第一作者联系方式: 徐宁, E-mail:xunig2008@163.com; 陈冰嬬, E-mail:chenbingxu2008@126.com
采用人工气候箱内培养皿培养, 以混合碱NaHCO3∶Na2CO3(摩尔比)为9∶1模拟典型东北地区碱胁迫环境, 在萌发期以50 mmol L-1溶液处理34份绿豆品种资源, 蒸馏水处理为对照, 每培养皿放30粒种子。培养第3天测定发芽势, 第7天测定发芽率、下胚轴长、胚根长、下胚轴干重、胚根干重等指标, 通过隶属函数法和聚类分析对参试材料耐碱性综合评价, 并进行因子分析。利用隶属函数法对参试材料耐碱性排序表明, 不同绿豆品种资源间表现出较大差异, 聚类分析把参试材料按耐碱性强弱分为4大类, 白绿11等9份材料为耐碱类型, 公绿1号等19份材料为耐碱中间类型, 吉绿3号等5份材料为碱敏感类型, 潍绿7号为碱极敏感类型。因子分析结果表明, 萌发指数、下胚轴干重、胚根长分别在萌发因子、生物量累积因子和伸长因子中的负荷量最大, 可作为绿豆萌发期耐碱性鉴定的适宜指标。
Mixed alkali (NaHCO3 : Na2CO3 with the mole ratio of 9 : 1) was used to simulate the typical alkali stress environment in Northeast China. The seeds of 34 accessions of mungbean germplasm resources were treated with 50 mmol L-1 solution with distilled water as control and germinated in petri dishes for seven days. The germinating energy was measured on the third day and the germination rate, hypocotyl length, radicle length, hypocotyl dry weight, and radicle dry weight were measured on the seventh day. Through the subordinative function analysis, clustering analysis, and factor analysis, the alkali tolerance of 34 mungbean materials were evaluated. All of the materials based on subordinative function were clustered into four groups: nine accessions were tolerant to alkali, e.g. Bailyu 11, 19 accessions had midium tolerance, e.g. Gonglyu 1, five accessions were sensitive to alkali, e.g. Jilyu 3, and Weilyu 7 was strongly sensitive to alkali. The vigor index, hypocotyl dry weight, and radicle length were the most significant indexes which are recommended as the suitable indexes for identifying alkali tolerance of mungbean at germination. The results lay a foundation for alkali tolerance gene mining and variety improvement in mungbean.
吉林省绿豆种植面积、产量均约占全国水平的五分之一[1], 其种植区在吉林省西部, 该区域的盐碱地是世界公认的三大苏打盐碱土分布区之一[2], 盐碱地面积9.69× 105 hm2, 其中中度盐碱地面积为4.64× 105 hm2, 占盐碱地面积的47.90%, 重度盐碱地面积为4.44× 105 hm2, 占盐碱地面积的45.84%。Na2CO3和NaHCO3是苏打盐碱土的主要盐碱成分, 不仅具有与NaCl等中性盐胁迫相同的Na+离子毒害、渗透胁迫作用, 其大量的CO32-、HCO3-还会造成土壤pH显著升高[3], 严重干扰植物对矿质营养的吸收, 造成植物体内营养元素比例失调和植物的新陈代谢紊乱[4, 5], 碱胁迫的作用明显大于盐胁迫[6]。
培育耐盐碱的优良品种是应对土地盐碱化问题最经济有效的办法之一[7], 因此, 鉴定和评价不同绿豆品种资源的耐盐碱性, 对于有效利用盐碱化土地, 实现高产稳产, 增加农民收入, 具有重要的现实意义。有研究指出, 种子萌发期及苗期是作物在盐渍环境下生长的关键及敏感阶段[8, 9], 避开敏感时期以后, 作物在各发育时期均能较好地生长发育。因而, 目前对玉米[10, 11]、水稻[12]、大豆[13]、高粱[14]、向日葵[15]等作物耐盐碱鉴定的时期大都集中在萌发期和苗期, 而且主要采用单一成分的盐或碱进行胁迫。绿豆被公认为耐盐碱作物, 但对其萌发期耐盐碱的鉴定还未见系统报道。本研究针对吉林省西部苏打盐碱地, 以混合碱模拟其碱胁迫环境, 在萌发期调查34份品种资源的相关性状, 综合评价不同绿豆品种资源的耐碱性, 探索绿豆种质耐碱性鉴定方法, 为耐碱基因发掘与种质创新奠定基础。
34份供试材料中26份是食用豆体系近期育成的品种(系), 由吉林省农业科学院作物资源研究所、河北省农林科学院粮油作物研究所、吉林省白城市农业科学院、河北省保定市农业科学院、山东省潍坊市农业科学院提供; 8份是近几年通过精准鉴定筛选出的优异种质, 由中国农业科学院作物科学研究所提供(表1)。
采用GTOP-1000D智能光照培养箱培养。挑选大小一致、籽粒饱满的种子, 经0.1%的氯化汞溶液消毒10 min, 自来水冲洗3次, 去离子水冲洗3次, 吸干表面水分后, 接于铺双层滤纸的培养皿, 每个培养皿30粒种子。为了确定绿豆萌发期耐碱筛选的适宜浓度, 前期用吉绿3号、吉绿5号、吉绿6号、吉绿8号、洮98502、白绿6号、白绿11、冀绿7号、冀绿9号、XLD5共10份材料, 分别采用0 (CK)、25、50、75、100、125 mmol L-1混合碱(NaHCO3∶ Na2CO3的摩尔比为9∶ 1)溶液进行预试验。在浓度为25 mmol· L-1下, 发芽率及生长的相关性状与对照无明显区别。在75 mmol L-1及以上浓度下, 种子发育均明显受到抑制, 发芽率极低。在浓度为50 mmol L-1下, 品种间发芽率及相关性状有明显差异, 因此, 确定50 mmol L-1为适宜浓度, 其pH为9.12。在该浓度下鉴定34份材料, 蒸馏水作为对照, 3次重复。每个培养皿中加入25 mL蒸馏水或混合碱溶液, 于25℃智能光照培养箱避光培养, 培养箱两侧安装加湿器以补充水分。胚根与种子籽粒等长及2片子叶叶瓣完好或破裂低于1/3即为发芽。
发芽势 = 第3天发芽种子数/供试种子数× 100%; 发芽率 = 第7天发芽种子数/供试种子数× 100%; 发芽指数Gi= ∑ (Gt/Dt), 其中, Dt为发芽日数, Gt为相对应的每日发芽种子数; 活力指数Vi = 发芽指数Gi × 胚根干重。第7天测量胚根干重及长度、下胚轴干重及长度。子叶下部干重 = 下胚轴干重+胚根干重。胚根干重、下胚轴干重及子叶下部干重均以10株计。
采用平均隶属函数值法综合评价34份绿豆品种资源萌发期耐碱性。Fij = (Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin), Fi = (1/n)∑ Fij。式中, Fij为第i个材料第j个性状的隶属值, Xij为第i个材料第j个性状胁迫对非胁迫的比值; Xmax、Xmin分别为该性状中最大、最小比值。最后按材料将各性状的隶属函数值平均, 得平均隶属函数值Fi。用Microsoft Excel 2007处理基本数据, 用DPS14.10进行相关性分析、聚类分析及因子分析。其中进行因子分析时, 因子个数的选取参考2条重要原则[16], 一是使累积方差占总方差的80%以上; 二是令特征值大于等于1。
在50 mmol L-1混合碱液胁迫下, 各指标均不同程度地受到抑制(表2)。其中, 受抑制最严重的指标为活力指数和胚根长度, 均值分别为0.09 cm和0.98 cm, 较对照分别下降83.33%和81.37%。胚根干重、下胚轴干重、子叶下部干重、下胚轴长、发芽势、发芽指数、发芽率均值分别为0.01 g、0.06 g、0.07 g、2.27 cm、50.04%、7.73、84.43%, 较对照分别下降75.00%、68.42%、66.67%、63.84%、45.66%、35.58%和13.99%。此外, 在混合碱胁迫下, 各指标的变异系数均增加, 其中下胚轴干重的变异系数最大, 比对照增加了22.99%。变异系数较对照增加最大的是发芽率, 较对照增加200.01%, 说明参试材料在碱胁迫下各指标的差异更显著。
混合碱胁迫下绿豆参试材料9个指标的相对值相关性分析表明(表3), 相对胚根长除与相对下胚轴长呈极显著正相关外, 与其余7个指标相关不显著。相对下胚轴长除与相对活力指数、相对胚根干重相关不显著外, 与其余6个指标呈显著或极显著正相关。其余7个指标间均呈显著或极显著正相关, 其中相对子叶下部干重与相对下胚轴干重呈极显著正相关, 相关系数最高, 达到了0.990; 相对发芽率与相对发芽指数、相对发芽势、相对活力指数呈极显著正相关, 相关系数也分别达0.912、0.745和0.712; 相对活力指数与相对胚根干重呈极显著正相关, 相关系数为0.880。
通过计算并比较平均隶属函数值确定了34份参试材料耐碱性的排序(表4)。白绿11、河南黑绿豆耐碱性最好, 平均隶属函数值分别达到了0.843和0.772。潍绿7号的耐碱性最差。
利用34份参试材料的平均隶属函数值经卡方距离可变类平均法进行聚类分析(图1), 可分为4个类群。第I类群包括白绿11、河南黑绿豆、吉9346、吉绿6号、吉绿9号、LD063、白绿6号、冀绿7号、清水河绿豆共9份材料, 占参试材料的26.47%。该类群所有材料平均隶属函数值均不低于0.7, 属于耐碱品种。该类群又分为2组, 其中白绿11平均隶属函数值高于0.8, 单独为一组, 属于高耐碱品种, 其余8份材料聚为一组。第II类群包括公绿1号、XLD5、洮218、洮绿5号、XLD4、吉绿8号、吉绿10号、XLD1、洮绿3号、XLD2、冀绿9号、吉绿5号、洮98502、冀绿8号、吉绿7号、XLD9、明绿1号、冀绿2号、公绿2号共19份材料, 占参试材料的55.88%。该类群所有材料平均隶属函数值介于0.5~0.7间, 属于耐碱中间类型。第III类群包括吉绿3号、吉绿11、保942、吉绿4号、L4374共5份材料, 占参试材料的14.71%。该类群材料平均隶属函数值介于0.3~0.5间, 属于对碱敏感类型。第IV类群包括潍绿7号1份材料, 平均隶属函数值极低, 为0.059, 属于对碱极敏感类型。
本研究中因子个数取为3, 获得的特征值和贡献率见表5。可见, 因子个数取为3能够满足“ 1.4” 中的2个原则, 前3个因子所包含的信息量占总体信息量的84.507%, 且第3个因子的特征值为1.168, 大于1。进一步获得的因子载荷矩阵见表6, 反映的是3个主因子与9个测定指标间的相关性。
第一主因子与活力指数、发芽率、发芽指数相关性最大, 相关系数分别为0.904、0.882和0.849, 它们主要反映了绿豆发芽萌发的状况, 可称之为萌发因子。
第二主因子与下胚轴干重、子叶下部干重的相关性最大, 相关系数分别为0.959和0.934, 这2个指标主要反映了绿豆子叶下部干物质的积累状况, 可称之为生物量累积因子。
第三主因子与胚根长、下胚轴长的相关性最大, 相关系数分别为0.923和0.831, 这2个指标主要反映的是绿豆子叶下部的伸长状况, 可称之为伸长因子。
综上所述, 萌发因子、生物量累积因子、伸长因子的累计贡献率为84.507%, 丢失的信息较少, 活力指数、下胚轴干重、胚根长分别与这3个主因子的相关系数均超过了0.9, 具有较高的相关性, 因此活力指数、下胚轴干重、胚根长能够作为绿豆萌发期耐碱性鉴定的筛选指标。
农作物耐盐碱鉴定一般分为萌发期鉴定和幼苗期鉴定, 萌发期耐盐碱能力决定了种子的出苗率[17], 也可以在相对较短时间内对大量品种资源进行鉴定, 具有可操作性强、周期短、效率高的特点, 可用于大批量绿豆品种资源耐盐碱性的初步评价, 并且在高粱[18]、玉米[19]、粟类[20, 21]等作物上萌发期的耐盐碱性与成株期的耐盐碱性是一致的。
盐碱土壤的可溶性盐主要由Na+、Ca2+、Mg2+、Cl-、SO42-、CO32-、HCO3-等离子组成, 盐碱胁迫下, 植物除受到大量盐离子毒害外, 还有高pH对植物的影响[22, 23]。针对东北地区苏打盐碱地组成成分, 阴离子主要以CO32-、HCO3-为主, 阳离子主要以Na+为主的特点, 本研究采用50 mmol L-1混合碱溶液模拟胁迫条件, 更能反映东北地区盐碱土壤的真实胁迫情况。
隶属函数值法是一种较好的抗逆性综合评价方法, 配合恰当的抗逆性指标, 就能较为准确地评价作物间以及品种间的抗逆性差异, 也能避免单一指标的片面性。应用此方法, 在大豆[24, 25]、油菜[26, 27]、玉米[28]、绿豆[29, 30, 31, 32]耐旱性鉴定以及高粱[33, 34]、棉花[35]、小麦[36]、野生大豆[37]耐盐碱鉴定中对作物的抗逆性进行了全面、有效的评价。本研究利用9个测定指标的平均隶属函数值对收集的34份绿豆品种资源的萌发期耐碱性综合评价表明, 不同参试材料的耐碱性存在较大差异。聚类结果依据隶属函数值能够把所有参试材料划分为耐碱类型、耐碱中间类型、碱敏感类型和碱极敏感类型。在9份耐碱类型中, 白绿11平均隶属函数值达到了0.843, 可以看作极耐碱品种。
土壤盐化和碱化往往相伴而生, 在中国东北地区尤为严重。碱胁迫的高pH是限制植物生长和发育的关键因素, 尤其是对于植物根系, 高pH可能干扰根系选择性吸收K+、Na+的能力, 导致植物体内Na+、K+不平衡, 严重干扰了Na+区域化, 使细胞质中Na+大量积累, 对细胞质构成毒害[6]。本研究中, 50 mmol L-1混合碱(pH 9.12)胁迫对绿豆种子萌发的抑制作用表现在多种性状上, 且抑制程度存在差异(表2)。受抑制程度较大的指标有活力指数、胚根长度和胚根干重, 较对照分别下降了83.33%、81.37%和75.00%, 这3个指标均与胚根有关。绿豆种子萌发时, 胚根先穿过种孔而出, 向土壤深处迅速生长, 因此, 根系作为吸收水肥的重要器官较早与碱有了更直接的接触, 并最先对碱胁迫作出响应。而与下胚轴有关的指标下胚轴干重、子叶下部干重、下胚轴长受抑制程度仅次于与胚根有关的指标, 较对照分别下降了68.42%、66.67%和63.84%。胚根长出后, 下胚轴即向上伸长, 绿豆下胚轴有较强的延伸能力, 因此绿豆出苗时子叶出土, 下胚轴的生长情况对绿豆出苗率有较大的影响, 这可能是下胚轴紧跟胚根对碱胁迫作出响应的原因。
作物耐盐碱性状是受多个数量性状基因座调控的复杂性状[38], 作物耐盐碱能力是多种代谢的综合表现[39], 用不同的鉴定指标评价同一个作物品种可能会得到不同的结果[40]。因子分析能够用相对少量的几个因子解释原来许多相互关联的变量之间的关系, 是寻找对观察结果起支配作用的潜在因子的探索性统计分析方法。本研究中, 选用的9个指标间存在着显著或极显著的相关性(表3), 信息重叠度高。通过因子分析, 将9个指标归纳为3个主因子, 依次为萌发因子、生物量累积因子、伸长因子, 进而筛选出活力指数、下胚轴干重、胚根长为绿豆萌发期耐碱性鉴定的指标。
计算了参试材料以活力指数、下胚轴干重、胚根长为鉴定指标的平均隶属函数值。河南黑绿豆、白绿11的平均隶属函数值最高, 分别为0.769和0.719, 综合评价中这2份品种资源的耐碱性分别排第二、第一。潍绿7号的耐碱性最差, 与综合评价中的排序一致。与绿豆品种资源耐碱性综合评价的排序相比, 只有6份参试材料的排序变化高于3, 其余28份参试材料的排序变化均不高于3, 其中有6份材料的排序没有发生变化, 有13份材料的排序变化为1, 有6份材料的排序变化为2, 有3份材料的排序变化为3。以3个筛选指标计算出的隶属函数值为横轴, 以综合评价计算出的隶属函数值为纵轴, 绘制两者间的关系图(图2), 两者也极显著相关(P< 0.01), 相关系数为0.9219。综上所述, 利用活力指数、下胚轴干重、胚根长这3个筛选指标对34份绿豆品种资源的鉴定结果与综合评价的结果基本一致, 能够代替原来9个指标对绿豆萌发期耐碱性评价。
通过隶属函数值法综合评价和聚类分析, 34份绿豆品种资源可被划分为4类: 白绿11等9份材料为耐碱类型, 公绿1号等19份材料为耐碱中间类型, 吉绿3号等5份材料为碱敏感类型, 潍绿7号为碱极敏感类型。50 mmol L-1混合碱(NaHCO3∶ Na2CO3的摩尔比为9∶ 1)能够作为东北地区绿豆萌发期耐碱性鉴定的适宜浓度, 活力指数、下胚轴干重、胚根长可作为绿豆萌发期耐碱性鉴定的适宜指标。
The authors have declared that no competing interests exist.
作者已声明无竞争性利益关系。
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