甘蔗叶片cDNA文库、供试甘蔗品种热带种Badila和健康本氏烟苗株, 均由福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室提供^[15]。

使用Badila组培苗研究目的基因受不同外源胁迫后的表达特性。参照侯朝祥等^[16]方法, 采用腋芽快繁技术培养Badila组培苗。待苗株高15~25 cm、出现4~5片完全展开叶时, 转移到清水中培养, 28℃下光照16 h/黑暗8 h, 复性培养1周。选取长势一致的幼苗, 进行黑暗(1、3、6和12 d)、重金属镉(50 μ mol L^-1 CdCl₂, 12、24和48 h)、过氧化氢(10 mmol L^-1 H₂O₂, 3、12和24 h)、ABA (100 μ mol L^-1ABA, 3、12和24 h)、高盐(250 mmol L^-1 NaCl, 6、12和24 h)和模拟干旱(25% PEG-8000, 6、12和24 h)胁迫处理, 每个处理3个重复, 每个重复3株, 以正常生长条件下的甘蔗幼苗作为对照。另外, 在田间随机选取9株处于分蘖期且长势一致健康的Badila植株, 分成3组, 每组3株。取其白色嫩根、心叶(未展开的叶)、+1叶(甘蔗最高可见肥厚带的第一叶)、侧芽、叶鞘和蔗茎, 用于研究目的基因的空间表达特性。取样后立即将样品用液氮速冻, 置-80℃冰箱保存备用。

采用TRIzol试剂提取样品总RNA, 取1.0 μ L RNA, 以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。使用 Nanodrop (Thermo Scientific, USA)测定RNA的浓度, 按照Prime Script RT Reagent Kit使用说明书, 将RNA反转录成cDNA。

对甘蔗叶片cDNA文库进行大规模测序和生物信息学分析^[15]。挑取含有目的基因的克隆测序, 获得目的基因的序列。利用NCBI的ORF finder软件, 分析所获cDNA序列的开放阅读框及其推测氨基酸序列, 利用ProtParam (http://expasy.org/tools/protparam.html)预测一级结构, 利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽分析, 利用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.

dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构域分析, 利用Cell-PLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-

PLoc/)进行亚细胞定位分析, 利用Motif Scan (http://prosite.expasy.org/)和Inter Proscan (http://www.

ebi.ac.uk/interpro/scan.html)进行功能结构域分析,

利用DNAMAN进行多序列比对, 利用ClustalX和MEGA5.1构建系统进化树。

根据测序获得ScLhca3的开放读码框(ORF), 设计带有合适酶切位点的特异性引物(表1), 以ScLhca3质粒为模板, 扩增并回收目的基因片段。回收产物经BamH I和EcoR I酶切后, 用T4 DNA连接酶连接到同样双酶切的原核表达载体pGEX-6P-1, 然后转化至大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 进行阳性克隆子筛选, 提取阳性克隆质粒用BamH I和EcoR I双酶切鉴定, 将阳性克隆送上海生物工程有限公司测序, 测序结果正确的阳性克隆即为重组质粒, 命名为pGEX-6P-1-ScLhca3。将空质粒pGEX-6P-1和重组质粒pGEX-6P-1-ScLhca3转化入大肠杆菌Rosetta (DE3)中, 挑取单菌落, 接种至含有氨苄青霉素(50 mg L^-1 Amp⁺)的LB液体培养基中, 37℃培养过夜。取1 mL培养物接种至20 mL LB液体培养基(含50 mg L^-1 Amp⁺)中培养至OD₆₀₀为0.6时, 加入终浓度为1 mmol L^-1的IPTG, 37℃诱导12 h, 每2 h取样1 mL。分别取样品300 μ L, 4℃ 8000 × g离心10 min后收集菌体, 加入30 µ L蛋白上样缓冲液, 沸水浴5 min, 常温下12 000 × g离心5 min, 取10 µ L上清液经12% SDS-PAGE电泳检测融合蛋白的表达。

以ScLhca3-GFP-F和ScLhca3-GFP-R为引物(表1), ScLhca3质粒为模板, 扩增ScLhca3完整的ORF。PCR产物经Xba I与BamH I双酶切后, 连入同样双酶切处理的亚细胞定位载体pCAMBIA1302, 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞, 经PCR、双酶切和测序鉴定后, 得到植物表达载体pCAMBIA1302- ScLhca3。按照Green等^[17]的方法将植物表达载体转入农杆菌EHA105, 通过菌落 PCR鉴定重组农杆菌。然后取健康的本氏烟叶片, 参照Sparkes等^[18]农杆菌侵染方法, 将重组农杆菌注射入健康的本氏烟叶片, 48 h后在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5 II)下观察本氏烟叶片表皮细胞中ScLhca3蛋白的定位结果。

根据ScLhca3基因的ORF序列, 设计特异性实时荧光定量PCR引物, 以Badila各组织及各胁迫后的叶片cDNA为模板, 以GAPDH基因(表1)为内参基因^[19], 按照SYBR Green PCR Master Mix Kit (Roche)说明书配置定量反应体系。实时荧光定量PCR扩增程序为: 50℃ 2 min; 95℃ 10 min; 95℃ 15 s、60℃ 1 min, 循环40次。每个样品设置3次重复, 以无菌水作对照, 采用2^{-Δ Δ Ct}算法进行基因表达水平分析^[20]。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 实验中用到的扩增引物 Table 1 Primers used in this study 引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequence (5′ → 3′ ) 目的 Strategy ScLhca3-GFP-F TGCTCTAGAATGGCAGCTCAGGCTCTCC 亚细胞定位Subcellular localization ScLhca3-GFP-R CGCGGATCCGTGGAACTTGAGGCTGGTG 亚细胞定位Subcellular localization ScLhca3-6P-F CGCGGATCCATGGCAGCTCAGGCTCTCC 原核表达 Prokaryotic expression ScLhca3-6P-R CCGGAATTCGTGGAACTTGAGGCTGGTG 原核表达 Prokaryotic expression ScLhca3-QF CGACTCCTACACGCTCTT 荧光定量 Real-time PCR ScLhca3-QR TCTCCTTCTCGGTCTTGC 荧光定量 Real-time PCR GAPDH-QF CACGGCCACTGGAAGCA 荧光定量 Real-time PCR GAPDH-QR TCCTCAGGGTTCCTGATGCC 荧光定量 Real-time PCR 下画线部分表示酶切位点。Sequences underlined indicate enzyme restriction site.

表1 实验中用到的扩增引物 Table 1 Primers used in this study

在对甘蔗叶片cDNA文库大规模测序的过程中, 发现了1个与玉米基因(XM_008660371.1)同源性高达96%的基因片段, 序列分析显示, 该基因片段长1009 bp, 包含一个804 bp的ORF, 编码267个氨基酸(图1), 被命名为ScLhca3(GenBank登录号为KU215669)。

图1

Fig. 1

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	图1 获得的ScLhca3基因的cDNA全长序列及其氨基酸序列 * 终止密码子Fig. 1 cDNA sequence and amino acid sequence of ScLhca3gene obtained * stop codon.

ProtParam分析表明, ScLhca3基因编码的蛋白的分子量为28.91 kD, 等电点为8.96, 不稳定系数为36.56, 脂溶指数为83.75, 总平均疏水性是-0.068, 表明该蛋白可能是一种亲水蛋白。利用SignalP 4.1 Server在线软件对ScLhca3蛋白的信号肽预测表明, 该蛋白不含信号肽, 是非分泌蛋白。根据TMHMM Server v. 2.0在线分析, ScLhca3蛋白具有3个明显的跨膜区域, 分布在第95~121、第137~160、第220~ 249位区域, 膜向性分别为i→ o、o→ i、i→ o。用Cell-PLoc进行亚细胞定位分析表明, ScLhca3蛋白定位于叶绿体。使用 Inter Proscan和Motif Scan在线分析软件对 ScLhca3蛋白进行分析, 显示第55~238位包括一个典型的捕光叶绿素a/b结合蛋白功能域(chlorophyll a/b binding domain); 第8~10、第25~27、第208~210和第263~265位为蛋白激酶C的磷酸化位点(protein kinase C phosphorylation site); 第58~61、第76~79和第208~211位为酪蛋白激酶II磷酸化位点(Casein kinase II phosphorylation site); 第62~67、第104~109和第237~242位为N-肉豆蔻酰位点(N-myristoylation site)。

使用NCBI网站的Blastp搜索ScLhca3的同源序列, 选择玉米(Zea mays, XP_008658593.1)、谷子(Setaria italica, XP_004965906.1)、水稻(Oryza sativa, BAD25284.1)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon, XP_010233979.1)、乌拉尔图小麦(Triticum urartu, EMS56059.1)、拟南芥(Arabidopsis thaliana, NP_ 001185280.1)、大豆(Glycine max, NP_001276264.1)、 葡萄(Vitis vinifera, XP_002273201.1)、盐芥(Eutrema halophilum, BAJ33764.1)、豌豆(Pisum sativum, AAA84545.1)的Lhca3蛋白序列进行氨基酸同源性分析。结果如图2所示, 甘蔗ScLhca3蛋白与其他物种Lhca3蛋白在N端保守性较差, C端有较大的保守性, 且与玉米、谷子、水稻、乌拉尔图小麦和二穗短柄草的蛋白相似度分别为98.5%、98.8%、82.1%、81.4%和81.7%, 表明ScLhca3基因编码的氨基酸序列与单子叶植物的同源性较高。

图2

Fig. 2

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	图2 甘蔗ScLhca3蛋白与其他植物种蛋白的氨基酸序列比对Fig. 2 Homology analysis of sequences from sugarcane ScLhca3 and those of other species

以莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii, XP_ 001701405.1)的Lhca3蛋白序列作为外源序列, 使用ClustalX和MEGA5.1软件, 采用NJ法(BootStrap 1000)构建进化树, 分析ScLhca3蛋白与其他物种Lhca3蛋白的进化关系, 结果如图3所示。单子叶植物和双子叶植物的Lhca3蛋白明显属于两大不同的分支, 且在单子叶植物分支中, 甘蔗与同属C₄植物的玉米和谷子为同一分支, 而同属C₃植物的水稻、小麦和二穗短柄草为另一分支。这表明, 该基因在遗传进化上具有明显的种属差异性, 它们对应的蛋白属于同一个家族。

图3

Fig. 3

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	图3 不同物种Lhca3基因编码蛋白的系统进化分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of proteins encoded by Lhca3 gene from different plant species

将重组质粒测序, 并用BamH I和EcoR I双酶切电泳检测。从图4泳道2中可以看出, 重组质粒经过双酶切之后电泳结果出现5000 bp左右的载体片段和800 bp左右的目的基因, 结合测序结果证明, ScLhca3和表达载体pGEX-6P-1重组成功。图5中重组质粒SDS-PAGE电泳结果显示, 在分子量54 kD左右处可见一条特异性条带, 且随诱导时间的延长, 蛋白浓度逐渐增加。ScLhca3蛋白约为28.91 kD, 加上pGEX-6P-1载体上26 kD大小的GST标签蛋白, 因此与预测的蛋白大小基本相符, 可以确定该融合蛋白成功表达。

图4

Fig. 4

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	图4 重组质粒双酶切鉴定 M: DNA marker 15000+2000 bp; 1: pCAMBIA1302-ScLhca3双酶切鉴定; 2: pGEX-6P-1-ScLhca3双酶切鉴定。Fig. 4 Double restriction enzyme digestion for recombinant plasmid M: DNA marker 15000+2000 bp; 1: Double restriction enzyme digestion of pCAMBIA1302-ScLhca3; 2: Double restriction enzyme digestion of pGEX-6P-1-ScLhca3.

图5

Fig. 5

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图5 pGEX-6P-1-ScLhca3原核表达产物的SDS-PAGE分析 M: 蛋白质分子质量标准; A: 未诱导空质粒; B: IPTG 诱导12 h后的空质粒; C: 未诱导重组质粒; D~H: IPTG分别诱导2、4、6、8、10和12 h后的重组质粒。Fig. 5 Analysis of prokaryotic expression of pGEX-6P-1-ScLhca3 by SDS-PAGE M: protein molecular weight marker; A: pGEX-6P-1 without induction; B: pGEX-6P-1 after inducing for 12 hours; C: pGEX-6P-1-ScLhca3 without induction; D-H: pGEX-6P- 1-ScLhca3 after inducing for 2, 4, 6, 8, 10, and 12 hours, respectively.

重组荧光定位表达载体pCAMBIA1302-ScLhca3经酶切和测序验证后(图4泳道1), 转化到农杆菌 EHA105中, 通过烟草瞬时表达体系表达了ScLhca3和GFP的融合蛋白, 于激光共聚焦显微镜下观察融合蛋白绿色荧光在细胞中的分布, 结果如图6所示。对照GFP在烟草表皮细胞中大量表达, 绿色荧光信号在细胞质、质膜和细胞核中均有分布; 而ScLhca3-GFP融合蛋白主要定位于叶绿体中, 定位结果与生物信息学分析预测一致。

图6

Fig. 6

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图6 pCAMBIA1302-ScLhca3在本生烟表皮细胞中的定位 ScLhca3-GFP的定位如箭头所示; A: GFP对照; B: 叶绿体; C: GFP空载的明场; D: GFP空载的叠加场; E: ScLhca3-GFP; F: 叶绿体; G: ScLhca3-GFP的明场; H: ScLhca3-GFP的叠加场。Bars: 50 μ m。Fig. 6 Subcellular localization of ScLhca3 fused with GFP in the epidermal cells of N. benthamianaThe ScLhca3-GFP was labled by arrows; A: GFP control; B: Chloroplast; C: GFP vision under natural light; D: GFP overlapped vision of A, C, and B; E: ScLhca3-GFP; F: Chloroplast; G: ScLhca3-GFP vision under natural light; H: ScLhca3-GFP overlapped vision of E, F, and G. Bars: 50 μ m.

基于实时荧光定量PCR技术, 以心叶的表达量

为参照基准, 采用2^{-Δ Δ Ct}法对甘蔗各组织ScLhca3基因表达量的分析结果如图7所示。ScLhca3基因的表达具有明显的组织特异性, 在不同组织中的表达量差异较大, 其中在成熟叶片中相对表达量最高, 侧芽、心叶和叶鞘中次之, 茎中微量表达, 根中几乎不表达。

图7

Fig. 7

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	图7 ScLhca3基因在甘蔗不同组织中的表达 误差线为每组处理的标准误差(n= 3)。Fig. 7 Relative expression of ScLhca3 gene in different sugarcane tissues The error bar represents the standard error of each treating group (n= 3).

根据荧光定量PCR的数据分析ScLhca3基因在不同外源胁迫下的相对表达量, 如图8所示。ScLhca3能够被CdCl₂、H₂O₂和ABA强烈诱导上调表达。不同的是, 在CdCl₂和H₂O₂胁迫下, ScLhca3的表达量均在12 h达到最大值, 随后下降, 呈上调和恢复的模式, 但从总体看来均高于对照; 而在ABA条件下, ScLhca3的表达量则随时间的增加而增加。另外, 在黑暗、PEG和NaCl胁迫下, ScLhca3基因的相对表达量显著下调。其中, 在PEG和NaCl胁迫下, ScLhca3的表达量急剧下降; 在黑暗条件下, ScLhca3的表达量则随时间的增加呈逐渐下降趋势。

图8

Fig. 8

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图8 甘蔗ScLhca3基因在不同外源胁迫下的表达 A: ScLhca3基因在黑暗胁迫下的表达; B: ScLhca3基因在CdCl2胁迫下的表达; C: ScLhca3基因在H2O2和ABA胁迫下的表达; D: ScLhca3基因在NaCl和PEG胁迫下的表达; 误差线为每组处理的标准误差(n= 3)。Fig. 8 ScLhca3gene expression of sugarcane under different exogenous stresses A: ScLhca3gene expression of sugarcane under Darkness stress; B:ScLhca3gene expression of sugarcane under CdCl2 stress; C:ScLhca3gene expression of sugarcane under H2O2and ABA stress; D: ScLhca3gene expression of sugarcane under NaCl and PEG stress. The error bar represents the standard error of each treating group (n= 3).