玉米抗灰斑病QTL元分析及其验证
[闫伟, 李元, 宋茂兴, 张旷野, 孙铭泽, 瞿会, 李凤海, 钟雪梅, 朱敏, 杜万里, 吕香玲* 
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引用本文
闫伟, 李元, 宋茂兴, 张旷野, 孙铭泽, 瞿会, 李凤海, 钟雪梅, 朱敏, 杜万里, 吕香玲. . 玉米抗灰斑病QTL元分析及其验证. 作物学报, 2016, 42(5): 758-767
YAN Wei, LI Yuan, SONG Mao-Xing, ZHANG Kuang-Ye, SUN Ming-Ze, QU Hui, LI Feng-Hai, ZHONG Xue-Mei, ZHU Min, DU Wan-Li, L#cod#x000dc; Xiang-Ling. . Meta-analysis and Validation of QTL for Resistance to Gray Leaf Spot in Maize. ACTA AGRONOMICA SINICA, 2016, 42(5): 758-767
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YAN Wei, LI Yuan, SONG Mao-Xing, ZHANG Kuang-Ye, SUN Ming-Ze, QU Hui, LI Feng-Hai, ZHONG Xue-Mei, ZHU Min, DU Wan-Li, L#cod#x000dc; Xiang-Ling. . Meta-analysis and Validation of QTL for Resistance to Gray Leaf Spot in Maize. ACTA AGRONOMICA SINICA, 2016, 42(5): 758-767
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作物学报编辑部
玉米抗灰斑病QTL元分析及其验证
第一作者联系方式: E-mail: yanwei1452@hotmail.com, Tel: 18512468548
摘要
玉米灰斑病是危害玉米生产的主要病害之一, 目前对抗灰斑病基因数目、位置及作用方式仍然不清楚, 这严重制约着玉米抗灰斑病育种进展。本研究利用元分析方法分析并整理了14篇玉米抗灰斑病QTL文献的信息, 共筛选确定了13个一致性QTL区间。利用以自交系81162为轮回亲本、自交系CN165为非轮回亲本构建的回交导入群体根据连锁不平衡原理对13个一致性QTL进行验证, 在13个一致性QTL区间共获得20多个偏分离位点。第1和第4染色体上偏分离最严重, 其他染色体上偏分离度较小。说明第1和第4染色体上存在着效应较大的抗病QTL。第1染色体标记umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461处供体基因频率均在50%以上, 可能存在几个连锁的抗病基因。第4染色体上基因位于标记bnlg2291和umc1194之间。研究为精细定位供体CN165中第1和第4染色体上的抗灰斑病QTL奠定了基础。
关键词:
灰斑病; 元分析; 一致性QTL; 回交导入系; 主效QTL
Meta-analysis and Validation of QTL for Resistance to Gray Leaf Spot in Maize
YAN Wei, LI Yuan, SONG Mao-Xing, ZHANG Kuang-Ye, SUN Ming-Ze, QU Hui, LI Feng-Hai, ZHONG Xue-Mei, ZHU Min, DU Wan-Li, LÜ Xiang-Ling*
Abstract
Gray leaf spot (GLS) is one of the most severe leaf diseases of maize worldwide. The breeding progress for resistance to GLS has been seriously hindered by less knowledge about QTL number, QTL intervals and mechanism of GLS. Based on meta-analysis, we conformed 13 consensus QTL regions from 14 articles on resistance to gray leaf spot of maize. One backcross with inbred line 81162 as recurrent parent and inbred line CN165 as donor parent, was used to test the consensus of those 13 QTL regions on the basic of linkage disequilibrium getting more than 20 partial separated loci. High level of partial separation indicated that there were QTLs with high effects of resistance to GLS on chromosome 1 and chromosome 4. On chromosome 1, the donor genes closed to markers of umc2227, bnlg1832, umc1243, umc2025, umc1515, umc1297, and umc1461 showed the frequency over 50%. Therefore, we inferred that there were a few of highly linked QTLs on chromosome 1. The resistant QTL on chromosome 4 was located between markers bnlg2291 and umc1194. Consequently, this study could lay a foundation for the QTL fine mapping on chromosome 1 and chromosome 4 in the donor parent CN165.
Keyword:
Gray leaf spot; Meta-analysis; Consensus QTLs; Backcross introgression lines; Major QTL
玉米灰斑病是由尾孢菌侵染玉米叶部引起的真菌病害, 又被称为玉米尾孢菌叶斑病[1, 2]。玉蜀黍尾孢菌(Cecrospora zeae-maydis Tehon & Daniels)为玉米灰斑病的真菌侵染病原, 主要残存在土壤中的病植物残体上越冬, 其分生孢子通过风和雨水飞溅散布到玉米植株上。温和潮湿的条件下灰斑病会进一步侵染, 导致严重的叶片衰老和茎秆腐烂。于20世纪20年代在美国首次发现灰斑病, 如今已成为危害玉米生产的主要病害[3]。长期的生产实践证明, 选育和推广抗病品种是防治玉米灰斑病的最有效的途径之一[4, 5]。
研究表明, 玉米对灰斑病的抗性属多基因控制的数量性状, 其不同的基因作用方式和效应不同, 抗性基因的累积可使品种产生较高的抗性。因此玉米抗灰斑病主效QTL的发掘对玉米抗病育种具有重要意义[6]。自20世纪90年代以来, 国内外学者开展了一些玉米抗灰斑病的基因定位研究, 发掘出数量较多的抗病QTL[7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]。但由于不同研究间存在材料遗传背景、发病环境条件、图谱标记密度等差异, 定位结果间一致性较差。目前对抗灰斑病基因数目、位置及作用方式仍然不清楚, 这严重制约着玉米抗灰斑病育种进展。
元分析(Meta-analysis)统计方法是对众多现有实证文献的再次统计, 通过将不同文献的QTL位点统一投射到参考图谱上, 根据每个QTL的中心位置及其置信区间, 即可以根据最大概率的原理估计出真实QTL的位置、缩小QTL的置信区间。目前, 高密度的玉米IBM遗传图谱为不同试验QTL整合和一致性图谱构建奠定了基础[21]。Chardon等[22]提出利用overview和元分析的方法对玉米花期相关的313个QTL信息进行整合分析, 考虑QTL定位中作图群体及其大小、QTL效应等因素, 最终获得62个一致性QTL。Truntzler等[23]利用元分析整合了11个不同材料的与青贮玉米品质相关的QTL原始图谱, 得到一致性QTL。这种基于性状定位的比较研究不仅有助于发掘一致性主效基因位点及其连锁标记, 同时为基因/QTL的克隆和利用提供了新手段[24]。
杂交、回交与自交方法相结合, 构建高世代回交导入系(或近等基因系)基因定位的理论, 成为目前开展性状理论研究和育种实践相结合的一个有效途径。因为构建的回交导入系, 其每一导入系与导入系, 或与轮回亲本仅在某几个染色体片段上有差异, 这样的植株适用于性状分析, 可作为目标性状遗传与生理学基础研究分析的材料; 同时导入系在遗传背景上继承了轮回亲本的主要优良基因, 基本保持了原有轮回亲本的一般配合力与特殊配合力, 可以快速应用于育种[25]。如徐建龙等[26]、Li等[27]、李芳等[28]、Xie等[29]分别利用回交导入系进行了水稻抗旱、抗病及产量品质相关的QTL研究; Ho等[30]、吕香玲等[31]、Li等[32]、Salvi等[33]、Pea等[34]、Teng等[35]分别利用导入系进行了玉米抗旱、抗病和产量相关QTL的定位研究。
本文利用元分析方法对不同玉米群体的抗灰斑病QTL进行整合分析, 并对分析结果进行有条件的筛选, 确定玉米抗灰斑病一致性QTL。然后利用回交导入系群体进行一致性QTL验证, 发掘玉米抗灰斑病主效QTL。
1 材料与方法
1.1 玉米抗灰斑病QTL文献下载及格式文件整理
从NCBI、SpringerLink等网站下载已发表的玉米抗灰斑病QTL相关文献, 根据元分析软件格式要求按照QTL名称、染色体位置、置信区间、临近标识、群体类型等信息整理数据。
1.2 玉米抗灰斑病QTL信息整合及元分析
通过阅读文献, 将整理好的每个QTL的相关信息按一定格式载入BioMercator V4.2.1软件中, 以IBM2 2008 Neighbors作为参考图谱对所有QTL整合并绘制成整合图谱。根据整合结果, 分别对第1、第2、第3、……、第10染色体进行元分析, 选取模型AIC值最小的为最适合模型, 以包括2个及以上群体和3个及以上QTL为筛选条件, 确定一致性QTL的最可能位置及置信区间。
1.3 利用回交导入系进行一致性QTL验证
1.3.1 供试材料 以CN165为供体和81162为受体通过2代回交和2代自交构建出BC2F3群体, 自交系CN165为热带血缘材料, 高抗多种玉米病害, 植株属于平展型, 较高大; 81162是吉林农业科学院选育的优良自交系, 株型紧凑, 叶片夹角小, 但对玉米灰斑病敏感。
1.3.2 灰斑病抗性鉴定 2012年在沈阳农业大学试验田种植亲本自交系和BC2F3群体, 亲本各种植2行, BC2F3群体种植60行, 行长4 m, 每行17株, 利用人工接种技术在该群体内筛选抗玉米灰斑病单株并自交留种, 每一果穗构建为一个回交导入系。2013年种植亲本自交系和回交导入系并人工接种鉴定。采用完全随机区组排列, 单行区种植每个回交导入系, 行长4 m, 每行17株, 2次重复。鉴定用的玉米灰斑病菌是从沈阳地区采集的玉米感病叶片上的病斑, 按常规分离法分离培养的纯培养物。采用玉米叶粉碳酸钙琼脂培养基(MLPCA)进行分生孢子的培养。用无菌水配制成接种用分生孢子悬液, 将其浓度调至2.5× 103个 mL-1。在玉米植株喇叭口期(第9~第11叶期), 用喷嘴处装有20 mL注射器针头的手提式注射器, 从植株喇叭口处平行插入, 将每株10 mL的病菌孢子悬液注入植株心叶, 接种所有单株。
按抗病性调查分级方法[36], 于玉米乳熟期田间目测调查接种部位上、下叶片的发病情况, 记载病情级别。当鉴定圃中的感病对照丹340达到其相应的感病程度(7级)以上时, 鉴定则视为有效。1级为叶片上无病斑或仅有零星病斑, 病斑占叶面积少于或等于5%, 属高抗(HR); 3级为叶片上有少量病斑, 占叶面积6%~10%, 属抗(R); 5级为叶片上病斑较多, 占叶面积11%~30%, 属中抗(MR); 7级为叶片上有大量病斑, 病斑相连, 占叶面积31%~70%, 属感病(S); 9级为叶片基本被病斑覆盖, 叶片枯死, 属高感(HS)。
1.3.3 回交导入系的基因型 采用CTAB法提取54个抗玉米灰斑病单株基因组DNA。在MaizeGDB数据库中根据获得的一致性QTL区间所在的染色体区域查找SSR标记信息, 下载引物序列, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。SSR标记分析包括PCR扩增、聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染等程序, 参考LABORATARY PROTOCOLS分析方法[37], 并根据经验优化检测技术。首先在亲本间进行多态性筛选, 获得具有多态性的引物分析导入系基因型。在同等迁移速率下, 用“ A” 表示后代单株扩增条带与亲本CN165条带相一致, “ B” 表示与亲本81162条带相一致, “ H” 表示杂合条带, “ U” 表示缺失条带。
1.3.4 主效QTL分析方法 根据连锁不平衡理论分析电泳检测结果, 当所选单株的某一标记位点基因型频率与理论期望值之间存在显著差异时, 认为存在该选择位点。通常选择P≤ 0.0001的显著水平来减小误差。其中供体位点的基因频率高, 表明存在对供体基因的有利选择, 反之则不利; 同时可以推断在高频率基因型的标记处存在性状相关的QTL。当这种偏分离相关性是由供体纯合子引起时, 表明基因间存在着加性效应; 如果偏分离是由供体杂合子引起, 表明基因间存在着超显性效应; 若偏分离是由供体纯合子和杂合子共同引起, 则表明存在着部分或者完全显性。
2 结果与分析
2.1 玉米抗灰斑病QTL文献及整理
通过浏览NCBI等网站, 本文整理了14篇玉米抗灰斑病QTL文献的信息, 共得到98个QTL区间(表1)。
 | 表1 玉米抗灰斑病QTL的文献信息 Table 1 Reference informations of resistance to gray leaf spot of corn |
2.2 玉米抗灰斑病QTL的整合与一致性QTL确定
整合已经定位的98个QTL。表明, 在玉米的10条染色体上均有玉米抗灰斑病QTL存在, 每条染色体上分布的数量不同, 主要集中在第1、第2、第4、第5、第7、第8、第9染色体上。第6染色体上整合的QTL数最少(3个QTL), 第4条染色体上整合的QTL数最多(21个QTL)。各QTL整合到IBM2 2008 Neighbors参考图谱后的区间大小差异较大, 从最小的1.7 cM到最大的277.83 cM。
对98个抗灰斑病QTL进行元分析。在软件给出的5个分析模型中, 选择AIC值最小的模型, 共得到34个QTL区间(表2)。本文以群体数≥ 2、整合QTL数≥ 3为筛选条件, 最终确定13个一致性QTL。这些QTL分别位于第1染色体3个, 置信区间分别为405.29~409.74 cM、525.28~538.44 cM和927.07~973.79 cM; 第2染色体4个, 置信区间分别为280.51~288.84 cM、372.29~383.96 cM、468.84~486.22 cM和624.34~635.58 cM; 第4染色体4个, 置信区间分别为175.09~ 187.61 cM、288.88~292.71 cM、433.84~444.70 cM和524.51~ 525.48 cM; 第7染色体1个, 置信区间为186.17~259.98 cM; 第8染色体1个, 置信区间为378.64~390.84 cM (图1)。
 | 图1 玉米抗灰斑病QTL的元分析图中染色体左侧垂直线代表QTL置信区间, 水平线代表LOD值。红色垂直线所标出的区间为各染色体上的一致性QTL区间。Fig. 1 QTL meta-analysis of resistance to gray leaf spot of cornIn the figure, the vertical lines on the left of chromosome denote the confidence interval and the horizontal lines denote the LOD. The intervals pointed out by red vertical lines are the “ consensus” QTL. |
| 表2 玉米抗灰斑病QTL的元分析结果 Table 2 QTL meta-analysis of resistance to gray leaf spot of corn |
2.3 回交导入系抗病性表现
2012年对BC2F3群体单株接种鉴定, 共获得54个抗病表现3级以上的抗病单株并自交留种获得其回交导入系。2013年对54个回交导入系重复鉴定, 从每一回交导入系每一重复选取连续10株调查病斑覆盖度, 并由10个单株病斑覆盖度平均水平确定该导入系的抗感级别。对一个导入系, 选取2次重复鉴定结果中发病级别较高的结果作为导入系的最终抗感级别。54个回交导入系的抗病表现鉴定结果见表3。其中抗病性表现为1级的家系有21个, 3级的家系有19个, 5级的家系有14个。
| 表3 54个导入系抗病性表现 Table 3 Resistance performance of 54 backcross introgression lines |
2.4 标记位点基因型分析
根据获得的13个一致性QTL结果及玉米MaizeGDB信息选取一致性QTL区间的标记进行亲本多态性筛选, 获得74对在亲本间表现多态性的引物。利用该74对亲本多态性引物对54个抗病单株进行标记基因型分析, 并计算供体基因频率。供体基因频率最高达89%, 其中达50%以上的标记有15个, 分别位于第1和第4染色体上(表4)。
| 表4 标记位点供体基因频率及卡平方值 Table 4 Frequency of donor parent’ s genotype and χ 2 |
2.5 主效QTL分析
本试验54个导入系DNA采自BC2F3世代, 根据计算可知, 在非选择的情况下, 群体中某一单株在单一标记位点上基因型的理论概率P(AA)∶ P(Aa)∶ P(aa) = 3∶ 2∶ 27, 分别代表了来源于供体亲本的基因纯合、基因杂合和来源于轮回亲本的基因纯合的理论概率。根据此理论值, 计算3种基因型的χ 2值, 利用χ 2值的显著性检验判断标记位点附近是否存在抗病性QTL。
表4表明, 74个标记位点中20多个位点出现了严重偏分离现象。其中第1染色体标记位点χ 2值最大达到121.46, 第2染色体达64.7, 第4染色体达213.98, 第7染色体达18.98, 第8染色体达24.76。由此说明第1和第4染色体上存在主效抗病QTL, 第2染色体上抗病QTL效应次之, 其他染色体上的抗病QTL效应可能较小。
根据IBM2 2008 Neighbors标记顺序, 分析染色体上χ 2值变化。由图2可见, 第1染色体上χ 2值没有显著的一个高峰点, 而是在标记umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461处出现一个平缓的峰线。第2染色体上χ 2高峰点位于标记phi435417处。第4染色体上χ 2高峰点位于标记bnlg2291和umc1194处。第7染色体上χ 2高峰点位于标记umc2333处。第8染色体上χ 2高峰点位于标记phi080处。这说明在这些位点附近可能存在抗病QTL。
 | 图2 卡平方显著性检验Fig. 2 Significance testing by χ 2 test |
3 讨论
迄今, 已有较多玉米抗灰斑病QTL定位的研究, 然而仍然未能找到通用性标记被育种家应用于辅助育种。近年来, 元分析和生物信息学方法在整合不同QTL信息并进一步挖掘候选基因上得到了广泛的应用。这一基于性状的比较定位途径可以减少分子育种的基本投入, 为开发复杂数量性状的主效基因及标记, 进而为克隆基因/QTL提供了技术支持。本研究通过对前人研究的总结及元分析处理, 共得到13个一致性QTL。利用回交导入群体根据连锁不平衡原理对13个一致性QTL进行验证, 在13个一致性QTL区间共获得20多个偏分离位点。第1和第4染色体上偏分离最严重, 其他染色体上偏分离度较少。说明第1和第4染色体上存在着效应较大的抗病QTL。从χ 2高峰点来看, 第1染色体比较复杂, 标记umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461处χ 2值基本接近, 均较高, 供体基因频率也均在50%以上, 这说明第1染色体抗病基因表现十分复杂, 可能存在几个紧密连锁的抗病基因。这也解释了为什么多数研究在第1染色体上均定位到QTL, 但位置差异较大。第4染色体上χ 2值最高, 而且供体基因频率达到最大值89%, 这说明在本研究供体亲本中第4染色体上存在一个效应较大的抗病基因。在前人的研究中, 第4条染色体上获得的QTL数最多(21个)。如Bubeck等[19]发现在10条染色体上均存在抗病QTL; Saghai Maroof等[12]发现在第1、第2、第4、第8、第10染色体上有QTL; Gordon等[8, 38]发现抗病QTL主要分布于第2和第4染色体的长臂上; Zwonitzer等[16]定位的QTL分别位于染色体bins 1.05~1.06, 1.08~1.09, 2.02~2.03, 3.04~3.05, 4.05, 7.02, 8.07~8.09, 10.05; Benson等[39]发现在第1、第2、第4染色体上存在QTL。综合玉米抗灰斑病基因(QTL)定位研究表明, 玉米10条染色体上均可能存在抗病QTL, 而且不同材料控制灰斑病抗性的QTL数目与位置不同, 多数研究都含有2~3个主效QTL。如Gordon等[8]分别在染色体bin2.09和bin 4.08定位到2个主效QTL; Lehmensiek等[9]研究发现染色体bin1.04和bin2.04各存在一个效应值较高的主效QTL; Veiga等[13]得到位于bin4.03、bin4.04和bin4.05的3个主效QTL; Chung等[15]定位出2个主效QTL, 分别位于bin1.04和bin8.05; Zwonitzer等[16]检测到3个主效QTL, 分别位于bin1.05、bin1.08和bin2.02; Asea等[17]分别在染色体bin2.09和bin4.08检测到主效QTL; Balint等[18]定位到3个与抗病有关的主效QTL, 分别位于bin1.05、bin2.04和bin4.05。本研究中供体CN165中至少含有2个以上主效抗病QTL, 它们分别位于第1和第4染色体。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.
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