选用我国蔗区种植面积最大的主栽品种ROC22, 剪取处于分蘖期的甘蔗茎尖, 提取其总RNA。甘蔗品种ROC22由云南省甘蔗遗传改良重点实验室提供。大田中选取生长健壮并长势一致的ROC22蔗茎, 砍成单芽茎段, 洗净并52℃温水脱毒处理30 min。温室中取45 d的甘蔗幼苗, 参考李晓君的方法^[45], 设置6种处理: 即以10% (w/v) PEG-6000的MS培养基; 20% (w/v) PEG-6000的MS培养基; 200 mmol L^-1 NaCl的MS培养基; 300 mmol L^-1 NaCl的MS培养基; 1/8 mmol L^-1的磷缺乏; 纯水培养(营养缺乏)。于不同处理的不同时间0 (对照)、6、12、24、48、72和96 h取茎尖, 立即投入液氮速冻, 并保存于-80℃, 用于提取总RNA。

提取总RNA参照全式金公司RNA Plant Kit说明书, 以RNAase-Free H₂O溶解RNA, NanoDrop测定RNA浓度, 根据OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀评估RNA质量, 通过1%琼脂糖凝胶电泳的结果判断RNA的完整性, 存于-70℃备用。取1 μ g茎尖总RNA按照TaKaRa公司的RNA PCR Kit试剂盒说明书合成 cDNA。

以NCBI检索的二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、玉米(Zea mays)、高粱(Sorghum bicolor)、水稻(Oryza sativa)的D27基因序列为模板, 以DNAman软件分析D27保守区。用Primer5.0软件设计RT-PCR引物(表1)。以cDNA为模板, 使用全式金Trans Taq HiFi DNA Polymerase进行RT-PCR, PCR运行程序为94℃, 3 min预变性, 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环, 72℃延伸10 min。PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测, 以全式金公司的凝胶回收试剂盒回收、纯化扩增条带, 并连接到pEASYTM-T5 Zero-Vector载体中, 转入DH5α 大肠杆菌, 阳性克隆经PCR鉴定后, 送上海生工测序, 测序结果经Blast和DNAman 6.0验证比对分析。

根据1.3中的甘蔗ScD27基因同源片段序列设计内外巢基因特异性引物(表1)。按照Clontech Smart Race cDNA Amplification Kit说明书扩增目的基因的3° 和5° 末端。以拼接获得的全长序列为模板, 设计引物扩增ScD27基因的编码区序列, 扩增条件为94℃, 3 min预变性, 94℃ 30 s, 57℃ 30 s, 72℃ 45 s, 30个循环, 72℃延伸10 min。参见1.3的检测、回收、测序、验证比对分析。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 RT-PCR、RACE、荧光定量PCR扩增引物 Table 1 Primers used for RT-PCR, RACE, and Q-PCR experiments 引物名称 Primer name 引物序列 Primers sequence (5° -3° ) 目的 Purpose ScD27EST-F CTGGGATGAAGAACGGAAA 基因片段扩增 Amplification of gene segment ScD27EST-R GCTGCTTCAGTGCTGGATCA 外侧特异引物ScD27-5° R2 CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA 5' RACE扩增 5' RACE amplification 内侧特异引物ScD27-5° R1 CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG 外侧特异引物ScD27-3° F1 GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT 3’ RACE扩增 3' RACE amplification 内侧特异引物ScD27-3° F2 GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG ScD27F CGACGCACGCACGGAGT 编码区扩增 Amplification of coding region ScD27R ACTAGAATTGCCTTCTGCTATGTT D27-Q547F ATGTGAGGTCAGGGAATCCGAAG 实时荧光定量PCR扩增 Amplification of q-PCR D27-Q694R TGAATCTTGGATGAACTTCTGGCA GAPDHF CACGGCCACTGGAAGCA GAPDH内参基因 GAPDH reference genes GAPDHR TCCTCAGGGTTCCTGATGCC

表1 RT-PCR、RACE、荧光定量PCR扩增引物 Table 1 Primers used for RT-PCR, RACE, and Q-PCR experiments

使用ORF Finer在线工具寻找编码框; ProtParam (http://web.expasy.ory/ProtParam/)和Smart (http://smart. embl-heidelberg.de/)在线软件分析蛋白的基本理论性质和保守结构域; ProtScale分析蛋白质疏水性; SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM Sever2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)和PSORT (http://psort.hgc.jp/)分析蛋白的信号肽和亚细胞定位预测; SOPMA软件预测蛋白的

二级结构; NCBI平台进行Blast同源比对分析, ClustalW软件进行多序列对齐和排序, MEGA5.0构建NJ系统进化树。

取甘蔗的分蘖芽、腋芽、茎尖、根尖、老根、嫩叶、老叶(第四叶中段)、节(第三节)和叶鞘, 提取RNA (方法参考1.2)。根据ScD27基因序列设计荧光定量PCR引物, 使用GAPDH作为内参基因^[46](表1)。选用TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser和SYBR Premix Ex Taq II试剂盒, 按其说明书, 定量PCR体系20 μ L, 用ABI Vii7Real time PCR System (Applied Biosystems, USA)检测ScD27基因的表达。设置3个重复样品, 利用2^{-Δ Δ CT}法计算基因的相对表达量^[47]。

图1所示, RT-PCR扩增得到长度为477 bp的甘蔗D27基因片段; RACE扩增获得479 bp的3° 端序列和670 bp的5° 端序列。通过将中间片段、3° 端序列和5° 端序列拼接, 得到全长为1379 bp的甘蔗D27基因全长cDNA序列, 使用编码区引物扩增获得867 bp的编码区序列。该基因包含127 bp的5° 非编码区、385 bp的3° 非编码区和867 bp的编码区, 可编码288个氨基酸, 被命名为ScD27, 并将基因序列提交GenBank数据库, 登录号为KP987221.1。

图1

Fig. 1

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	图1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2.1 ScD27蛋白基本理化性质和保守结构域分析

通过ORF Finer在线工具找到ScD27的ORF框, 并翻译成氨基酸序列(图2)。使用ProtParam在线软件分析该蛋白序列的理化性质表明, ScD27蛋白的分子式为C₂₅₃₉H₄₂₀₅N₈₆₇O₁₀₃₃S₂₅₅, 分子量为71.58 kD, 等电点为5.04, Ala、Pro、Ser在氨基酸序列组成中出现频率较高, 分别占10.1%、9.4%、7.3%和8.1%, 而一些氨基酸如Pyl、Sec在氨基酸序列中则没有出现。稳定性系数为50.16, 表明为不稳定蛋白(不稳定系数< 40是稳定蛋白, > 40是不稳定蛋白); 总平均亲水性(GRAVY)为-0.308, 脂肪系数(AI)为68.79, 说明该蛋白质亲水区域多于疏水区域, 为亲水蛋白。

图2

Fig. 2

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	图2 ScD27基因的编码区序列及推导出的氨基酸序列Fig. 2 Leotide and predicted amino acid sequences of ScD27 gene

通过Smart分析表明甘蔗ScD27蛋白在氨基酸序列第190~234之间可能含有一个ZnF_TAZ锌指结构域, 在氨基酸序列第199~224之间有一个类ZnF_A20锌指结构域, 由于具有相同结构的蛋白往往行使相似的功能^[48], 因此推测ScD27蛋白可能参与了其他生物学通路, 与植物调节分蘖来响应非生物胁迫有关。

2.2.2 ScD27蛋白磷酸化和糖基化位点 蛋白质的修饰方式包括蛋白质的磷酸化和糖基化, 它可以调节蛋白质的活力和功能。分别运用DictyOGlyc 1.1 Server 和NetPhos 2.0 Serve在线软件预测ScD27基因翻译后磷酸化、O-糖基化修饰情况。结果显示, ScD27蛋白有可能发生磷酸化修饰的位点有16个, 其中色氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)可能发生磷酸化修饰的位点分别有8、5、3个(图3); 有可能发生O-糖基化修饰的位点有0个(图4)。磷酸化位点均集中分布在中间亲水区。

图3

Fig. 3

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	图3 ScD27蛋白氨基酸序列翻译后磷酸化修饰位点预测Fig. 3 Prediction of phosphorylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

图4

Fig. 4

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	图4 ScD27蛋白氨基酸序列翻译后O-糖基化修饰位点预测Fig. 4 Prediction of O-glycosylation site modification in amino acid sequence of ScD27 protein

2.2.3 ScD27蛋白信号肽预测、亚细胞定位和蛋白的二级结构预测 根据SignalP4.1 server软件预测可知, 该蛋白的信号肽平均值较小, 为0.217 (远远小于0.500), 因此推测ScD27蛋白无信号肽及切割位点, 属于非分泌蛋白, 说明该蛋白在细胞质中合成后不能被转运。根据PSORT II在线软件预测表

明ScD27蛋白主要定位于叶绿体上。使用SOPMA软件预测ScD27蛋白的二级结构(图5), 该蛋白α -螺旋(h)占33.6%、β -折叠(e)占14.24%、β -转角(t)占4.86%和无规则卷曲(c) 47.22%。可见α -螺旋和无规则卷曲占据了该蛋白质二级结构的大部分, 进一步分析发现α -螺旋在N端与中部所占分量较大, 延伸链主要集中在中部及C端, β -转角则主要在中部和前部, 无规则卷曲的分布则比较平均(图5)。Motif Scan软件在线软件分析该基因含有一个异戊烯化作用位点和一个CAAX BOX结构, 这可能是蛋白质翻译后修饰并正确定位的重要作用元件。

作为蛋白质折叠的主要驱动力, 蛋白质的亲水、疏水氨基酸的组成能够影响蛋白质的结构和特性, 经在线软件ProtScale采用Hyhob/Kyte & Doolittle的方法分析显示(图6), 第130位具有最高分值, 为2.367, 疏水性最强; 第36和第37位最低分值, 为-3.067, 亲水性最强。整条多肽链表现为亲水性, 没有明显的疏水区, 故推测甘蔗ScD27蛋白是一种亲水蛋白。

图5

Fig. 5

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	图5 ScD27蛋白质二级结构分析Fig. 5 Secondary structure analysis of ScD27 protein

2.2.4 ScD27蛋白氨基酸序列的同源比对及进化树分析 在NCBI上筛选出与甘蔗ScD27基因氨基酸序列相似性较高的5个不同物种的D27蛋白, 并将其与甘蔗ScD27基因预测的氨基酸序列进行多序列比对。结果显示, ScD27蛋白氨基酸序列与其他D27氨基酸序列有较高的保守性(图7)。

氨基酸同源比对分析表明ScD27蛋白与玉米D27蛋白氨基酸序列相似性达到82% (图8), 与单子叶植物高粱(Sorghum bicolor)、谷子(Setaria italica Beauv.)、大麦(Hordeum vulgare subsp. vulgare)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)和山羊草(Aegilops umbellulata)的相似性分别高达78%、76%、73%、71%和64%, 与双子叶植物海枣(Phoenix dactylifera)和甜橙(Citrus aurantium)的相似性分别为57%和58%。使用MEGA5.0构建的NJ进化树(图8)显示单子叶植物和双子叶植物D27蛋白同系物分别聚在2个不同的分支, 表明D27蛋白在单双子叶植物间存在一定的分化, 在同类型植物间表现出较高的保守型。在单子叶植物分支群中, ScD27蛋白与谷子、高粱聚为一个小分支, 表现出较高的同源性。

图6

Fig. 6

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	图6 ScD27蛋白的亲水性/疏水性预测Fig. 6 Hydrophobicity/hydrophilicity prediction of ScD27

图7

Fig. 7

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	图7 ScD27与其他五种作物同源蛋白的氨基酸序列比对结果 gi326492644: 大麦; gi357156309: 二穗短柄草; > gi242068981: 高粱; gi514809530: 谷子; gi226501302: 玉米。Fig. 7 Structure and sequence alignment analysis among ScD27 and D27 homologs of five crops gi326492644:Hordeum vulgare subsp. vulgare; gi357156309: Brachypodium distachyon; gi242068981: Sorghum bicolor; gi514809530: Setaria italica; gi226501302: Zea mays.

图8

Fig. 8

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	图8 不同物种D27氨基酸序列的聚类分析Fig. 8 Phylogenetic analysis of D27gene homologs in different plant species

qRT-PCR分析表明(图9), 甘蔗ScD27基因在各器官中差异表达, 在分蘖芽、腋芽、茎尖中的表达量相对较高, 根尖、老根、嫩叶、老叶、节和叶鞘中的表达量相对较少。因此, ScD27基因在甘蔗中具有组织特异性, 主要是在甘蔗的幼嫩组织中强表达。

图9

Fig. 9

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	图9 ScD27基因在甘蔗不同组织中的表达Fig. 9 Expression of ScD27gene in different sugarcane tissues analyzed with q-PCR technique

q-PCR (quantitative PCR, q-PCR)分析结果表明, 在不同胁迫条件下, ScD27基因均被诱导表达, 而响应的方式有一定的差异(图10)。ScD27基因的表达受到PEG强烈诱导, 10% (w/v) PEG-6000的MS培养基处理, 在6个时间点(6、12、24、48、72和96 h)中甘蔗ScD27基因表达以24 h达最高; 20% (w/v) PEG-6000的MS培养基胁迫下12 h达最高的4倍的表达量, 并在整个处理周期, 96 h内均维持较高的表达水平(3倍以上)。

总体上看, ScD27基因在受到模拟干旱胁迫和中度盐胁迫(以200 mmol L^-1 NaCl的MS培养基处理)的诱导表达增强, 处理24 h后表达量均出现明显增强, 但在重度盐胁迫(以300 mmol L^-1 NaCl的MS培养基处理)处理后, ScD27基因的表达量相对增加较少, 可能与蔗苗受极端胁迫有关, 而后期蔗苗出现死亡现象。在磷缺乏和营养缺乏时, ScD27基因同样表现出表达增强, 但与响应模拟干旱和盐胁迫相比, 其表达量增长较少。

图10

Fig. 10

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	图10 ScD27基因在不同胁迫条件下的表达量Fig. 10 Expression level of ScD27gene under different stress conditions using q-PCR technique