引用本文
郑玲, 史灵敏, 田海莹, 单雷, 边斐, 郭峰, 宣宁, 万书波, 彭振英. 花生 AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证 . 作物学报, 2016, 42(7): 1094-1099
ZHENG Ling, SHI Ling-Min, TIAN Hai-Ying, SHAN Lei, BIAN Fei, GUO Feng, XUAN Ning, WAN Shuo-Bo, PENG Zhen-Ying. Cloning and Functional Analysis of Peanut AhDGAT2a Promoter . ACTA AGRONOMICA SINICA, 2016, 42(7): 1094-1099  
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花生 AhDGAT2a基因启动子的克隆和功能验证
郑玲1,2, 史灵敏1,3, 田海莹1,2, 单雷1,2, 边斐1, 郭峰1, 宣宁1, 万书波1,2,*, 彭振英1,2,3,*
1山东省农业科学院生物技术研究中心 / 山东省作物遗传改良与生态生理重点实验室, 山东济南 250100
2山东大学生命科学学院, 山东济南 250100
3新疆农业大学农学院, 新疆乌鲁木齐 830000
*通讯作者(Corresponding authors): 万书波, E-mail: wansb@saas.ac.cn, Tel: 0531-83178335; 彭振英, E-mail: pengzhenying2005@126.com
收稿日期:2016-01-11 接受日期:2016-05-09 网络出版日期:2016-05-11
基金:本研究由山东省自然科学基金项目(ZR2013CM036)和山东省良种工程项目(2014-2017)资助
摘要

二酰甘油酰基转移酶(DGAT)是三酰甘油(TAG)合成途径的限速酶, 对脂肪酸合成的调节具有关键作用。为了研究 AhDGAT2a的表达调控, 利用GenomeWalking方法从鲁花14基因组中克隆了 AhDGAT2a上游5°侧翼调控区1200 bp序列, 即 AhDGAT2a启动子(pAhDGAT2a)序列, 并利用生物信息学软件分析其包含的调控元件, 发现其含有多个TATA-box和CAAT-box、光调控元件、胁迫防御相关元件和激素响应元件。用pAhDGAT2a构建pAhDGAT2a:GUS植物表达载体并转化烟草品种SR1。利用组织染色法鉴定转基因烟草的GUS表达模式, 发现在转基因烟草的各个器官均有GUS酶活, 在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高, 说明pAhDGAT2a具有一定的组成型启动子活性。

关键词: 花生; AhDGAT2a基因; 启动子; 功能验证
Cloning and Functional Analysis of Peanut AhDGAT2a Promoter
ZHENG Ling1,2, SHI Ling-Min1,3, TIAN Hai-Ying1,2, SHAN Lei1,2, BIAN Fei1, GUO Feng1, XUAN Ning1, WAN Shuo-Bo1,2,*, PENG Zhen-Ying1,2,3,*
1 Biotechnology Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences / Shandong Provincial Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Ecology and Physiology, Jinan 250100, China
2College of Life Science, Shandong University, Jinan 250100, China
3College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830000, China
Fund:This study was supported by Natural Science Foundation of Shandong (ZR2013CM036) and Shandong Province Germplasm Innovation and Utilization Project (2014-2017)
Abstract

Diacylglycerol acyltransferase (DGAT) is a rate-limiting enzyme in triacylglycerol (TAG) biosynthesis pathway. In this study, GenomeWalking method was used for cloning the promoter sequence of AhDGAT2a gene from Luhua 14, and finally a 1200 bp fragment flanking 5′-upstream of AhDGAT2a was obtained and named as pAhDGAT2a. The crucial regulatory elements in pAhDGAT2a were further analyzed with software PlantCARE. There were many TATA-box, CAAT-box, light regulation, stress and defense response and hormone response elements. To assess the activity of pAhDGAT2a, we constructed pAhDGAT2a:GUS cassettes and introduced it into the tobacco SR1 genome by Agrobacterium-mediated transformation. Expression pattern was monitored by histochemical staining. Results showed that GUS activity driven by the pAhDGAT2a was detected in almost all vegetative and reproductive tissues, with a higher expression level in stigma, anther and young seeds than in the other organs, indicating that pAhDGAT2a has a constitutive promoter activity.

Keyword: Arachis hypogaeaL .; AhDGAT2a gene; Promoter; Function analysis

植物油是食用油的主要来源, 约占全世界脂类消耗的75%[1]。植物油是由脂肪酸和甘油化合而成的天然化合物。脂肪酸, 是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链, 是机体主要能量来源之一。植物油的不饱和脂肪酸含量比较高, 作为食用油, 可以降低人体血液中胆固醇的含量, 降低动脉硬化发生的几率[2]。三酰甘油(triacylgycerol, TAG)是大多数植物和动物体内最重要的油脂贮藏形式, 具有重要的社会经济价值。酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶(acyl-CoA diacylgycerol acyltransferase, DGAT)是一种内质网细胞微粒体酶, 其主要作用是催化二酰甘油(diacylglycerol, DAG)加上酰基脂肪酸形成TAG[3]。该基因不仅与脂肪酸合成相关, 在种子萌发和叶片衰老等过程中也有一定的作用[4, 5, 6, 7]。

1956年DGAT基因首次被发现[8], 并很快引起研究人员的广泛关注。根据结构和细胞定位的差异, DGAT被分为DGAT1、DGAT2、WS/DGAT和胞质DGAT四种类型[9, 10]。DGAT1属于包括酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶ACAT1和ACAT2在内的膜结合酰基转移酶(membrane-bound O-acyltransferases, NBOAT)家族的一部分[11]。DGAT2是一个蛋白超级家族, 在动物[12]、植物[13]和酵母[14]中都存在, 但是与DGAT1蛋白家族没有明显的相关性。WS/DGAT和胞质DGAT是近几年发现的DGAT基因家族的新成员, 目前相关研究较少。胞质DGAT (Cyto DGAT)是从花生未成熟种子中获得的一类新型二酰甘油酰基转移酶基因[9], 该基因没有跨膜结构, 与WS/DGAT具有13%的一致性, 与DGAT1和DGAT2家族具有不到10%的相似性。DGAT1和DGAT2大多被定位于内质网[15, 16], 而胞质DGAT是一种定位于细胞质中的可溶性蛋白[9]。

DGAT1和DGAT2对于种子油脂合成非常重要[17, 18], 是Kennedy途径中唯一的限速酶。在拟南芥中过量表达DGAT1基因可使种子含油量显著提高, 而且可使转基因拟南芥种子内的DGAT活性比野生型提高10%~70% [19]。在玉米中过量表达DGAT1不仅可使转基因玉米种子含油量提高, 而且改变了油脂组成[20]。DGAT2在大豆等转基因油料作物中过量表达均能提高种子的含油量[21, 22]。

DGAT基因一直是油料作物的研究热点。花生在我国的种植面积已超过460万公顷, 总产量居世界首位[23]。花生籽仁粗脂肪含量50%左右, 仅次于芝麻[24]。由于DGAT在植物种子发育过程中影响种子油分含量、脂肪酸组成等, 对于油料作物花生DGAT的研究具有重要经济意义。目前花生的DGAT基因也有一些研究成果[9, 25, 26, 27], 但是对DGAT基因启动子的研究却很少。

我们前期从花生中克隆得到了AhDGAT2a基因(GenBank登录号为JF897614), 该基因编码区为1005 bp, 将该基因在烟草中过表达, 发现其能改变转基因烟草叶片的总脂肪酸含量和组成[25]。将AhDGAT2a基因在大肠杆菌Rosetta (DE3)表达, 能使大肠杆菌的体积增大2.4~2.5倍, 同时提高大肠杆菌的总脂肪酸含量[26]。为进一步研究AhDGAT2a基因的表达模式和基因组信息, 我们通过GenomeWalking方法从花生中克隆了AhDGAT2a基因的启动子序列(pAhDGAT2a), 并通过农杆菌介导的遗传转化法转化烟草进行功能验证。这为我们研究植物DGAT2的功能和油料作物TAG的合成及调控提供了依据, 为我们培育油料作物新品种奠定了基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料及菌液

花生品种鲁花14由实验室保存, 室内培育后取幼叶, 液氮速冻保存在-80℃。烟草品种SR1由实验室保存。大肠杆菌(Escherichia coil) DH5α , 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404, 表达载体pCAMBIA2301均由本实验室保存。

1.2 生化试剂及试剂盒

材料基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒和质粒DNA提取试剂盒为TIANGEN公司产品。Genome Walking试剂盒购自TaKaRa。T4 DNA连接酶及限制性内切酶购自Fermentas。其他化学试剂为国药产品。引物合成和测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

1.3 pAhDGAT2a克隆与序列测定

pAhDGAT2a的克隆按照GenomeWalking试剂盒进行3轮扩增。用到的引物SP1: 5° -GGAGAGAGGTAGAA AGAGAAG-3° , SP2: 5° -CGCAAGCGCCAGCGTCGTTTT GAAGC-3° , SP3: 5° -CCGCCGGCGGCGCCACCGTGACG TT-3° 从上海生工合成。反应体系含基因组DNA 1 µ g、2.5 mmol L-1 dNTPs混合物8 µ L、10× LA PCR buffer II 5 µ L、5 U TaKaRa LA Taq 0.5 µ L、100 µ mol L-1 AP1 Primer 1 µ L、10 µ mol L-1 SP1 Primer 1 µ L, ddH2O加到总体积50 µ L。反应条件为94℃ 1 min, 98℃ 1 min, 5个循环的94℃ 30 s, 65℃ 1 min, 72℃ 2 min, 然后94℃ 30 s; 25℃ 3 min; 72℃ 2 min, 15个循环的94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min, 最后72℃延伸10 min。第1轮产物稀释100倍后取1 µ L作为第2轮模板, 以AP1 Primer为上游引物, SP2为下游引物, 其余同第1轮扩增体系。反应条件为15个循环的94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 65℃ 1 min; 72℃ 2 min; 94℃ 30 s; 44℃ 1 min; 72℃ 2 min, 最后72℃延伸10 min。第2轮产物稀释100倍后取1 µ L作为第3轮模板, 以AP1 Primer为上游引物, SP3为下游引物其余同第1轮扩增体系, 反应条件同第2轮。第2轮和第3轮PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 回收纯化目的条带, 连接到pMD18-T载体测序。测序完成后用PlantCARE软件分析其调控元件。

1.4 pAhDGAT2a:GUS植物表达载体构建

将得到的pAhDGAT2a序列用引物PD2F/PD2R扩增, 引物序列为PD2F: 5° -TCTAGAACGACTGCCACATTATA CATTCTAGC-3° , PD2R: 5° -CCATGGTTTGGATTCGGTGG CTGTTG-3° , 引物两侧分别添加Xba I和Nco I酶切位点。提取花生幼叶的基因组DNA, 用基因组DNA为模板进行PCR扩增, 得到的序列进行双酶切, 利用T4连接酶连接到pCAMBIA2301载体, 替换pCAMBIA2301载体上的CaMV35S启动子。连接体系为PCR片段6 µ L, 载体DNA 2 µ L, 10× T4连接酶1 µ L, T4 DNA连接酶1 µ L。上述体系于16℃过夜连接, 连接体系转化大肠杆菌DH5α 感受态, 测序确定pAhDGAT2a:GUS表达载体构建成功。将构建好的pAhDGAT2a:GUS表达载体转化农杆菌LBA4404感受态细胞, 挑取单菌落进行PCR验证, 阳性克隆保存菌液待用。

1.5 烟草遗传转化

烟草种子经75%乙醇和次氯酸钠消毒, 无菌水洗净后播于1/2 MS0基本培养基上生长4~5周, 利用叶盘法转化烟草。将携带pAhDGAT2a:GUS表达载体的农杆菌于28℃, 200转 min-1振荡培养至对数生长期。取烟草叶片, 剪成小块(0.5 cm × 0.5 cm)置MS0重悬的菌液中15 min, 取出后用无菌滤纸吸干水分。在MS分化培养基上暗培养2 d后取出, 于MS选择培养基(含100 mg L-1 kanamycin)上诱导长出丛生芽, 将丛生芽切下放入伸长培养基长至3~5 cm时, 转移到生根培养基使其生根。将生根后的幼苗移入盛有无菌土的花盆, 温室常规管理。

1.6 阳性植株的分子检测

利用CTAB法提取转基因烟草叶片的DNA, 利用引物PD2F/PD2R进行PCR检测。将阳性烟草的幼苗和其他组织器官加入GUS染液, 37℃保温16 h。用70%乙醇冲洗浸泡, 在体视解剖镜下观察染色情况并照相。

2 结果与分析
2.1 pAhDGAT2a启动子克隆与测序

利用GenomeWalking试剂盒, 经过3轮扩增得到pAhDGAT2a的核苷酸片段(图1), 长度1200 bp左右。将该序列连接到pMD18-T载体上测序表明, 该序列为AhDGAT2a基因的启动子序列。

图1 pAhDGAT2a的两轮扩增结果
M: DL2000; A: 第2轮扩增结果; B: 第3轮扩增结果。Fig. 1 PCR products of pAhDGAT2a promoter
M: DL2000; A: products of the second round PCR; B: products of the third round PCR.

2.2 pAhDGAT2a启动子的序列分析

PlantCARE分析显示该序列含有126个TATA-box和22个CAAT-box元件, 符合启动子的一般特点。该启动子序列含有多个与胁迫和防御相关的顺式作用元件, 主要包括一个参与干旱应答反应的MBS元件, 3个参与高温应答反应的HSE元件, 2个参与胁迫和防御应答反应的TC-rich repeats。另外还含有3种激素应答元件, 包括2个激素应答元件TGA-元件, 2个茉莉酸应答元件CGTCA- motif和TGACG-motif, 一个赤霉素应答元件GARE- motif。该启动子还含有真菌激活子应答元件W1-box及一些光应答元件(Sp1、I-box、GT1-motif、ACE和MNF1)。这表明AhDGAT2a的表达调控可能受多种因素的影响。

2.3 烟草的遗传转化与分子检测

先利用卡那霉素初步筛选, 再利用PCR方法检测转基因烟草株系(图2)。结果表明, 有14个株系在1200 bp左右出现条带, 该片段与目的条带大小一致, 表明我们得到了阳性转基因烟草株系。

2.4 转基因烟草的GUS染色

利用GUS染色方法检测GUS基因在T2代转基因烟草的各组织器官表达的结果表明(图3), GUS在转基因烟草的营养和生殖器官均有表达, 其中在柱头、花药和幼嫩种子中表达量较高(图3-G, H), 而在花丝和花柱中则基本不表达(图3-F, G)。

3 讨论

TAG是大多数植物和动物体内最重要的油脂贮藏形式, DGAT是TAG合成反应的限速酶, 对于种子油脂合成非常重要[17, 18]。在拟南芥等多种植物中过量表达DGAT基因均能显著提高种子的含油量[17, 19, 28, 29, 30]。我们实验室前期从花生中克隆得到了DGAT2基因, 将其与CaMV35S启动子相连接, 构建植物表达载体转化烟草并对其进行了功能验证, 发现其能提高转基因烟草的总脂肪酸含量[25]。

启动子是一段位于结构基因5° 端上游区的DNA序列, 能够使RNA聚合酶与之结合并起始目标基因转录, 是转录水平上基因表达调控的关键部位。启动子上的顺式作用元件通常含有TATA-box、CAAT-box和GC-box元件, 其中TATA-box是启动子上最具特征的序列。本研究的pAhDGAT2a中含有126个TATA-box和22个CAAT-box元件, 表明其具有典型启动子的特征。

不同的启动子都具有自己特异的调节序列, 如USE、MSP等。大多数绿色植物都包含若干个光应答元件(light response element), 如G-box[31, 32]、I-box[31]、GT1元件(或GATA元件)[33]、AT富含元件[34, 35]、Z-box[36]等, 这些作用元件对光调控的转录激活是必需的[37]。在pAhDGAT2a中也含有一些光应答元件, 而前期研究表明AhDGAT2基因在花生叶片中具有一定的表达量[25], 这些结果表明AhDGAT2的表达调控可能会受到光信号的影响。pAhDGAT2a还包含激素响应元件和胁迫诱导元件, 预示AhDGAT2a的表达受激素诱导, 并且在胁迫响应中起一定的作用。我们前期分析了AhDGAT2基因在不同胁迫(冷、干旱、盐、紫外照射、ABA、机械损伤和病害)下的表达模式, 结果表明AhDGAT2基因在受到机械损伤时表达下调最明显, 在冷、干旱、盐和紫外照射胁迫下表达量略有下降, 而在ABA处理和病害胁迫下表达显著上调[25]。这恰好与pAhDGAT2a含有多种胁迫相关元件相吻合。在他人研究中也有类似报道, 如麻风树的种子特异性启动子JcMFT1受脱落酸诱导, 是由于其含有ABA应答元件、G-box、RY repeat等元件[38]; Xu等[39]在中国华东野生葡萄中克隆了一个受白粉病和赤星病诱导表达的VpSTS诱导型启动子, 通过序列分析发现该启动子含有Box-W1、TC-rich element、ABRE、MBS、LTR等特殊元件。

图2 PCR检测转基因烟草
1~18: 转基因烟草株系; M: DL2000; +: 阳性对照; -: 阴性对照; WT: 野生型烟草。Fig. 2 PCR detection of the transgenic tobacco lines
1-18: transgenic tobacco lines; M: DL2000; +: positive control; -: negative control; WT: wide type tobacco.

图3 转基因烟草的GUS染色图
A~D: 野生型烟草; E~H: 转基因烟草; A, E: 烟草幼苗; B, F: 花; C, G: 花药和柱头; D, H: 未成熟的种子。A~C, E~G比例尺为1 cm; D, H比例尺为1 mm。Fig. 3 GUS staining of the transformed tobacco lines
A-D, wild type tobacco; E-H, transgenic tobacco. A and E: seedlings; B and F: flowers; C and G: anthers and stigmas; D and H: immature seeds. Bars = 1 cm in A-C and E-G; bars = 1 mm in D, H.

目前关于植物DGAT1基因组织特异性表达的研究有较多报道, 而关于植物DGAT2基因的组织器官特异性表达的研究较少。普遍认为大多数高等植物的DGAT1基因在各组织器官中均表达, 而DGAT2则与植物种子中特殊脂肪酸的积累有关。拟南芥DGAT1在发育中的种子、花瓣、花芽中表达量高, 而在叶和茎中表达量低[19], 大多数双子叶植物例如大豆、斑鸠菊、油菜的表达模式与拟南芥相似[14, 17, 40], 而旱金莲DGAT1只在发育的种子中表达[41]。桐树DGAT2基因在种子发育中期被较强诱导表达, 而在其他器官中表达量很低, 表明桐树DGAT2与种子中脂肪酸积累直接相关[28]。斑鸠菊、大戟、琉璃苣和蓖麻的DGAT2基因在种子发育早期高表达, 而大豆DGAT2基因在种子中的表达量很低。相反, 大豆DGAT1基因在种子中表达量较高[42]。我们前期关于AhDGAT2基因组织器官特异性表达模式研究表明, 该基因在花生的各个器官都表达, 但是在叶、花以及种子发育前期表达量较高[25]。本研究中将pAhDGAT2a构建GUS植物表达载体并转化烟草, 结果发现该序列不仅能正确启动GUS基因表达, 而且在转基因烟草的各个器官中都表达, 与我们前期研究结果一致, 但是与桐树DGAT2和大豆DGAT2的表达特点显著不同。本研究中GUS活性在转基因烟草柱头和花药中较强表达, 显示出AhDGAT2a基因在花生授粉中的重要性, 这一点在其他文献中未见报道。这些研究均表明, DGAT1与DGAT2基因的组织器官特异性表达模式因物种而异。二者不仅在植物种子脂肪酸合成中具有重要作用, 同时对于其他组织器官内的脂肪酸合成(比如维持细胞膜脂类的动态平衡), 甚至对于植物个体的整个发育过程都具有十分重要的作用。

The authors have declared that no competing interests exist.

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