福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供甘蔗材料, 品种为崖城05-179。试剂主要有PrimeScript RT-PCR Kit反转录试剂盒(TaKaRa, 中国大连)、TRIzol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)、Gel Extracti on Kit (Tiangen Biotech Co., 中国北京)、SYBRGreen PCR Master Mix Kit (Roche, USA)。

参考黄珑等^[29]的操作步骤。在保证样本均一性情况下, 从田间采样, 将蔗株砍成单芽茎段, 于高温高压灭菌营养土中催芽(16 h/8 h, 光/暗, 28℃), 种植。待蔗苗长出4~6叶时, 取长势一致的蔗苗进行组培, 将组培甘蔗幼苗移出并在温室内开放水培一周。设置对照组和试验组, 生物学重复为3次。以0 h未处理的蔗苗作为对照(表1)。以上所有甘蔗材料取样后被立即投入液氮并保存于-80℃冰箱至RNA提取。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实时荧光定量材料处理 Table 1 Material processing for Real-time PCR 处理条件 Treatment condition 取样时间 Sampling time (h) 取样点1 Site 1 取样点2 Site 2 取样点3 Site 3 5 mmol L-1水杨酸 SA 6 12 24 100 μ mol L-1茉莉酸甲酯MeJA 6 12 24 100 μ mol L-1脱落酸 ABA 6 12 24 25.0% PEG 模拟干旱 Simulated drought 6 12 24 250 mmol L-1 NaCl 12 24 48

表1 实时荧光定量材料处理 Table 1 Material processing for Real-time PCR

以高粱CAX1基因核酸序列(GenBank登录号为XM_002441593)为探针, 利用Blast工具在甘蔗EST数据库中检索, 筛选出与探针序列同源性较高的甘蔗EST序列(表2), 使用在线工具CAP3 (http://pbil.univ-lyon1.fr/ cap3.php)对序列聚类、拼接、延伸, 得到新的重叠群, 持续比对检索直至无新的EST可供拼接为止, 从而获得cDNA序列。使用ORF Finder在线软件(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找序列的开放阅读框, 并对其分析和翻译。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 电子克隆中用到的甘蔗EST序列 Table 2 Sugarcane ESTs used in silicon cloning EST名称 ESTs name GenBank登录号 GenBank accession number EST1 CA269569 EST2 CA290478 EST3 CA074339 EST4 CA198455 EST5 CA233144 EST6 CA233226 EST7 GT873352

表2 电子克隆中用到的甘蔗EST序列 Table 2 Sugarcane ESTs used in silicon cloning

通过TRIzol法提取NaCl处理的甘蔗YC05-179蔗苗的总RNA, 然后使用Prime-Script RT Reagent Kit反转录试剂盒合成cDNA作为PCR模板。应用Primer 5.0软件对ScCAX1拼接序列进行特异性引物设计, 即CAX1-1F和CAX-1R (表3), PCR扩增体系总体积25 μ L, 含10× Ex Taq buffer 2.5 μ L、10 mmol L^-1 dNTPs 2 μ L、20 μ mol L^-1上下游引物各1.0 μ L、Ex Taq酶0.125 μ L、cDNA模板1.0 μ L、ddH₂O 17.375 μ L。PCR程序为95℃预变性4 min; 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 35个循环; 72℃延伸10 min。先将扩增产物纯化回收, 随后将回收产物连接到pMD-19T载体并转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中, 于含有氨苄青霉素的LB平板上进行阳性克隆筛选并挑取单菌落鉴定, 而后送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序, 通过DNAMAN软件比对测序结果与电子克隆序列。

参考黄珑等^[29], 应用在线工具ExPASyProtparam tool预测ScCAX1基因编码的蛋白一级结构、亲疏水性; 对其二级结构、亚细胞定位及功能预测和信号肽的预测则分别采用SOPMA^[30]、SignalP 4.0 Server软件和Psort; 用SWISSMODEL在线预测工具预测分析蛋白三级结构; 通过NCBI中的CDD (Conserved Domain Database)数据库预测蛋白保守结构域; 用Blastp在线工具查找甘蔗ScCAX1同源氨基酸序列, 并使用DNAMAN7.0多重比对同源氨基酸序列, 使用MEGA5.1软件NJ (Neighbor-Joining)法(BootStrap 1000)构建系统进化树。

采用TRIzol法提取样品RNA, 包含SA、MeJA、ABA、PEG和NaCl胁迫处理材料及崖城05-179的组织特异性材料即根、茎、叶、皮、茎尖和芽组织材料。参照Prime-Script RT Reagent Kit操作说明书, 将RNA反转录合成cDNA得到模板。基于ScCAX1基因序列进行定量引物设计, 即qCAX1-2F和qCAX1-2R (表3), 内参基因为CUL和CAC, 内参基因的定量引物见表3^[31]。PCR体系(20 μ L)含SYBRGreen Primix Ex Taq (2× ) 10 μ L、10 μ mol L^-1上下游引物各0.8 μ L、cDNA 2.0 μ L、ddH₂O 6.4 μ L。实时荧光定量PCR扩增程序为50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s、60℃ 1 min, 45个循环; 增加熔解曲线; 反应时设置3次技术重复。组织特异性表达分析中, 未使用参照样品, 仅将ScCAX1基因在茎中的表达量定义为1, 其他组织中该基因的表达量与之相比。在ABI PRISM7500 Real-time PCR System软件上对定量数据初步分析后, 导致Microsoft Excel工作表, 采用2^{-Δ Δ Ct}算法^[32]分析实时荧光定量PCR试验结果, 计算3次重复数据的标准误后绘图。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 ScCAX1基因克隆与表达所用引物 Table 3 Primers used in ScCAX1 gene cloning and expression analysis 引物 Primer 上游引物序列 Forward primer sequence (5'-3') 下游引物序列 Reverse primer sequence (5'-3') 退火温度 Tm (℃) 用途 Purpose CAX1-1 TCCCGAGCATGTAGCATTGT CAGCATCTTCCCGCAGTCTA 55 Gene cloning qCAX1-2 TAGTAACGGTCTTCACGCTCCA TCCATTTCCACGCTGTCTCAAA 61 Real-time-qPCR CUL TGCTGAATGTGTTGAGCAGC TTGTCGCGCTCCAAGTAGTC 55 Reference genes CAC ACAACGTCAGGCAAAGCAAA AGATCAACTCCACCTCTGCG 57 Reference genes

表3 ScCAX1基因克隆与表达所用引物 Table 3 Primers used in ScCAX1 gene cloning and expression analysis

应用电子克隆技术获得甘蔗Ca²⁺/H⁺反向运转体基因CAX1的cDNA全长序列, 并根据该序列设计1对特异性引物, 经过RT-PCR扩增获得约784 bp的单一条带(图1), 经过胶回收、连接转化、菌液PCR鉴定和测序。序列比对表明, RT-PCR扩增产物序列与电子克隆得到的序列同源性高达99.87%, 验证了电子克隆的正确性。将该基因命名为ScCAX1, 其GenBank登录号为KT799799。该基因的核酸序列及其推导的氨基酸序列如图2。

图1

Fig. 1

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	图1 甘蔗ScCAX1基因的RT-PCR扩增 M: marker 2000 bp; 1: RT-PCR产物。Fig. 1 RT-PCR amplification ofScCAX1gene in sugarcane M: DNA marker 2000 bp; 1: RT-PCR products.

图2

Fig. 2

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	图2 同源克隆获得的甘蔗ScCAX1基因的cDNA序列及其推导的氨基酸序列(* 终止密码子) 黑色框部分为特异性引物在基因序列中的位置。Fig. 2 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of sugarcane ScCAX1 gene obtained by homology cloning (* stop codon) The sequence fragment complementary to primer is highlighted in black box.

2.2.1 甘蔗ScCAX1基因编码氨基酸的一级和二级结构预测 甘蔗ScCAX1基因编码的蛋白一级结构预测显示, 该蛋白分子式为C₁₀₈₅H₁₆₈₉N₂₅₉O₃₀₁S₉, 分子量为23.4 kD, 编码了214个氨基酸。其中等电点(pI)为4.71, 不稳定系数为23.70, 数值小于40表明该蛋白稳定, 推测为稳定的酸性蛋白质。二级结构预测显示, 甘蔗ScCAX1蛋白α -螺旋所占的比例最高, 为47.20%, 延伸链所占比例最低, 为24.77%, 无规则卷曲结构占22.90% (表4)。

2.2.2 甘蔗ScCAX1蛋白信号肽、疏水性/亲水性的预测和分析 甘蔗ScCAX1蛋白氨基酸残基的加权平均值较小, 为0.314 (< 0.5), 推测该蛋白不存在信号肽。即甘蔗ScCAX1蛋白为非分泌蛋白, 在细胞质中合成后不能被转运。

从图3可以看出, 第185位具有最高分值, 为3.533, 疏水性最强; 第195位具有最低分值, 为-2.733, 亲水性最强, 绝大部分氨基酸都表现疏水性, 推测甘蔗ScCAX1蛋白是一种疏水蛋白。

2.2.3 甘蔗ScCAX1蛋白三级结构预测 用SWISS- MODEL工具, 以SMTL id: 4k1c.1 Chain id: A为模板对ScCAX1、水稻、粟和玉米的蛋白三级结构进行预测, 序列同源性分别为39%、39%、39%和40%。如图4所示, 甘蔗ScCAX1蛋白的三级空间结构与水稻、粟和玉米蛋白的三级结构均以α -螺旋为主。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 甘蔗ScCAX1蛋白二级结构预测分析 Table 4 Secondary structure prediction of sugarcane ScCAX1 protein 二级结构类型 Secondary structure type 氨基酸残基数目(个) Amino acid residue number (aa) 百分比 Percentage (%) α -螺旋 Alpha-helix 101 47.20 延伸链 Extended strand 53 24.77 无规则卷曲 Random coil 49 22.90

表4 甘蔗ScCAX1蛋白二级结构预测分析 Table 4 Secondary structure prediction of sugarcane ScCAX1 protein

图3

Fig. 3

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	图3 甘蔗ScCAX1蛋白氨基酸疏水性/亲水性预测Fig. 3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of sugarcane ScCAX1 protein

2.2.4 甘蔗ScCAX1蛋白的功能和亚细胞定位预测

该蛋白主要作为受体, 可能性为2.81, 其次也可能是转运子(2.19)和信号传感器(2.03)。甘蔗ScCAX1蛋白可能定位于叶绿体类囊体膜(71.2%)上, 其次是细胞质膜(60.0%), 再次是线粒体内膜(53.8%)。

2.2.5 甘蔗ScCAX1蛋白的保守结构域分析 如图5所示, 甘蔗ScCAX1蛋白隶属的家族为Na_Ca_ex superfamily, 具有Na⁺/Ca²⁺交换蛋白结构域, 即Na_Ca_ex (sodium/calcium exchanger protein)结构域。

2.2.6 甘蔗ScCAX1蛋白的氨基酸序列同源性分析和系统进化树构建 甘蔗ScCAX1蛋白的氨基酸通过NCBI中的Blastp程序对其进行同源性分析, 可知该蛋白与玉米(Zea mays |ACF84781.1|)、粟(Setaria italica|XP004960984.1|)、小麦(Triticum urartu |EMS64041.1|)、山羊草(Aeqilops tauschii |EMT05522.1|)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon |XP003581596.1|)、水稻(O. sativa japonica Group |NP001056506.1|)、油棕(Elaeis quineensis |XP01092 7362.1|)和海枣(Phoenix dactylifera |XP008793971.1|)蛋白的氨基酸序列相似性分别为93%、93%、88%、87%、86%、79%、77%和74%。氨基酸序列多重比对(图6) 表明, 甘蔗ScCAX1蛋白与玉米和粟的氨基酸相似性最高, 为93%, 而与小麦、山羊草、二穗短柄草等相似性较低。

进化树(图7)表明, 同属的棕榈科、油棕和海枣位于同一个分支; 而甘蔗ScCAX1、粟、玉米、小麦、山羊草和二穗短柄草同属于禾本科植物, 则为另一分支, 其中甘蔗ScCAX1和粟米亲缘关系最近。

图4

Fig. 4

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	图4 甘蔗、玉米、水稻和粟CAX1蛋白三级结构预测Fig. 4 Predicted third structure of CAX1 protein in Saccharum spp. hybrids, Zea mays, Oryza sativa, and Setaria italica

图5

Fig. 5

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	图5 甘蔗ScCAX1蛋白的保守结构域分析Fig. 5 Conserved domain prediction of sugarcane ScCAX1 protein

图6

Fig. 6

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	图6 甘蔗ScCAX1蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对Fig. 6 Homology analysis of sequences from sugarcane ScCAX1 and those of other species

图7

Fig. 7

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	图7 不同物种CAX1蛋白的系统进化树Fig. 7 Phylogenetic tree of CAX1 protein sequences from different species

由图8可知, 甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性。该基因在茎中表达量最低, 而在叶中表达量最高, 为茎中的6.46倍, 此外芽中的表达量为茎中的3.5倍。

根据图9, 在MeJA胁迫下ScCAX1基因的表达呈“ 先抑后扬” 的表达模式, MeJA胁迫12 h后该基因的表达受到抑制, 表达量下降为最低值, 为对照的0.81倍, 而在胁迫24 h后表达量上调, 约为对照的1.24倍。NaCl胁迫下ScCAX1基因的表达则呈“ 扬— 抑— 扬” 的表达模式, 在6 h表达量上调, 为对照的2.14倍; 但在24 h表达量最低, 仅为对照的0.77, 而后在48 h表达量又有所上调。图9显示, 在ABA、SA和PEG胁迫下, ScCAX1基因的表达量均不同程度上调。在ABA胁迫下, 与6 h相比, ScCAX1基因的表达量在12 h有所下调, 但在24 h达到最高, 为对照的3.5倍。而SA胁迫下, 该基因表达量呈随胁迫时间增加而增加的趋势, 在胁迫24 h后表达量最高, 为对照的5.47倍。在PEG胁迫诱导下, 该基因的表达量在24 h最高, 为对照的1.97倍, 但在6 h、12 h无明显变化。

图8

Fig. 8

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	图8 甘蔗ScCAX1基因在不同组织中的表达误差线为每组处理的标准误差(n = 3)。Fig. 8 Relative expression of ScCAX1 gene in different tissues of sugarcaneError bars represent the standard error of each treating group (n = 3).

图9

Fig. 9

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	图9 甘蔗 ScCAX1基因在不同外源胁迫下的表达 误差线为每组处理的标准误差(n = 3)。Fig. 9 ScCAX1gene expression in sugarcane under different exogenous stresses Error bars represent the standard error of each treating group (n = 3).