选用抗旱性不同的2个小麦品种, 其中洛麦22为抗旱品种, 豫麦48为干旱敏感品种。2011年至2014年连续3年在河南周口师范学院试验园区进行盆栽试验, 盆底直径35 cm, 上部直径40 cm, 高50 cm。盆土为沙壤土, 并施用(NH₄)₂SO₄ 1.0 g kg^-1、P₂O₅ 0.8 g kg^-1和K₂O 0.6 g kg^-1改良土壤, 土壤经风干后过筛。

小麦种子经0.1% (w/v) HgCl₂溶液表面消毒10 min, 自来水冲洗干净后, 浸种24 h, 在25℃恒温箱中催芽。选取露白约3 mm的萌动种子, 每盆播种50粒, 经过低温春化后, 每盆保留30株长势良好一致的幼苗, 每株仅留1个有效分蘖茎, 然后移至温室中。最初生长温度为25℃(昼)/15℃(夜), 空气湿度为70%, 正常供水; 之后, 随着小麦的生长发育, 逐步根据大田小麦的正常生长条件调整温室培养温度和湿度。温室采用自然光照, 阴雨天用强度600 μ mol m^-2 s^-1日光灯光照。

从小麦开花授粉第10天开始进行6种处理, 每处理30盆, 3次重复。(1)正常供水对照, 用TEN60水势仪(南京思欧仪器设备有限公司)监测土壤水势, 使之介于-0.02 MPa至-0.03 MPa之间; (2)干旱胁迫, 采用土壤自然干旱, 水势保持在-0.10 MPa至-0.12 MPa之间, 超过阈值时适当补水; (3)干旱胁迫+喷施Spd; (4)干旱胁迫+喷施Spm; (5)干旱胁迫+喷施MGBG; (6)干旱胁迫+喷施O-Phen。对各处理叶片和穗喷施等量液体, 喷施量为每盆20 mL, 每天6:00和18:00各喷一次, 喷10天, Spd、Spm、MGBG和O-Phen的浓度均为1 mmol L^-1, 对照喷清水。于处理后第0、第2、第4、第6、第8和第10天的6:00取旗叶和穗中部籽粒, 每次取每处理长势一致30株。3个重复的平均值为当年测定数据。

按Du等^[15]描述的方法测定旗叶相对含水量和相对质膜透性。

取穗中部籽粒200粒, 烘干后称重。为了消除品种差异, 以籽粒相对干物质增长速率来表示籽粒的增长速率。相对干物质增长速率(%) = 处理的干物质增长速率/对照的干物质增长速率 × 100; 干物质增长速率(%) = (第n天的籽粒干重 - 第0天的籽粒干重)/第0天的籽粒干重 × 100。

小麦成熟后, 取每处理30个长势一致穗, 计数1000粒称重。

取穗中部籽粒, 用解剖刀在解剖镜下小心剥出完整胚, 按照Kiriakos等^[16]的方法, 稍作修改测定多胺含量。取0.2 g小麦鲜胚放入研钵, 加预冷的5%高氯酸2 mL匀浆, 4℃提取1 h。

测定游离态多胺时, 将提取液12 000 × g离心30 min; 上清液经苯甲酰化后加乙醚真空干燥, 再用甲醇溶解, 然后用0.45 μ m滤膜过滤, 取5 μ L进样。采用同样方法制Put、Spd和Spm标样。用Waters 2695高效液相色谱仪(HPLC)检测Put、Spd和Spm含量。洗脱液为64% (v/v)甲醇, 设流速为0.7 mL min^-1, 柱温为25± 1℃。254 nm波长下测定多胺浓度, 单位为nmol g^-1 FW。

测定ASCC-PA和AISCC-PA含量时, 提取液15 000× g离心20 min, 取上清液2 mL检测ASCC- PA, 取2 mL NaOH (1 mol L^-1)悬浮沉淀(AISCC-PA存在于沉淀中)。将上述2 mL的沉淀悬浮液和上清液再各加入2 mL浓盐酸(12 mol L^-1), 转入医用安培瓶中, 用酒精喷灯把玻璃瓶口熔化, 拉丝封口, 然后放入烘箱中, 在高温(110℃)条件下水解一昼夜, 放凉后取出瓶, 敲掉瓶口, 把内容物倒进漏斗滤纸过滤, 以除去碳化材料, 用小瓷钵接收过滤液, 然后在通风橱内, 把小瓷钵放在70℃的水浴锅中, 将盐酸蒸发, 再加入1 mL高氯酸(5%), 吸取0.5 mL溶解液, 按照上述测定游离态多胺方法苯甲酰化后, 用Waters 2695 HPLC测定结合态多胺含量, 单位为nmol g^-1 FW。

用Microsoft Excel 2007整理数据并制图, 用SPSS10.0软件中Duncan’ s多重比较检验法进行差异显著性分析。

干旱胁迫下, 两小麦品种的旗叶相对含水量(图1-A, B)、籽粒相对干物质增长速率(图1-C, D)和千粒重(表1)下降, 但是洛麦22的下降幅度小于豫麦48, 特别是干旱胁迫后期, 豫麦48的降幅明显大于洛麦22, 其千粒重的降幅也明显大于洛麦22。2个品种的旗叶相对质膜透性(图1-E, F)的动态变化与上述的旗叶相对含水量、籽粒相对干物质增长速率和千粒重的变化相反。这些结果验证了洛麦22的抗旱性强于豫麦48。外源Spd和Spm处理, 则显著抑制了干旱胁迫下旗叶相对含水量、籽粒相对干物质增长速率和千粒重的下降以及相对质膜透性的上升, 说明外源Spd和Spm明显促进了豫麦48的抗干旱胁迫能力, 外源Spd和Spm对洛麦22的这些抗旱性指标影响不大。抑制剂MGBG和O-Phen显著促进了洛麦22在干旱胁迫下旗叶相对含水量、籽粒相对干物质增长速率和千粒重的下降以及相对质膜透性的上升, 表明这2种抑制剂均明显降低了洛麦22的抗旱性。

干旱胁迫诱导两小麦品种发育胚中的3种游离态多胺含量上升, 品种间存在差异。豫麦48的游离态Put上升幅度大于洛麦22, 特别是干旱胁迫后期, 豫麦48的游离态Put一直处于较高水平, 而洛麦22的游离态Put前期水平较高, 后期显著下降(图2-A, B)。干旱胁迫前期两品种的游离态Spd和Spm含量都表现为升高, 且品种间无明显差异, 但胁迫后期, 洛麦22的游离态Spd和Spm上升幅度远大于豫麦48; 外源Spd和Spm处理后明显促进了两品种游离态Spd和Spm的上升(图2-C, D, E, F), 特别是豫麦48。MGBG则显著促进了洛麦22在胁迫后期内源游离态Put的上升(图2-A), 并明显抑制其后期内源游离态Spd和Spm (图2-C, E)的上升。

图1

Fig. 1

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图1 不同处理对小麦旗叶相对含水量(A, B)、籽粒相对干物质增长速率(C, D)和旗叶相对质膜透性(E, F)的影响 Control: 正常供水; DS: 干旱胁迫。为消除品种间差异, 以对照的籽粒干物质增长速率为基础(100%), 计算各处理的籽粒相对干物质增长速率(C, D)。Fig. 1 Effects of different treatments on relative water content of flag leaf (A, B), relative increased rate of grain dry weight (C, D), and relative plasma membrane permeability of flag leaf (E, F) in wheat Control: well-watered condition; DS: drought stress. Relative increased rate of grain dry matter (C, D) was adopted to eliminate the genotypic difference, which was calculated on the basis of grain dry matter increased rate of control (100%).

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同处理对洛麦22和豫麦48千粒重的影响 Table 1 Effect of different treatments on 1000-grain weight (g) 品种 Variety 对照 Control 干旱胁迫 DS DS+Spd DS+Spm DS+MGBG DS+O-Phen 洛麦22 Luomai 22 55.7± 6.1 a 39.6± 4.9 b 41.3± 5.1 b 40.7± 4.8 b 28.4± 3.2 c 23.4± 3.3 c 豫麦48 Yumai 48 57.2± 5.9 a 26.4± 3.1 c 36.6± 4.2 b 34.9± 4.1 b 23.6± 2.8 cd 20.9± 3.1 d Data are means ± standard deviations (SD) over three years with three replicates per year. In each variety, different letter after SD indicate significant difference among treatments (P< 0.05). DS: drought stress. 数据为3年结果的平均值± 标准差, 每年试验设3次重复。同一品种中, 标准差后的不同字母表示处理间差异显著(P< 0.05)。

表1 不同处理对洛麦22和豫麦48千粒重的影响 Table 1 Effect of different treatments on 1000-grain weight (g)

图2

Fig. 2

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	图2 不同处理对小麦发育胚游离态多胺含量的影响Fig. 2 Effect of different treatments on contents of free polyamines in developing wheat embryos

干旱胁迫下, 两品种发育胚中的ASCC-Put、ASCC-Spd和ASCC-Spm都上升。ASCC-Put在干旱胁迫前期呈上升趋势, 到后期稳定在一个较高的水平上, 品种间无明显差异(图3-A); 随着胁迫时间的延长, 两品种发育胚中的ASCC-Spd和ASCC-Spm含量都有所上升, 但升高幅度无规律性(图3-B, C)。

图3

Fig. 3

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	图3 干旱胁迫(DS)对小麦发育胚中酸可溶性共价结合态(ASCC)多胺含量的影响Fig. 3 Effects of drought stress (DS) on the levels of acid soluble covalently conjugated polyamines (ASCC-PA) in developing wheat embryos

干旱胁迫后, 小麦发育胚中的AISCC-Spd和AISCC-Spm含量随胁迫时间延长呈持续上升趋势, 明显高于对照, 且两品种表现一致(图4-C, D, E, F); 而AISCC-Put含量变化在品种间差异明显, 抗旱性品种洛麦22在处理后第4天AISCC-Put含量急剧升高, 上升幅度明显大于干旱敏感性品种豫麦48 (图4-A, B)。干旱胁迫同时用O-Phen处理, 则显著抑制了干旱所诱导的AISCC-Put水平升高, 特别是洛麦22。

图4

Fig. 4

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	图4 干旱胁迫(DS)和O-Phen对小麦发育胚中酸不溶性共价结合态(AISCC)多胺含量的影响Fig. 4 Effects of drought stress (DS) and O-Phen on acid insoluble covalently conjugated polyamines (AISCC-PA) level in developing wheat embryos

多胺参与植物的抗逆胁迫反应^[17], 而植物中游离态多胺的功能目前尚存争议, 特别是在逆境胁迫下, 游离态Put的升高对植物提高抗旱性的意义是争论的焦点。多数研究认为, 逆境条件下游离态Put水平升高对植物是一种伤害反应, 水稻盐胁迫^[18]、大田花生喷施Put^[19]和燕麦转精氨酸脱羧酶^[20]等研究结果都证实游离态Put对植物的伤害; 然而, 也有学者认为逆境胁迫下游离态Put升高是植物的一种适应性反应^{[21, 22]}。本研究结果显示, 抗旱性差异明显的两品种在干旱胁迫前期的游离态Put水平都急剧上升(图2-A, B), 且品种间没有显著差异, 而在后期抗旱性品种洛麦22有较高水平的游离态Spd和Spm (图2-C, E)。为了验证高水平的游离态Spd和Spm是否由游离态Put转化而来, 采用了游离态Put向游离态Spd和Spm转化参与酶的抑制剂MGBG, 发现MGBG在抑制洛麦22胚中游离态Put向游离态Spd和Spm转化(图2-A, C, E)的同时, 也显著降低了该品种的抗旱能力(图1和表1)。外施Spd和Spm后, 在提高豫麦48胚中游离态Spd和Spm水平(图2-D, F)的同时, 也显著提高该品种的抗旱性(图1和表1)。结合前人研究有关胁迫下游离态Put升高意义的争论, 以及大量文献所报道的游离态Spd和Spm在干旱胁迫下含量上升是植物的一种积极保护效应^{[7, 23, 24]}, 我们认为, 小麦抗旱性高低与干旱胁迫前期游离态Put升高无关, 而取决于前期升高的游离态Put能否在后期转化为游离态Spd和Spm。

在干旱胁迫下, 为什么是游离态Spd和Spm, 而不是游离态Put发挥作用呢?可能重要归因于它们在生理pH范围内所呈现的多聚阳离子特性^[25]。在干旱胁迫下, 由于游离态Spd和Spm比游离态Put携带更多的阳离子, 所以更容易与细胞内的呈阴离子状态的酸性蛋白质和生物膜磷脂非共价结合, 从而保护这些生物大分子在胁迫条件下不被破坏, 维持构象和功能的稳定。我们的前期研究也表明, 胚中游离态多胺非共价结合在细胞质膜上的酸性蛋白质或者生物膜磷脂上, 提高干旱胁迫下的质膜H⁺-ATPase活性^[15]。H⁺-ATPase通过维持跨质膜的质子浓度梯度, 实现细胞内外正常的物质运输, 提高抗旱性和籽粒产量。

有人认为植物体内ASCC-PA是游离态PA的临时储存库^{[26, 27]}。多数研究表明, 这种形态多胺与植物生殖器官发育关系密切^{[28, 29]}。对于这种形态的多胺与逆境胁迫关系的研究虽然也有所报道, 但是多集中在低温胁迫^[27]和抗病能力方面^{[30, 31]}。就目前掌握的文献, 尚未见ASCC-PA与干旱胁迫关系的报道。本研究观测了干旱胁迫下发育胚中ASCC-PA的动态变化, 发现ASCC-PA与干旱胁迫似乎没有直接关系, 因为该种形态的3种多胺ASCC-Put、ASCC- Spd和ASCC-Spm虽然在胁迫时都上升, 但是它们的动态变化缺乏规律性, 且品种间也没有表现出明显差异(图3)。作为临时储存库, 无论抗性强或者弱的品种都具备这样的临时储存能力, 而是否能把储存库里的ASCC-PA顺利提取出来就要看不同品种的抗性大小了。

有关AISCC-PA与逆境胁迫关系的研究也并不多见, 赵福庚等^[32]通过大麦幼苗耐盐试验, Kong等^[33]利用白杉愈伤组织研究, 先后报道了游离态Put向AISCC-Put的转化提高了植物抗逆性。本研究在小麦灌浆期干旱胁迫下试验, 取得了一致的结果, 暗示游离态Put向AISCC-Put的转化有利于提高小麦对干旱胁迫的抗性。本试验胁迫后期, 抗旱性品种洛麦22胚中AISCC-Put的水平显著升高(图4-A), 而干旱敏感性品种豫麦48的升幅不明显(图4-B); 用抑制剂O-Phen处理后验证了这一结果, O-Phen显著抑制干旱诱导的洛麦22胚中AISCC-Put水平升高(图4-A), 同时也明显降低了洛麦22的耐旱性(图1和表1)。AISCC-Spd (图4-C, D)和AISCC-Spm (图4-E, F)的水平都随着胁迫时间延长比对照有所升高, 但两品种的升高幅度没有明显的差异, 暗示这2种形态的多胺与小麦的抗旱性关系不大。