小麦品种郑引1号, 由西北农林科技大学生命科学学院中心实验室提供。将小麦种子经75%酒精消毒2 min, 蒸馏水浸泡6 h, 置培养皿中培养。培养条件为光/暗16 h/ 8 h, 昼/夜温度25℃/19℃。当小麦长到二叶一心期时, 分别进行干旱(10%的PEG-6000)、低温(4℃培养箱)、盐(500 mmol L^-1NaCl溶液)和外源ABA (100 μ mol L^-1ABA溶液)处理。在处理0、12、24、36、48和60 h取样, 液氮速冻后保存于-80℃。

取干旱处理2 d小麦叶片, 在液氮中研磨, 按照TRIzol试剂(Invitrogen)的操作说明, 提取小麦幼苗总RNA。以提取的RNA为模板, 按照反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)的操作说明反转录成cDNA。

根据大麦DNH5 (GenBank登录号为AF181455)的cDNA序列设计引物(F1: 5′ -ATGCACGACGCCGAC-3′ ; R1: 5′ -TTAGTTCAGTCCAGGC-3′ ), 以小麦cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系20 μ L, 包含2× Taq PCR Supermix (全式金公司) 8 μ L, cDNA模板1 μ L, 上、下游引物各1 μ L, ddH₂O 9 μ L。PCR反应参数为94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 63℃ 30 s, 72℃ 1 min, 35个循环; 72℃ 10 min。将扩增产物回收(天根公司), 连接到pMD18-T载体上, 转化TOP10感受态细胞, 涂板, 挑单克隆, 菌液PCR检测, 送3个阳性菌落到上海生工生物工程有限公司测序。

利用DNAMAN分析wzy2-1基因序列及蛋白序列; 通过Blast, 利用MEGA5.0对wzy2-1进行同源性分析。利用ExPAsy软件(http://web.expasy.org/protscale/)对WZY2- 1蛋白进行疏水性预测; 利用Metaprediction软件(http:// iimcb.genesilico.pl/metadisorder/metadisorder.html)对WZY2-1蛋白无序化程度进行分析^{[13, 19]}。

设计含有Xho I和BamH I酶切位点的引物(F: 5′ -CGCGGATCCATGCACGACGCCGAC-3′ ; R: 5′ -CCGCT CGAGTTAGTTCAGTCCAGGC-3′ ), 以pMD18-T-wzy2-1质粒为模板进行PCR扩增, 回收产物, 然后对产物和pET28a质粒酶切。酶切体系20 μ L, 含PCR产物或pET28a质粒10 μ L, Xho I 1 μ L, BamH I 1 μ L, 10× K buffer 2 μ L, ddH₂O 6 μ L。将酶切产物进行胶回收, 再将回收的PCR产物和pET28a质粒进行16℃连接, 转化TOP10感受态细胞, 涂板, 挑单克隆, 双酶切检测, 选3个阳性菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将构建好的原核表达载体pET28a-wzy2-1转入大肠杆菌BL21 (DE3), 经0.2 mmol L^-1IPTG诱导0、2、4、6、8 h, 收集3 mL菌体, 10 000× g离心2 min, 加入1 mol L^-1Tris-HCl 100 μ L和 2× 蛋白loading buffer 100 μ L, 在沸水浴中煮10 min, 冰上冷却, 10 000× g离心10 min, 取上清液10 μ L进行SDS-PAGE检测, 并且用K片段抗体进一步验证^{[20, 21]}。

将转pET28a-wzy2-1和pET28a空载体的大肠杆菌BL21 (DE3)接种到50 mL液体LB中, 于37℃摇床培养至OD值为0.6, 再加入0.2 mmol L^-1IPTG诱导2 h。取该诱导菌液1 mL, 加入含10% PEG-6000、500 mmol L^-1NaCl或500 mmol L^-1KCl的50 mL液体LB中, 测定波长600 nm下每小时的菌液OD值, 以无处理的菌液作对照。

采用涂板技术法进行目的基因表达蛋白对大肠杆菌的温度耐逆性分析。对IPTG诱导2 h的重组菌和空菌进行45℃ 30 min或者-20℃ 2 h的处理, 然后稀释1000倍, 于37℃过夜, 统计菌落数, 以无胁迫处理作对照, 计算菌存活率^{[11, 22]}。

提取不同处理的小麦样品RNA, 以小麦β -actin (KC775780.1)为内参基因进行定量RT-PCR分析。引物序列为wzy2-1-F: 5′ -CGGAGTGACCGATAAGG-3′ , wzy2-1- R: 5′ -TGCCAGTTGTTTCGTTGT-3′ ; actin-F: 5′ -TCCAATC TAGGGATACACGC-3′ , actin-R: 5′ -TCTTCATTAGATTAT CCGTGAGGTC-3′ 。反应体系25 μ L, 包括2× SYBR Premix 12.5 μ L, 模板2 μ L, 上、下游引物各1 μ L。反应程序为95℃预变性30 s, 然后95℃ 5 s, 55℃, 20 s, 39个循环。

以干旱处理24 h的小麦RNA为模板, 反转录得到cDNA, 利用合成的特异引物F1/R1扩增得到1740 bp的产物。回收该产物, 并连接到pMD18-T载体上, 转入大肠杆菌TOP10中。通过对阳性菌落测序, 得到完整开放阅读框序列, 定名为wzy2-1基因, 提交到GenBank, 登录号为KU230444。

利用DNAMAN软件分析表明, wzy2-1编码产物由579个氨基酸组成, 其分子量约为60.3 kD, 等电点为5.8; 该蛋白含有9个保守的K片段基序, 属于典型的Kn型脱水素(图1)。利用MEGA5.0构建了wzy2-1基因的系统进化树, 发现wzy2-1和大麦的脱水素基因Dhn5具有较高的同源性(图2)。利用ExPAsy软件(http://web.expasy.org/ protscale/)分析表明, WZY2-1蛋白平均疏水系数为-1.307 (图3), 具有较强的亲水性。用Metprediction (http://iimcb. genesiico.pl/metadisorder/metadisorder.html)软件分析表明, WZY2-1蛋白是无序状蛋白(图4)。以上结果显示, WZY2-1蛋白在生理条件下是一种高度亲水性的无序蛋白, WZY2-1蛋白属于IDPs家族。

图1

Fig. 1

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	图1 wzy2-1基因编码的氨基酸序列 下画线表示保守的K片段。Fig. 1 Amino acid sequence of wzy2-1gene Conserved sequences of K fragment are underlined.

图2

Fig. 2

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图2 小麦wzy2-1基因编码区与多种植物脱水素基因的遗传进化树 DHN5: 大麦; DHN4: 伞穗山羊草; DHN: 高粱; WCS66: 小麦; ESI18-2: 长穗偃麦草; WSC120: 小麦; DHN3: 伞穗山羊草; WZY2-1: 小麦; Rab 16B-Like: 短花药野生稻; DHN1: 雀稗COR39: 小麦; SPV462: 高粱。Fig. 2 Phylogenetic tree ofwzy2-1 and other dehydrin genes from different plant species DHN5: Hordeum vulgare; DHN4: Aegilops umbellulata; DHN: Sorghum bicolor; WCS66: Triticum aestivum; ESI18-2:Lophopyrum elongatum; WCS120: Triticum aestivum; DHN3: Aegilops umbellulata; WZY2-1: Triticum aestivum; Rab 16B-Like: Oryza brachyantha; DHN1: Paspalum quadrifarium; COR39: Triticum aestivum; SPV462: Sorghum bicolor.

图3

Fig. 3

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	图3 WZY2-1蛋白的疏水性预测Fig. 3 Hydrophobicity prediction of WZY2-1 protein

图4

Fig. 4

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	图4 WZY2-1蛋白无序化程度预测Fig. 4 Disorder prediction of WZY2-1 protein

构建了pET28a-wzy2-1原核表达载体, 并用0.2 mmol L^-1IPTG诱导重组菌BL21 (DE3), 通过对热溶性蛋白SDS-PAGE电泳检测, 发现在100 kD附近有一条带, 比预测的结果偏大, 这可能是K片段与蛋白胶的特殊作用导致电泳条带略滞后移。Western blot验证结果显示, 该条带是WZY2-1重组蛋白(图5)。

图5

Fig. 5

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	图5 用K片段抗体进行Western blot验证Fig. 5 Western blot with K-fragment antibody

在正常条件下, 重组菌和对照菌生长情况基本一致, 但在10% PEG-6000、500 mmol L^-1NaCl和500 mmol L^-1KCl处理后, 重组菌表现出较好的生长趋势(图6), 说明WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对逆境胁迫的耐受性。分别将对照菌和重组菌进行45℃ 30 min和-20℃ 2 h处理, 结果表明, 重组菌的存活率显著高于对照菌(图7), 说明重组菌对温度胁迫有较高的耐受性。

图6

Fig.6

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	图6 不同处理条件下重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)的生长曲线Fig.6 Growth of recombinant (wzy2-1) and control E. coli(Epet) under different treatments

在冷胁迫处理下, wzy2-1基因表达量在12 h达到最高, 为对照的30倍; 在盐胁迫处理下, wzy2-1基因的表达量在36 h达到最高, 是对照的30倍; 然而在干旱胁迫下, 直到48 h wzy2-1的表达量才达到峰值, 是对照的8倍(图8)。同时还发现, 在ABA处理条件下, wzy2-1基因表达量在60 h内没有明显上调的趋势(图8)。推测wzy2-1基因属于非ABA依赖型的冷、渗透、干旱响应的脱水素基因。

图7

Fig. 7

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图7 重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)在经45℃ 30 min和-20℃ 2 h处理后的存活率 柱状图上星号表示重组菌(wzy2-1)和对照菌(Epet)存活率的差异显著性(* , P< 0.05; * * , P< 0.01)。Fig. 7 Survival rate of recombinants (wzy2-1) and controlE. coli (Epet) under 45 ° C for 30 min and -20° C for 2 h conditions Different asterisk on top of bars indicate the significant differences of the survival rate between recombinants (wzy2-1) and control E. coli(Epet) (* , P< 0.05; * * , P< 0.01).

图8

Fig. 8

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	图8 不同胁迫处理下小麦叶片wzy2-1基因的表达模式Fig. 8 Transcript accumulation ofwzy2-1 in wheat leaves in response to different abiotic stresses as determined by qRT-PCR