将玉米自交系昌7-2种子播于温室, 温度控制在23~30℃, 自然光照。吐丝前套袋, 人工授粉14 d后, 取幼穗在无菌条件下剥取幼胚, 盾片朝下接种于MS和MSA培养基上。

MSA培养基为添加AC 6 g L^-1的MS培养基。MS和MSA两种培养基均附加0.01 mg L^-1 NAA、0.04 mg L^-1 6-BA、20 g L^-1蔗糖和6 g L^-1琼脂。培养基分装于100 mL三角瓶中, 每瓶约30 mL。每瓶接种6个幼胚, 每种培养基接种5瓶, 2个重复。接种后的幼胚培养于24℃、16 h光照/8 h黑暗的培养箱中。生长9 d后, 从每瓶发育较为一致的幼苗中取2株, 调查幼苗根长(最长根的长度)、根数、株高和单株鲜重, 对每种培养基处理调查10株, 2个重复。利用SPSS软件对数据进行两个独立样本的t检验, 分析性状的差异显著性。从每种培养基上选取生长一致的4株幼苗按地上部(茎和叶)和地下部(残存盾片和根)取样, 共4个样品, 即MS-shoots、MS-roots、MSA-shoots和MSA-roots, 3个生物学重复。样品经液氮速冻后, -80℃保存, 用于RNA提取。

委托上海派森诺公司完成RNA提取、文库构建和转录组测序。利用TRIZOL试剂提取样品总RNA, 通过rRNA去除试剂盒纯化得到mRNA, 构建链特异性文库。采用Illumina NextSeq 500平台进行双末端测序, 得到原始序列(raw reads)。

经过去除接头和低质量reads的数据过滤, 得到Q > 20的高质量clean reads序列用于后续分析。参考基因组数据来源于Ensembl数据库(http://www. ensembl.org/)^[28]。通过Bowtie2软件建立参考基因组索引, 用Tophat2将clean reads比对到参考基因组上^{[29, 30]}。用HTSeq统计比对到每个基因上的Read Count值, 作为基因的原始表达量^[31]。用RPKM (Reads Per Kilo bases per Million reads)对表达量进行标准化, 以RPKM值 > 1为基因表达标准。用DESeq对基因表达进行差异分析^{[32, 33]}, 以表达倍数差异Fold change值 > 2、显著性P-value < 0.05和FDR < 0.05为差异基因筛选条件。用GO功能富集分析对差异基因(differentially expressed genes, DEGs)进行功能注释, 显示DEGs显著富集的功能分类^[33]。用KEGG进行生物通路分析确定DEGs主要参与的代谢途径和信号通路^{[35, 36]}。

通过分析转录组数据, 选取2种培养基上生长的幼胚苗地下部的10个DEGs, 利用Primer 5.0软件设计候选基因引物(表1)。以玉米甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的编码基因为内参, 进行荧光定量RT-PCR验证。以RNA为模板, 用FastQuant cDNA第一链合成试剂盒(天根公司)合成cDNA。用SuperReal荧光定量预混试剂(天根公司)配制反应液, 用7500 Real-time PCR System进行荧光定量PCR, 反应程序为95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 32 s, 40个循环。以2^{-∆ ∆ CT}方法计算基因的相对表达量。对每个基因的定量设置3个生物学重复。以MS-roots样品中基因表达量为1, 统计MSA-roots中各基因的相对表达量, 用单样本t检验分析MSA-roots样本中10个DEGs表达量是否达到显著水平(P < 0.05)。分析RNA-Seq和qRT-PCR两平台中10个DEGs相对表达量的相关性。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 用于qRT-PCR分析的10个基因及其引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis of ten maize DEGs 基因编号 Gene ID 正向引物 Forward primer (5° -3° ) 反向引物 Reverse primer (5° -3° ) 片段长度 Fragment length (bp) GRMZM2G149178 ACAACAACAACAACCCGCAC CTTCGTGATGCCCTGGATGT 163 GRMZM2G068193 CCGAGATTCTGCTTGGAG CTGTTCGTTTGGGGTGCC 164 GRMZM2G172657 GCGGGTTGTTACTGTCGT TCTTGGGGAAGCTCTCTT 164 GRMZM2G017792 GCAGGCTCTGACAGAAGA CAAACACCGTGCATTAAC 126 GRMZM2G048294 GGAGCGGCTGTGGTTTATG CTCGGTGTATGATGTGCGGTAT 176 GRMZM2G138886 ATGTCAGCCGATCGTAGCTG TCCTTGTTCTCTGTCGCACC 150 GRMZM2G108712 ATTGATAGCGAGCACCTCGG CACCGAGATGACGACTGTGT 126 GRMZM2G040638 GGCTACTGCACCAAAGACGA CCATGCTGGCCTTGACGATA 158 GRMZM2G055699 GAAGGGGCAACCGATGAAGA TAGGTCGCCAGTGCTTTTGT 93 GRMZM2G089982 GGATGTATCCTACGCCGCAA TTGTCAAACTTGGCAGGGGT 102

表1 用于qRT-PCR分析的10个基因及其引物 Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis of ten maize DEGs

胚龄14 d的玉米幼胚在MS和MSA培养基上培养9 d后, 幼苗长势差异明显(图1)。MSA培养基上的幼苗根长、根数、株高和鲜重均显著高于MS培养基上的幼苗(P< 0.05)(表2)。在培养基中添加AC可以显著促进玉米幼胚离体培养成苗。

图1

Fig. 1

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	图1 活性炭促进玉米幼胚离体培养成苗 A: 玉米幼胚接种在MS和MSA培养基上; B: 玉米幼胚在MS和MSA培养基上培养9 d后的长势。Fig. 1 Active carbon accelerated the seedlings producing from immature embryos cultured in vitro A: Immature embryos cultured on MS or MSA medium; B: Seedlings developing from immature embryos cultured on MS or MSA for nine days.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 MS和MSA培养基上玉米幼胚苗性状的比较 Table 2 Comparison of the traits of maize seedlings developing from immature embryos cultured on MS or MSA media 处理 Treatment 根数 Root number 根长 Root length (cm) 株高 Seedling height (cm) 鲜重 Fresh weight (g) MSA 3.50 ± 0.58 a 9.38 ± 2.42 a 16.15 ± 0.96 a 0.34 ± 0.01 a MS 1.00 ± 0.00 b 1.48 ± 0.39 b 12.40 ± 1.10 b 0.19 ± 0.01 b Values within a column followed by different letters are significantly different at the 0.05 probability level. 同一列数值后标不同字母表示在0.05水平上差异显著。

表2 MS和MSA培养基上玉米幼胚苗性状的比较 Table 2 Comparison of the traits of maize seedlings developing from immature embryos cultured on MS or MSA media

MS-roots、MS-shoots、MSA-roots和MSA-shoots分别有41 572 394、47 070 088、44 177 188和44 369 556个clean reads。共有130 209 524个clean reads比对到参考基因组上, 115 713 895个clean reads比对到基因区域, 其中96.96%比对到外显子区域(表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 玉米幼胚苗的转录组数据分析 Table 3 Analysis on transcriptome data of maize immature embryo seedlings 项目 Item MS幼苗地下部 MS-roots MS幼苗地上部 MS-shoots MSA幼苗地下部MSA-roots MSA幼苗地上部 MSA-shoots 原始序列数目 Raw reads 41 933 362 47 493 942 44 604 000 44 827 834 原始减基数 Total bases of raw reads (G) 6.29 7.12 6.69 6.72 过滤后序列数目 Clean reads 41 572 394 47 070 088 44 177 188 44 369 556 过滤后减基数 Total bases of clean reads (G) 6.07 6.83 6.48 6.60 比对到参考基因组的序列数目 Mapped reads 29 937 238 34 548 723 31 758 492 33 965 071 比对到基因区域的序列数目 Reads mapped to gene 27 925 126 33 989 015 30 904 325 22 895 429 比对到外显子区域的序列数目 Reads mapped to exon 27 236 851 33 060 683 30 210 545 21 690 108

表3 玉米幼胚苗的转录组数据分析 Table 3 Analysis on transcriptome data of maize immature embryo seedlings

对MS和MSA培养基上玉米幼胚苗的基因表达进行分析, 共发现2196个DEGs。其中, 地下部2142个, 地上部147个; 有93个基因在地上部和地下部中同时存在(图2-A)。在2142个地下部DEGs中, 有1612个基因受AC上调表达, 530个基因受AC下调表达。在147个地上部DEGs中, 有69个基因受AC上调表达, 78个基因受AC下调表达(图2-B)。这些结果表明, AC主要影响玉米胚苗地下部基因的表达。

图2

Fig. 2

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	图2 活性炭诱导的差异表达基因分布情况 A: 玉米幼胚苗地上部和地下部的DEGs维恩图; B: 玉米幼胚苗地上部和地下部的DEGs数目。Fig. 2 Distribution of DEGs induced by active carbon A: Veen diagram of DEGs in shoots and roots of the maize immature embryo seedlings; B: The total number of DEGs in shoots and roots of maize immature embryo seedlings.

GO功能富集分析表明, 地下部的2142个DEGs中有1630个基因获得GO注释, 涉及生命进程(biological process, BP)、细胞组分(cellular component, CC)和分子功能(molecular function, MF)三大类生物功能; 进一步可细分成131个显著富集小类(terms)(P< 0.05)。其中, DNA组装(P= 4.36× 10^-19)、DNA组装复合体(P= 7.75× 10^-18)和糖基水解酶活性(P= 9.02× 10^-13)分别是BP、CC和MF中最显著富集的功能类别。地上部142个DEGs中有108个被注释, 分别有16个BP、5个CC和15个MF Terms显著富集(P< 0.05), 最显著富集的类别涉及脂类代谢过程(P= 4.25× 10^-6)、胞外区(P= 3.00× 10^-7)和过氧化物酶活性(P= 4.40× 10^-4)。地下部和地上部中DEGs涉及的20个最显著富集的功能见图3。

图3

Fig. 3

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	图3 活性炭诱导的玉米胚苗地上部和地下部DEGs中各涉及的20个最显著富集GO分类 BP: 生物学过程; CC: 细胞组分; MF: 分子功能。Fig. 3 Twenty most significantly enriched Gene Ontology (GO) terms of the DEGs induced by active carbon in roots and shoots of maize seedlings BP: biological process; CC: cellular component; MF: molecular function.

KEGG富集分析表明, 地下部DEGs注释到108个代谢通路。其中, 56个涉及能量、碳水化合物、氨基酸、脂类和次生代谢物等代谢途径; 11个涉及细胞周期、p53信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节等细胞进程途径; 13个涉及植物激素信号转导、MAPK信号通路和AMPK信号通路等环境信息进程途径; 8个涉及DNA复制、碱基切除修复和核糖体等遗传信息进程途径; 20个涉及黄体酮调节卵母细胞成熟、植物-病原菌互作、趋化因子信号通路等有机系统途径。20个最显著富集的代谢通路主要是光合作用-天线蛋白、苯丙烷类物质生物合成和细胞周期途径。地上部DEGs涉及10个代谢通路, 最显著富集途径为泛醌和其他萜-醌类物质合成(图4)。

图4

Fig. 4

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	图4 地下部和地上部样品中DEGs富集的KEGG途径 地下部中仅列出前20个显著富集的KEGG pathway。Fig. 4 Enriched KEGG pathways of DEGs in the roots and shoots samples Only twenty most enriched KEGG pathways of DEGs in roots are listed.

对地下部富集的细胞周期途径、植物激素转导途径和外源物质代谢途径中的DEGs进一步分析。细胞周期途径涉及7个DEGs上调表达, 分别为细胞周期蛋白A2、细胞周期蛋白B2、细胞周期超家族蛋白、细胞分裂周期蛋白CDH1、增殖细胞核抗原PCNA、微小染色体维持缺陷蛋白MCM3和有丝分裂检纺锤体监测点蛋白BUBR1的编码基因。在植物激素转导途径中, 生长素信号转导中的2个Aux/IAA编码基因上调表达, 水杨酸信号转导中的具有bZIP结构的TGA转录因子基因下调表达。在外源物质代谢途径中, 细胞色素P450、乙醛脱氢酶3B1、谷胱氨肽转移酶7和谷胱氨肽转移酶27的编码基因表达上调, 乙醇脱氢酶2基因表达下调(表4)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 细胞周期、植物激素转导和外源物质降解代谢途径中的DEGs Table 4 DEGs functioning in cell cycle, plant hormone signal transduction, xenobiotics bio-degradation and metabolism pathways 途径 Pathway 基因编号 Gene ID 基因功能 Gene function 差异倍数 Fold change (MSA/MS) 细胞周期 Cell cycle GRMZM5G821639 细胞分裂周期蛋白 CDH1 Fizzy-related protein 34.73 GRMZM2G138886 细胞周期蛋白 Cyclin B2 312.11 GRMZM2G061287 细胞周期蛋白Cyclin superfamily protein Inf GRMZM2G017081 细胞周期蛋白 Cyclin-A2 58.38 GRMZM2G108712 增殖细胞核抗原 Proliferating cell nuclear antigen 2 (PCNA2) 17.78 GRMZM2G100639 微小染色体维持缺陷蛋白 DNA replication licensing factor MCM3 homolog 2 10.24 GRMZM2G009913 有丝分裂检纺锤体监测点蛋白 Mitotic spindle checkpoint protein BUBR1 257.47 外源物质降解代谢 Xenobiotics bio-degradation and metabolism GRMZM2G057086 细胞色素P450蛋白 Cytochrome P450 (E.C. 1.14.-.-) 55.39 GRMZM2G155502 乙醛脱氢酶 Aldehyde dehydrogenase 3B1 (ALDH 3B1) 184.49 GRMZM2G098346 乙醇脱氢酶 Alcohol dehydrogenase 2 (ADHP2) 0.13 GRMZM2G077206 谷胱氨肽转移酶 Glutathione transferase 27 (GST27) Inf GRMZM2G028556 谷胱氨肽转移酶 Glutathione transferase 7 (GST7) 15.85 植物激素信号转导 Plant hormone signal transduction GRMZM2G006578 bZIP转录因子 Putative bZIP transcription factor superfamily protein (bZIP7) 3.93E-3 GRMZM2G167794 Aux/IAA蛋白 Auxin-responsive protein IAA4 8.11 GRMZM2G366373 Aux/IAA蛋白 Auxin-responsive protein IAA 30.09 MSA/MS represents the ratio of the gene expression level in MSA-roots to the gene expression level in MS-roots; “ Inf” indicates that this gene is only expressed in MSA-roots. MSA/MS表示MSA-roots中基因表达量与MS-roots中的比值; Inf表示该基因在MSA-roots中表达, 在MS-roots中不表达。

表4 细胞周期、植物激素转导和外源物质降解代谢途径中的DEGs Table 4 DEGs functioning in cell cycle, plant hormone signal transduction, xenobiotics bio-degradation and metabolism pathways

对2种培养基上生长的幼胚苗地下部中10个DEGs进行了荧光定量RT-PCR验证。以MS-roots样品中基因表达量为1, 统计MSA-roots中各基因的相对表达量。结果表明, qRT-PCR中的基因表达变化与RNA-seq结果一致(图5)。经单样本t检验, MSA-roots样品中10个DEGs表达量与MS样品中表达量均差异显著。将RNA-seq和qRT-PCR中基因差异表达量进行log₂转化后进行相关性分析, 皮尔森相关系数为0.922, 在0.01水平上显著相关(图6), 说明RNA-seq的结果可靠。

图5

Fig. 5

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图5 受活性炭诱导的10个DEGs的qRT-PCR检测 对MSA-roots中7个上调表达基因和3个下调表达基因进行qRT-PCR验证, 以MSA-roots较MS-roots中基因表达的倍数表示基因的相对表达水平, 以GAPDH 基因为内参, 用 2-∆ ∆ CT方法计算基因相对表达量, 每个基因3个生物学重复检测, 3次技术重复检测。误差线表示标准差, * 表示经qRT-PCR检测, 该基因表达量在MSA-roots和MS-roots间差异显著(单样本t检验, P< 0.05)。Fig. 5 qRT-PCR verification of ten DEGs induced by active carbon Seven DEGs with up-regulated expression and three with down-regulated expression in MSA-roots vs. MS-roots were chosen for qRT-PCR validation. The relative expression level of each gene was expressed as fold change between MSA-roots and MS-roots in the RNA-seq data and qRT-PCR data. Relative gene expressions were normalized by comparison with that of maize GAPDH gene, and analyzed using the 2-∆ ∆ CTmethod. For each of the ten genes, the qRT-PCR assay used three biological replicates, with three technical repeats in each replicate. The bars represent the standard deviation. Asterisks indicate that the transcript level differed significantly between MSA-roots and MS-roots in qRT-PCR assay (single sample t-test, P< 0.05).

经qRT-PCR验证, 组蛋白H4 (GRMZM2G149178)、细胞周期蛋白CYCB2 (GRMZM2G 138886)、细胞周期蛋白激酶CDK (GRMZM2G 068193)、增殖细胞核抗原PCNA2 (GRMZM2G 108712)、木质素过氧化物酶POX72 (GRMZM2G 089982)、GRAS转录因子GRAS19 (GRMZM2G1 72657)和富亮氨酸重复类受体蛋白激酶LRR-RLK (GRMZM2G048294)受AC影响在地下部中上调表达。MAP激酶(GRMZM2G017792)、木质素过氧化物酶POX2 (GRMZM2G089982)和β -糖苷酶(GRM ZM2G055699)受AC影响在地下部中下调表达。

图6

Fig. 6

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	图6 10 DEGs的RNA-seq与qRT-PCR结果相关性分析 散点图表示两平台中基因相对表达量的log2转化值。Fig. 6 Correlation analysis of the expression changes of ten DEGs as revealed by RNA-seq and qRT-PCR, respectively Scatter plots indicate the log2 transformed gene expression values in RNA-seq and qRT-PCR.