引用本文
李文凤, 王晓燕, 黄应昆, 张荣跃, 单红丽, 罗志明, 尹炯. . 101份中国甘蔗主要育种亲本褐锈病抗性鉴定及 Bru1基因
的分子检测 . 作物学报, 2016, 42(9): 1411-1416
LI Wen-Feng, WANG Xiao-Yan, HUANG Ying-Fun, ZHANG Rong-Yue, SHAN Hong-Li, LUO Zhi-Ming, YIN Jiong. . Identification of Resistance to Brown Rust and Molecular Detection of Bru1 Gene in 101 Main Sugarcane Breeding Parents in China . ACTA AGRONOMICA SINICA, 2016, 42(9): 1411-1416  
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101份中国甘蔗主要育种亲本褐锈病抗性鉴定及 Bru1基因
的分子检测
李文凤, 王晓燕, 黄应昆*, 张荣跃, 单红丽, 罗志明, 尹炯
云南省农业科学院甘蔗研究所 / 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 云南开远 661699
*通讯作者(Corresponding author): 黄应昆, E-mail: huangyk64@163.com, Tel: 0873-7227017

第一作者联系方式: E-mail: ynlwf@163.com, 0873-7227004

收稿日期:2016-03-17 接受日期:2016-06-20 网络出版日期:2016-06-29
基金:本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-20-2-2)和云南省现代农业产业技术体系建设专项资助
摘要

由黑顶柄锈菌引起的甘蔗褐锈病是一种重要的世界性甘蔗病害, Bru1是甘蔗抗褐锈病主效基因, 该基因对不同地区的褐锈病分离物具有广谱抗性。为明确中国甘蔗主要育种亲本对黑顶柄锈菌的抗性水平, 了解 Bru1基因在这些亲本中的分布情况, 本研究于2014年对中国国家甘蔗种质资源圃保存的101份甘蔗主要育种亲本进行苗期抗褐锈病鉴定和抗褐锈病基因 Bru1的分子检测。结果显示, 供试亲本中, 共48份抗病材料含有抗褐锈病基因 Bru1, 频率为47.5%, 表明中国甘蔗主要育种亲本中褐锈病抗性主要由 Bru1控制; 其余29份抗病材料和24份感病材料均不含抗褐锈病基因 Bru1, 暗示除了 Bru1外, 可能还有其他抗褐锈病基因存在。研究结果为深入开展甘蔗抗褐锈病育种, 选育和推广优良抗病品种, 有效防控甘蔗褐锈病提供了科学依据和优良抗性亲本。

关键词: 甘蔗; 主要育种亲本; 抗褐锈病基因 Bru1; 分子检测
Identification of Resistance to Brown Rust and Molecular Detection of Bru1 Gene in 101 Main Sugarcane Breeding Parents in China
LI Wen-Feng, WANG Xiao-Yan, HUANG Ying-Fun*, ZHANG Rong-Yue, SHAN Hong-Li, LUO Zhi-Ming, YIN Jiong
Sugarcane Research Institute, Yunnan Province Academy of Agricultural Sciences / Yunnan Key Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement, Kaiyuan 661699, China
Fund:This study was supported by China Agriculture Research System (CARS-20-2-2) and the Agriculture Research System of Yunnan Province
Abstract

Sugarcane brown rust induced by Puccinia melanocephala is an important global disease. Bru1is a major brown rust resistance gene with a broad-spectrum resistance against various brown rust pathogens originating from different countries. In order to assess the resistance level of main sugarcane breeding parents to Puccinia melanocephala, and determine the distribution of the Bru1 gene in these breeding parents in China, 101 main sugarcane breeding parents collected from the Chinese National Nursery of Sugarcane Germplasm Resources were evaluated and identified for their brown rust resistance at the seedling stage and for the presence of the brown rust resistance gene Bru1. Bru1 was detected to present in 48 (47.5%) resistant materials out of the 101 tested parental lines, indicating that brown rust resistance in main sugarcane breeding parents in China is primarily controlled by Bru1. The absence of Bru1in the other 29 resistant and 24 susceptible parental lines suggests that they may carry brown rust resistance-associated genes other than Bru1. These results may facilitate future efforts to breed varieties with improved resistance to brown rust and may provide resistant parental lines for selecting and planting elite resistant varieties to effectively control brown rust disease in sugarcane.

Keyword: Sugarcane; Main breeding parents; Brown rust resistance gene Bru1; Molecular detection

甘蔗锈病是世界性的甘蔗重要病害之一, 其病原主要有黑顶柄锈菌Puccinia melanocephala H. Sydow & P. Sydow.和屈恩柄锈菌Puccinia kuehniiButler.[1, 2]。后者发生在美国、澳大利亚、印度、拉丁美洲等国家或地区[3], 而中国大陆至今尚未见有关该菌发生的报道。

黑顶柄锈菌广泛分布于爪哇、古巴、牙买加、澳大利亚、美国、墨西哥、印度、泰国、毛里求斯等植蔗国家或地区, 并多次爆发流行, 给蔗糖产业造成极大的经济损失[2, 4, 5, 6]。在中国大陆, 阮兴业等[7] 于1982年首次报道了黑顶柄锈菌在云南蔗区的发生, 之后福建、广东、四川、江西、广西、海南等蔗区也先后报道[8, 9, 10, 11, 12]。目前, 由黑顶柄锈菌引起的甘蔗褐锈病已成为中国蔗区发生最普遍, 危害最严重的病害之一, 造成甘蔗种质退化、产量降低[8, 9]。尤其近年, 中国蔗区主栽的一批丰产高糖品种如桂糖15、桂糖17、桂引9号、P44、台糖86-1626、粤糖60、德蔗03-83、福农1110等主推新品种, 因其高度感染褐锈病而面临淘汰, 极大地影响了我国蔗糖产业的持续健康稳定发展[12]。

选育和种植抗病品种是防治甘蔗褐锈病最经济有效的措施[13, 14, 15], 其中评价和筛选抗性亲本并科学选配, 对选育抗褐锈病品种至关重要。目前, 国外研究人员已在栽培品种R570上发现和定位甘蔗抗褐锈病主效基因Bru1[16, 17], 位于甘蔗第7条染色体0.42 cM区域内, 并与高粱第4染色体大约在225 kb区域及水稻第2染色体的短臂上600 kb区域具有同线性[18], 该基因被证实对来自不同国家地区的褐锈病分离物具有广谱抗性[19], 现已开发出与Bru1密切相关的2个分子标记用于种质鉴定[20]。本课题组前期采用这2个分子标记从31份甘蔗野生核心种质资源中检测筛选到含有抗褐锈病基因Bru1的8份野生核心种质资源, 为有效开展甘蔗抗褐锈病育种提供了优良抗源种质和参考依据[21]。但是, 迄今为止, 对中国甘蔗主要育种亲本尚未进行过抗褐锈病鉴定和抗褐锈病基因标记选择, 抗褐锈病育种亲本选配存在盲目性。为此, 本研究对中国国家甘蔗种质资源圃保存的101份甘蔗主要育种亲本进行苗期抗褐锈病鉴定和抗褐锈病基因Bru1的分子检测, 了解Bru1 基因在甘蔗主要育种亲本中的分布状况, 筛选含有目标基因的抗性亲本, 以期为选育和利用抗病品种有效防控甘蔗褐锈病提供科学依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

除中国国家甘蔗种质资源圃保存的的101份甘蔗主要育种亲本(表2)外, 选用含Bru1基因抗病对照品种新台糖1号、新台糖9号[20]和模式品种R570[16], 感病对照品种印度290、选蔗3号。

1.2 苗期抗褐锈病鉴定

2014年4月在云南省农业科学院甘蔗研究所(中国云南开远), 用直径35 cm、高30 cm的塑料桶种植各材料, 桶内装入2/3的土壤和有机质(3∶ 1), 每份材料种植4桶, 4次重复, 每桶5株, 共20株, 随机排列, 常规管理。

于2014年7月28日甘蔗褐锈病发生盛期, 从云南勐海发病蔗区高感品种选蔗3号采集黑顶柄锈菌孢子直接用于接种。于2014年7月30日参照文献[21]报道的方法配制接种液, 进行喷雾接种和管理。接种后4~5周调查供试材料发病情况; 参照文献[22]的抗性鉴定评价标准。

1.3 抗褐锈病基因Bru1的分子检测

参照Costet等[20]甘蔗抗褐锈病基因Bru1的PCR标记R12H16和9O20-F4引物, 委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。R12H16标记预期扩增产物长度为570 bp, 9O20-F4标记预期扩增产物长度为200 bp。

分别采集各材料充分展开的第一片新叶提取总DNA, 以抽提的叶片总DNA为模版, 参照文献[21]的方法对各材料进行PCR扩增检测。

2 结果与分析
2.1 苗期人工接种鉴定抗病性

101份供试材料中, 1级高抗至3级中抗的有77份, 占76.2%, 。其中65份材料表现1级高抗, 占64.4%, 8份材料表现2级抗病, 占7.9%, 4份材料表现3级中抗, 占4.0%; 24份材料表现为4级中感到9级高感2, 占23.8% (表1)。

2.2 抗褐锈病基因Bru1的PCR检测

分别用R12H16标记和9O20-F4标记引物对感病对照印度290、选蔗3号和含Bru1抗病对照新台糖1号、新台糖9号、模式品种R570的DNA进行PCR扩增检测和酶切检测。结果显示, 含Bru1抗病对照新台糖1号、新台糖9号、模式品种R570均分别稳定扩增出2个标记的特异性条带, 而感病对照印度290、选蔗3号未扩出特异性条带(图1), 各样品重复检测结果一致。

图1 3个已知含抗Bru1的抗性品种和2个感病对照PCR扩增和酶切结果
A: R12H16-PCR标记; B: 9O20-F4-PCR-Rsa1标记; M: Marker; R1~R3: 已知含Bru1的抗病品种新台糖1号、新台糖9号和含Bru1模式品种R570; S1~S2: 感病品种印度290、选蔗3号。Fig. 1 PCR results and digestion of three sugarcane varieties carrying Bru1 and two susceptible varieties
A: R12H16-PCR marker; B: 9O20-F4-PCR-Rsa I marker; M: DNA ladder; R1 and R2: resistant varieties ROC1 and ROC9 that carrying Bru1; R3: model Bru1-containing variety R570; S1 and S2: susceptible varieties Co290 and Xuanzhe 3.

101份供试亲本材料中, 共48份抗病材料含有Bru1标记(表1), 频率为47.5%, 表明中国甘蔗主要育种亲本中褐锈病抗性主要由Bru1控制; 其余29份抗病材料和24份感病材料均不含Bru1标记(表1), 显示中国甘蔗主要育种亲本中抗褐锈病基因除了Bru1, 可能还有其他基因存在。

表1 甘蔗主要育种亲本褐锈病抗性及Bru1基因的PCR检测结果 Table 1 Brown rust resistance and PCR detection of Bru1 in main sugarcane ancestral species
3 讨论

明确中国甘蔗主要育种亲本对锈病的抗性水平, 了解抗褐锈病基因在中国甘蔗主要育种亲本中的分布状况, 不仅有利于评价和筛选抗性亲本和科学选配, 还能提高抗褐锈病育种的效率, 对选育抗病品种、有效防控甘蔗病害具有重要意义。本研究明确了各亲本对黑顶柄锈菌的抗性水平, 掌握了Bru1基因在这些亲本中的分布状况, 检测筛选到含有抗褐锈病基因Bru1的亲本材料48份, 为深入开展甘蔗抗褐锈病育种, 选育和推广优良抗病品种, 有效防控甘蔗褐锈病提供了优良抗性亲本、积累了基础资料。

云南是中国甘蔗野生资源重要的分布中心和世界野生甘蔗起源中心之一, 其复杂多样的地理及气候条件形成了丰富的甘蔗种质资源, 是中国乃至世界甘蔗遗传改良的天然珍贵基因库之一[23, 24]。与本课题组前期研究结果[21]一致, 本研究结果显示中国国家甘蔗种质资源圃保存的主要育种亲本中也蕴藏着优良的抗褐锈病基因Bru1, 能够提供丰富的甘蔗褐锈病的抗性亲本, 作为选育抗褐锈病甘蔗品种很有利用前景的抗源种质。Glynn等[25]对485个亲本和1072个杂交后代材料检测显示, Bru1是佛罗里达甘蔗遗传基础中褐锈病抗性的主要来源, 这与本研究的结论也是相同的。Racedo等[26]研究揭示EEAOC常用亲本材料和种质资源中除Bru1外, 还存在甘蔗褐锈病潜在替代抗性来源, 这一发现对扩大甘蔗褐锈病抗性狭窄的遗传基础有帮助。相应地, 本研究中也有29份抗褐锈病育种亲本未被检测到抗褐锈病基因Bru1, 与我们前期研究有20份抗褐锈病野生核心种质资源(多为割手密)[21]未被检测到抗褐锈病基因Bru1的结果一致, 暗示除了Bru1外, 可能还有其他抗褐锈病基因存在, 有待于进一步深入研究发掘, 从而克服抗源单一, 选择性增加其他类型抗病基因在抗病育种中的引入与利用, 避免由锈菌致病性变异引起Bru1抗性丧失的潜在威胁。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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