳性转基因材料进行功能分析, 叶肉细胞原生质体瞬时表达LCF3::GFP在激光共聚焦显微镜下观察荧光, 进行LCF3蛋白亚细胞定位分析。

参照Wang等^[20]方法进行β -葡糖苷酸酶(GUS)的组织化学染色和共聚焦显微镜观察GFP荧光定位。利用叶绿素荧光成像仪(CF Imager, Technologica公司)于25℃下测定叶绿素荧光猝灭过程。叶片暗适应30 min后, 测定F_v/F_m值。F_v/F_m比值反映光合系统II光化学反应的最大光合效率。该参数被广泛应用于光合系统受胁迫程度的检测, F_v/F_m值降低暗示光合系统II受损伤。

突变体lcf3-1在植株形态和叶片颜色及开花时间上与野生型均无明显差异。在培养皿中培养lcf3-1 10 d后, 利用叶绿素荧光成像仪检测其叶绿素荧光表型, 发现突变体F_v/F_m值低于Col及Ler野生型(图1-B)。将突变体lcf3-1移栽土中培养25 d后, 其F_v/F_m值仍低于野生型(图1-D), 数据统计分析显示两者之间存在显著相差(P < 0.05)。经暗处理3 d后, 二者在叶绿素含量上无明显区别(图2-A), 但二者F_v/F_m值相差0.20左右, 较暗处理前差异明显增大(图2-B)。

图1

Fig. 1

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	图1 叶绿素荧光突变体的筛选 A: 培养皿中生长10 d的幼苗; B: 培养皿中生长10 d幼苗的叶绿素荧光图像; C: 土中生长25 d的幼苗; D: 土中生长25 d幼苗的叶绿素荧光图像。Fig. 1 Mutants screening by chlorophyll fluorescence imaging A: Seedlings grown on MS culture medium for 10 days; B: Chlorophyll fluorescence of seedlings grown on MS culture medium for 10 days; C: Seedlings grown in soil for 25 days; D: Chlorophyll fluorescence of seedlings grown in soil for 25 days.

图2

Fig. 2

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	图2 lcf3-1突变体叶绿素含量及Fv/Fm值 A: 暗处理3 d后叶绿素含量; B: 暗处理3 d后叶绿素荧光。Fig. 2 Chlorophyll content and chlorophyll fluorescence Fv/Fm in WT and lcf3-1 mutant A: Chlorophyll a and b contents after dark treatment for 3 days; B: Chlorophyll fluorescence after dark treatment for 3 days.

将突变体与Col野生型回交, 回交F₁代所有植株均表现野生型表型, F₁代自交得到F₂代, F₂代种下后经暗处理, 叶绿素荧光成像检测F_v/F_m, 发现F₂代表型出现分离, 分离比例接近3∶ 1 (表1), 这表明lcf3-1为单基因隐性突变, 可以通过图位克隆的方法找到该突变位点。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 突变体遗传分析 Table 1 Genetic analysis of lcf3-1 mutant 世代 Generation 总株数 Total plants 野生型 Wild-type 突变体 Mutant χ 2 P0.05 F1 98 98 0 F2 711 535 176 2.1316 3.84

表1 突变体遗传分析 Table 1 Genetic analysis of lcf3-1 mutant

将lcf3-1突变体和Ler野生型杂交得到F₁代, F₁自交得到F₂代, 挑选F₂代中具有lcf3-1突变体表型的88株植株分别提取DNA, 利用TAIR网站上的引物(marker)信息粗定位。经过PCR及凝胶电泳检测发现lcf3-1突变位点与第2染色体中下游NGA168 BAC明显连锁, 重组率约为10.94%。由此推断, 该突变基因位于第2染色体下端附近。在此基础上扩大遗传群体, 用616个F₂代lcf3-1低叶绿素荧光表型植株的DNA在NGA168 BAC的两端分别设计引物进一步细定位, 发现突变位点可能位于T6B20 BAC上, 重组率为1.62% (图3-A)。通过进一步精细定位和测序确定突变基因为At2G30570, 该基因只含有一个内含子, lcf3-1突变体中At2G30570内含子的3´ 端剪接边界区发生突变, 由鸟嘌呤(G)转换为腺嘌呤(A)(图3-B), 从而使lcf3-1突变体中LCF3基因的mRNA出现不同大小的剪接版本(图4), 表明lcf3-1突变体中LCF3正常的剪接过程出现了错误。

图3

Fig. 3

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	图3 LCF3基因的克隆 A: LCF3基因图位克隆; B: lcf3-1突变体中At2G30570内含子3´ 端边界发生G/A突变。Fig. 3 Map-based cloning of LCF3 gene A: Map-based cloning of LCF3 gene; B: Mutation from G to A in intron 3′ border of gene AT2G30570 in lcf3-1.

图4

Fig. 4

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	图4 lcf3-1突变体基因突变位点分析 半定量PCR检测LCF3基因表达情况, ACTIN2为内参基因。Fig. 4 Analysis of mutation site of lcf3-1 mutant Expression analysis of LCF3 in WT and lcf3-1 by RT-PCR, ACTIN2 gene was used as control.

从SALK中心获得了PsbW (At2G30570)基因的T-DNA插入突变体SAIL_885_A03, 命名为lcf3-2, 并通过半定量RT-PCR检测其At2G30570未表达(图5)。在lcf3-1突变体背景下构建了PsbW自身启动子驱动的PsbW回补转基因植株, 暗处理后, 突变体lcf3-1和lcf3-2均显示出明显低于野生型的低叶绿素荧光表型(图6-A), 而lcf3-1突变体背景的回补转基因植株则表现出和野生型相似的表型(图6-B)。这一结果进一步证实lcf3-1突变体的低叶绿素荧光表型是由LCF3/PsbW (At2G30570)基因突变所致。

图5

Fig. 5

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	图5 野生型及lcf3-2突变体中LCF3基因表达情况 半定量PCR检测lcf3-2突变体中LCF3基因表达情况, ACTIN2为内参。Fig. 5 Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA insertion line lcf3-2 by RT-PCR Expression analysis of LCF3 in WT and T-DNA insertion line lcf3-2 by RT-PCR, ACTIN2 gene was used as control.

图6

Fig. 6

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	图6 LCF3基因突变导致低叶绿素荧光表型的验证 A: lcf3-1和lcf3-2突变体叶绿素荧光均低于Col野生型; B: lcf3-1突变体中回补At2G30570基因使转基因植株叶绿素荧光表型恢复。Fig. 6 Verification of the function of LCF3 gene on chlorophyll fluorescence A: Chlorophyll fluorescence of lcf3-1 and lcf3-2 was lower than that of WT. B: Complementation transgenic line showed the same chlorophyll fluorescence as WT.

LCF3基因突变导致拟南芥低叶绿素荧光表型, 推断LCF3蛋白可能是在叶绿体中发挥作用。pHBT-GFP空载体转化拟南芥叶肉细胞原生质体时, GFP荧光几乎充满整个细胞质部分(图7-A)。融合蛋白LCF3::GFP的绿色荧光则特异地出现在细胞内叶绿体中(图7-B)。另外LCF3::super1300⁺-GFP永久转基因植株也显示气孔保卫细胞中LCF3::GFP融合蛋白绿色荧光与叶绿体红色自发荧光完全重合(图7-C)。以上结果说明LCF3蛋白定位于叶绿体中。

图7

Fig. 7

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图7 LCF3蛋白亚细胞定位 A: pHBT-GFP空载体转化拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光分布; B: pHBT::LCF3-GFP转化拟南芥叶肉细胞原生质体的荧光分布; C: super1300+::LCF3-GFP永久转基因植株保卫细胞荧光分布。Bar=5 μ m。Fig. 7 Subcellular localization of LCF3 A: Fluorescence distribution of mesophyll protoplast of Arabidopsis transformed by pHBT-GFP vector. B: Fluorescence distribution of mesophyll protoplast of Arabidopsis transformed by pHBT::LCF3-GFP vector. C: Fluorescence distribution of guard cell from transgenic plants by super1300+::LCF3-GFP. Bar=5 μ m.

利用分离得到的LCF3基因启动子与报告基因GUS融合的转基因植株, 检测LCF3在拟南芥不同组织中的表达模式。组织化学染色表明, 14 d龄植株叶片与根成熟区有强烈的GUS表达, 而根尖分生组织没有GUS表达。植物抽薹后对花进行GUS活性染色, 发现花萼、花药以及柱头中均有GUS表达(图8)。这一结果暗示LCF3可能在植物发育的不同时期均有作用。

图8

Fig. 8

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	图8 LCF3基因的组织表达分析 A: 14 d的拟南芥幼苗; B: 花; C: 14 d幼苗根尖放大。Fig. 8 Organ-specific expression of LCF3 in Arabidopsis A: Arabidopsis seedlings of 14 days-old; B: Flower; C: Root tip in picture of 14 days-old seedlings.