利用SSR快速鉴定棉花品种真实性和纯度

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王欣怡, 艾先涛, 王俊铎, 梁亚军, 龚照龙, 郑巨云, 郭江平, 买买提#cod#x000b7;莫明, 李雪源. . 利用SSR快速鉴定棉花品种真实性和纯度. 作物学报, 2017, 43(10): 1565-1572
WANG Xin-Yi, AI Xian-Tao, WANG Jun-Duo, LIANG Ya-Jun, GONG Zhao-Long, ZHENG Ju-Yun, GUO Jiang-Ping, MAMAT Mo-Ming, LI Xue-Yuan. . Rapid Identification System of Purity and Authenticity in Cotton Varieties by SSR Markers. ACTA AGRONOMICA SINICA, 2017, 43(10): 1565-1572 复制到剪切板

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作物学报编辑部

利用SSR快速鉴定棉花品种真实性和纯度

王欣怡¹, 艾先涛², 王俊铎², 梁亚军², 龚照龙², 郑巨云², 郭江平², 买买提·莫明², 李雪源^2,^*

¹新疆农业大学农学院/农业生物技术重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830052

²新疆农业科学院经济作物研究所, 新疆乌鲁木齐 830091

^*通讯作者(Corresponding author): 李雪源, E-mail: xjmh2338@163.com

第一作者联系方式: E-mail: 15999173011@163.com, Tel: 15999173011

收稿日期:2016-12-20 接受日期:2017-05-10 网络出版日期:2017-05-19

基金:本研究由国家自然科学基金项目(31360351)资助

摘要

利用SSR分子标记技术对棉花品种真实性和纯度进行分析研究, 旨在为棉花品种提供分子鉴定依据。以具有代表性的棉花品种为材料, 经过引物初筛和复筛, 确定26对均匀分布于棉花染色体上的SSR核心标记。结果表明, 26对核心标记在120份材料中筛选得到138个等位位点, 其中129个为多态性位点, 多态性比率达93.48%。以标准样品为对照, 利用26对核心标记对10份棉花常规种进行真实性鉴定, 发现仅有源棉6号与标准品种的DNA图谱高度一致, 其他9份常规种与标准品种均存在8~18个差异位点, 分子鉴定结果与田间鉴定相符。另外分别筛选5对特征引物作为纯度检测标记, 采用单位点平均法统计4份常规棉品种检测结果表明, 源棉6号纯度最高, 为98.0%, 源棉1号最低, 为90.5%, 检测结果与田间纯度鉴定呈现正相关性。研究表明利用SSR标记技术鉴定棉花品种真实性和纯度的方法完全可行。

关键词: 棉花; 真实性鉴定; 纯度检测; SSR分子标记

Rapid Identification System of Purity and Authenticity in Cotton Varieties by SSR Markers

WANG Xin-Yi¹, AI Xian-Tao², WANG Jun-Duo², LIANG Ya-Jun², GONG Zhao-Long², ZHENG Ju-Yun², GUO Jiang-Ping², MAMAT Mo-Ming², LI Xue-Yuan^2,^*

¹ Key Laboratory of Agriculture Biological Technology / College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, China

² Economic Crop Research Institute, Xinjiang Academy of Agricultural Sciences, Urumqi 830091, China

Fund:The study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31360351).

Abstract

SSR molecular markers were used to analyze the authenticity and purity of cotton varieties, providing a molecular basis for the identification of cotton varieties. Typical cotton varieties were used as materials, and 26 pairs of primers well-distributed on the cotton genome were ascertained as the core primers in SSR molecular identification by preliminary and multiple screening. A total of 138 alleles from 120 varieties were screened by using 26 pairs of core primers, 129 of which were polymorphic loci, with a polymorphism rate of 93.48%. Ten inbred cotton varieties were used with 26 pairs of SSR core primers to identify the variety purity. The DNA fingerprint of one variety (Yuanmian 6) shared high uniformity with that of the standard cultivar, and DNA fingerprints of other nine varieties had 8-18 loci different from those of standard cultivar. The results from SSR molecular marker matched with those from field experiments. Five specific primers were selected for testing authenticity of each cultivar from 26 core primers. The variety with highest purity was Yuanmian 6, with the purity of 98.0% and that with lowest purity was Yuanmian 1, with the purity of 90.5%. It suggests that identifying authenticity and purity of cotton varieties is feasible by SSR molecular markers.

Keyword: Cotton; Authenticity identification; Purity testing; SSR marker

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品种真实性和纯度是种子质量的重要指标。据《农作物种子检验规程》中定义, 品种真实性(cultivar genuineness或trueness)是指一批种子所属品种与文件(品种证书、标签等)是否相同; 而品种纯度(varietal purity)则是指品种在特征、特性方面典型一致的程度。品种混杂和纯度降低会明显降低作物产量、影响作物品质。Ashok等^[1]研究认为若种子纯度每降低1%, 那么每公顷棉花减产可达100 kg。近年来, 我国棉花品种“ 套牌” 、“ 冒牌” 现象严重, 品种质量较差, 严重影响棉花生产安全和健康发展, 因此, 生产和市场迫切需要一种科学有效的品种鉴定方法。长期以来, 国内外棉花品种真实性和纯度鉴定的权威方法, 是以形态学为基础的田间小区种植鉴定。由于许多形态学性状鉴定周期长、调查性状易受栽培条件及环境因素影响, 使其时效性和可靠性受到一定限制^[2], 难以及时监控市场上的种子质量问题和解决品种侵权等纠纷。

分子生物学的发展使农作物品种鉴定进入基因水平, 其中以微卫星序列为基础的SSR标记具有扩增稳定可靠、重复性好等优点, 因此被广泛应用于棉花品种鉴定^[3]。武耀廷等^[4]利用48对SSR标记检测了30个陆地棉栽培品种和4个高优势杂交种亲本的多态性, 并建立了杂交种的SSR指纹图谱用于分子鉴定和纯度检测。朱美霞等^[5]以5个棉花栽培品种为材料, 利用15对SSR引物确定了分析品种纯度所需引物数, 为棉花品种指纹图谱的建立提供了理论依据。殷剑美等^[6]从217对引物中筛选出21对多态性引物, 构建苏杂118的SSR指纹图谱, 实现了对苏杂118真实性和纯度的快速鉴定。Yu等^[7]选择105对均匀分布于染色体的引物, 对棉属6个种的12个基因型进行多态性分析, 揭示了棉属种间和陆地棉种内的DNA多态信息。刘国栋等^[8]利用78个SSR标记对12个棉花品种进行标记基因型分析, 通过分析非纯位点率和异型单株率对品种遗传纯度的影响, 建立了利用SSR标记鉴定棉花品种纯度的方法。

目前利用分子标记对棉花品种进行真实性鉴定和纯度检测的研究主要是针对杂交种, 有关常规种的研究报道还比较少。本研究利用26对均匀分布于染色体上的SSR标记对棉花品种真实性和纯度分析研究, 并针对如何提高检测效率、降低检测成本, 提出了合理混合DNA样品的方法, 确定了一种快速鉴定棉花常规品种真实性与纯度的SSR分子标记方法, 为今后棉花品种鉴定提供分子水平上的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与取样方法

对于棉花品种真实性鉴定选用常规品种源棉6号、新陆早13、新陆早26、新陆早37、新陆中9、新陆中37、鲁棉研28、中棉所35、中棉所41、中棉所43共10个品种为材料, 随机选取每个品种15个单株, 将每5个单株DNA等量混合进行SSR分析, 以SSR位点有2个或2个以上等位变异的组, 对构成混样的5个单株DNA进行检测。

对于棉花品种纯度SSR检测与田间鉴定选用常规品种中棉所49、源棉1号、源棉2号和源棉6号为材料, 取每个品种100个单株, 对单株DNA进行SSR检测; 在盛铃期^[9]分别调查4个品种的株型、铃形、叶形等, 作为田间品种纯度鉴定的依据。

1.2 试验方法

1.2.1 棉花基因组DNA的提取采用改良CTAB法快速提取棉花基因组DNA^[10]。利用紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度, 通过1%的琼脂糖凝胶电泳进一步确定其质量。

1.2.2 SSR扩增与电泳分析 SSR引物信息来源于CMD数据库(http://www.cottonmarker.org/)、CottonDB数据库(http://www.cottondb.org/)以及文献资料^{[8, 11, 12]}已公布的引物。采用10 µ L PCR体系, 包括DNA模板(60 ng µ L^-1) 1 µ L, 正、反向引物(4 pmol µ L^-1)各0.5 µ L, 10× 缓冲液1 µ L, dNTPs (2.5 mmol L^-1) 0.2 µ L, Taq酶(5 U µ L^-1) 0.1 µ L和ddH₂O 6.7 µ L。参考艾先涛等^[13] PCR方法, 产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 快速银染法^[14]染色(仅需12 min)。

1.2.3 数据记录与位点判读利用均匀分布的26对核心标记, 将供试样本电泳谱带与标准样品比较, 根据谱带一致性判定供试样品的真实性, 结果用不同、近似、相同表示。当供试样品与标准样品差异位点> 2时, 判定为不同品种; 当差异位点≤ 2时, 判定为相似品种; 若供试样品与标准样品无差异位点, 则判定为相同品种^[15]。从供试样品中随机选取100个单株作为检测样本, 根据真实性鉴定时核心引物的扩增结果, 分别选取5对特征引物作为纯度检测标记。品种纯度P = (N_T-N_D)/N_T× 100%, 式中N_T为供检品种总株数, N_D为杂株数, 以平均值表示该品种的纯度值。

2 结果与分析

2.1 SSR标记多态性分析

以8份遗传背景差异较大的品种对分布于棉花全基因组的586对多态性引物进行初步筛选, 随后利用120份具有广泛代表性的材料复筛, 最终确定26对多态性高、带型清晰的SSR引物定为本次试验的核心引物(表1)。26对核心引物均匀分布于棉花26条染色体上, 在120份复筛材料上共检测到138个等位基因变异, 平均每个SSR有5.31个, 变幅为2~9, 其中具有多态性的位点为129个, 多态性比率达93.48%。26对核心引物总体上鉴别能力尚可, 进行棉花品种的鉴定是可行的。

表1 用于棉花品种鉴定的26对SSR核心引物 Table 1 Twenty-six pairs of SSR core primers for cotton varieties identification

2.2 棉花品种真实性鉴定

2.2.1 取样量的确定单个植株无法代表整个品种群体的基因型信息, 综合考虑工作量及操作可行性, 将品种真实性鉴定的样品量确定为15个单株, 再将单株DNA合并为若干混合样本进行SSR分析。

为确定混合样本中个体DNA份数, 将A (新陆早26)和B (新陆中37) 2个品种按10∶ 0、9∶ 1、8∶ 2、7∶ 3、6∶ 4、5∶ 5、4∶ 6、3∶ 7、2∶ 8、1∶ 9、0∶ 10的比例混合DNA, 分别记作样1~样11, 利用多态性SSR引物对11个样本进行PCR扩增, 扩增产物表现为2个品种的杂合带型(图1)。随着2个品种DNA浓度在各个样本中比例的改变, 其PCR产物中2个品种的带纹清晰度也逐渐加强或减弱。

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	图1 A和B不同比例DNA混合样本标记扩增结果 M: marker; 1~11: 2个品种DNA按10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9、0:10比例混合的11个样品。Fig. 1 SSR bands of mixed DNA samples from Xinluzao 26 and Xinluzhong 37 M: marker; 1-11: DNA samples of two varieties mixed by the ratio of 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4, 5:5, 4:6, 3:7, 2:8, 1:9, 0:10.

检测到供试品种和杂株的多态性位点时, 混合样本中的杂株达到20%, 杂株带型清晰可见。据此认为5个单株DNA合并为1个混合样本最为合理。只要该混合样本中有1个杂株, 此位点的带型将表现为测试品种与杂株的杂合带型, 进一步检测5个单株, 便能找出与其余4株带型不同的单株。

2.2.2 真实性鉴定的结果判定选取10个棉花常规品种将其编号(表2), 随机选取15株源棉6号品种, 以5个单株DNA均匀混合为1组, 制成3个样本(A1、A2、A3)作为标准样品。将供试样品也按照上述方法制成3个样本(X1、X2、X3), 利用26对核心标记进行扩增分析, 通过对比供试样品与标准样品整体图谱的差异位点, 判断待检样品的真实性。

表2 用于真实性鉴定的10个常规棉花品种 Table 2 List of 10 inbred cotton varieties for authenticity identification

2.2.3 同一样品3组混样间差异位点分析通过对比同一样品3组混合样本电泳图谱发现(图2), 源棉6号和中棉所43的3组混合样本在26个标记中谱带均一致; 其余8个品种3组混合样本之间存在4~13个差异位点。对于相同位点谱带不一致的3组混合样本, 进一步分析构成该混样的15个单株图谱(图3), 确定非本品材料。

2.2.4 供试样品与标准样品间差异位点分析 10个供试样品中, 仅A1~A3样品与标准样品在26个位点上扩增图谱完全一致, 判定为相同品种; 其余样品与标准样品间存在8~18个差异位点(图4), 判定为不同品种。事实上A1~A3样品即为源棉6号品种的3个分样。

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	图2 引物NAU2083在不同品种3组混合样本中的扩增结果M: marker; 1~30: 不同品种混合样本电泳扩增效果图; A~J: 10个参试品种。Fig. 2 Amplified bands of three mixed samples by the different varieties with primer NAU2083 M: marker; 1-30: electrophorogram of mixed samples of different varieties; A-J: 10 tested varieties.

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	图3 引物NAU2083在15个单株(新陆早13和新陆中37)的扩增结果 M: marker; a: 新陆早13的电泳扩增图; b: 新陆中37的电泳扩增图。Fig. 3 Amplified result of 15 single plants (Xinluzao 13 and Xinluzhong 37) with primer NAU2083 M: marker; a: electrophorogram of Xinluzao 13; b: electrophorogram of Xinluzhong 37.

Amplified result of standard sample and 10 detection varieties with primer CGR5707 M: marker; A~J: 10个供试品种。M: marker; A-J: 10 tested varieties.
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	图4 引物CGR5707在标准样品与10个供试样品的扩增结果Fig. 4

利用该方法不仅实现了供试样品与标准样品的鉴定, 而且10个供试样品也能够相互区分, 统计结果如表3。26对核心引物成功鉴定出了10份棉花材料的真实性, 说明所选核心引物具有鉴别能力和区分能力。

表3 10份供试样品真实性鉴定结果统计表 Table 3 Authenticity identification result of ten varieties

2.3 棉花品种纯度检测

2.3.1 SSR分子检测分别从26对核心引物中筛选5对特征引物作为纯度检测标记(表4), 采用单位点平均法统计4份常规棉品种100个单株的纯度检测结果(图5)。带型统计结果表明, 同一品种不同引物的一致性带型存在较大的差异, 中棉所49在5对引物中的一致性变化范围在94%~98%之间, 平均95.3%, 经统计, 源棉1号品种的纯度为90.5%, 源棉2号品种的纯度为94.7%, 源棉6号品种的纯度为98%。

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	图5 引物BNL3860在100个单株(中棉所49)的纯度扩增结果M: marker; 1~100: 100个单株的电泳扩增效果图; ▲: 检出的杂株。Fig. 5 Amplified result of 100 plants of Zhongmiansuo 49 with primer NAU2083 M: marker; 1-100: banding patterns of 100 plants; ▲: detected variant strains.

表4 常规棉品种纯度检测引物信息表 Table 4 Primer information of purity test in inbred cotton varieties

2.3.2 SSR分子检测与田间种植鉴定分析为了进一步验证分子检测结果的可靠性, 根据中棉所49、源棉1号、源棉2号、源棉6号品种区域试验和审定所描述的田间表型性状, 在盛铃期对其进行调查(表5)。

表5 4个棉花品种纯度的田间形态鉴定结果 Table 5 Purity of four cotton varieties identified by morphological method

结果显示两种方法鉴定结果一致, 其纯度由高到低均为源棉6号> 中棉所49> 源棉2号> 源棉1号, 但对同一品种的纯度, 田间种植鉴定结果均高于分子标记检测结果(表6)。

表6 分子标记鉴定法与田间形态鉴定纯度结果比较 Table 6 Comparison of purity by molecular marker identification and morphological identification (%)

3 讨论

棉花品种真实性和纯度鉴定结果是棉花质量监控和品种权保护的依据。利用SSR标记进行品种真实性鉴定和纯度检测在大多作物中已有报道^{[16, 17, 18]}, 在棉花品种鉴定研究中也取得了一定进展。随着分子标记技术不断简化, 完成1个品种鉴定的试验仅需1 d左右, 与形态标记相比, 具有准确、快速、经济的优势。

利用SSR标记进行品种鉴定, 引物的筛选是关键。刘国栋等^[8]认为选择标记时, 应尽量覆盖到棉花的26条染色体。本研究以具有典型代表性的材料, 从分布于棉花全基因组的586对SSR标记中筛选出26对具有稳定多态性的引物, 作为SSR分子鉴定的核心标记, 26对核心标记均匀分布于棉花26条染色体上。每条染色体上选择一对引物, 能最大限度地减少位点间的连锁, 以保证真实性和纯度鉴定时结果的可靠性。

真实性鉴定涉及不同样品之间的关系, 检测结果用不同、近似、相同表示。结果判读时, 设定不同棉花品种界定以2个差异标记为限: 当两个品种混样图谱之间2个以上差异标记时, 可判读为不同品种; 当两品种混样图谱之间有小于等于2个差异标记时, 可判读为近似品种或相同品种。26个核心标记不仅实现了不同供试样品与标准对照的鉴定, 且不同样品间也能相互区分。这与王俊芳^[18]在棉花上的研究结果一致。棉花是常异花授粉作物, 天然异交率达5%~20%^[19], 种群内遗传多样性丰富, 刘文献等^[20]认为最佳取样量应包含品种95%以上的遗传变异类型。研究

发现, 当取样量为3个单株时, 所包含的遗传变异占比为82.4%~92.3%, 随着取样量的增加, 所包含的遗传变异占比也随之增加。当取样量在12个及12个以上单株时, 品种包含的遗传变异占比均超过95%, 且随着取样量的增加占比变化幅度不显著^[11]。本文选定的15个单株取样量, 既能较好地满足群体遗传信息的要求, 又能合理控制工作量。混合样品法能够提高鉴定效率, 本试验先对5个单株叶片的DNA等量混合进行SSR鉴定, 对于同一位点上谱带不一致的组, 再对构成各组混样的单株进行检测。这种先采用混合取样鉴定, 再对表现杂合组个体鉴定的方法, 使工作量减少了4/5, 远比对单株进行检测节省时间和成本。

品种纯度的鉴定则以本品种的株数占供检样品总株数的百分率表示, 匡猛等^[21]认为用SSR标记鉴定棉花品种纯度时, 不同的统计方法与标记类型获得的分子标记检测结果差异较大; 朱美霞等^[5]认为对于纯度较高的品种只需要2~4对引物即可获得满意的检测结果; 但对于纯度较低的棉花品种, 则至少需要5对引物, 甚至10对引物才可以获得较为精确的检测结果。本研究利用5个核心标记及单位点平均法统计样品纯度。SSR标记检测结果均低于田间检测结果, 且SSR标记检测纯度较低的品种, 田间检测纯度也相对较低, 反过来也是如此, 两者呈正相关性, 表明SSR标记检测结果在一定程度上可以反应形态学检测的品种纯度高低。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

参考文献

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[19]	计怀春, 孙君灵, 周中立, 潘兆娥, 贾银华, 何守朴, 庞保印, 王立如, 杜雄明. 陆地棉繁殖群体大小对遗传完整性的影响. 棉花学报, 2014, 26: 145-152 Ji H C, Sun J L, Zhou Z L, Pan Z E, Jia Y H, He S P, Pang B Y, Wang L R, Du X M. Effects of population size on seed increase for genetic integrity of cotton. Cotton Sci, 2014, 26: 145-152 (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[20]	刘文献, 李立会, 刘伟华, 张正茂, 吴振海, 王成社. 华山新麦草居群取样策略的SSR分析. 麦类作物学报, 2006, 26: 16-20 Liu W X, Li L H, Liu W H, Zhang Z M, Wu Z H, Wang C S. SSR analysis on the sampling strategy of psathyrostachys Huashanic keng population. J Triticeae Crops, 2006, 26: 16-20 (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]
[21]	匡猛, 杨伟华, 张玉翠, 许红霞, 王延琴, 周大云, 冯新爱, 苏畅, 周红. 棉花杂交种纯度的SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性. 作物学报, 2011, 37: 2295-2305 Kuang M, Yang W H, Zhang Y C, Xu H X, Wang Y Q, Zhou D Y, Feng X A, Su C, Zhou H. Cotton hybrid purity tested by SSR markers and its correlation with phenotype identification in field. Acat Agron Sin, 2011, 37: 2295-2305 (in Chinese with English abstract) [本文引用:1]

2011

0.0

... Ashok等^[1]研究认为若种子纯度每降低1%, 那么每公顷棉花减产可达100 kg ...

2009

0.0

刘峰, 冯雪梅, 钟文, 刘玉栋, 阴祖军, 韩秀兰, 徐子初, 沈法富. 适合棉花品种鉴定的SSR核心引物的筛选. 分子植物育种, 2009, 7: 1160-1168

Liu

, Feng X

, Zhong

, Liu Y

, Yin Z

, Han X

, Xu Z

, Shen F

. Screening of SSR core primer pairs for identificating cotton cultivar. Mol Plant Breed, 2009, 7: 1160-1168 (in Chinese with English abstract)

本研究利用来自Cotton Marker Database(CMD)数据库中的2 000个引物对32份审定棉花品种基因组DNA进行了PCR扩增,筛选出26个多态性核心引物,其中11个引物被推荐为棉花品种鉴定的首选核心引物,同时提出了核心引物理论上可区分的最大品种数的计算公式:N=G1x…xGn,理论推测结果表明:利用11个首选核心引物进行棉花品种鉴定是可行的.建立在SSR指纹数据基础上的不同组合品种(系)间聚类分析以及对25份区试品系和A品种的真实性鉴定,结果表明:所有参试品种(系)遗传基础狭窄,32份审定品种间DNA水平上的差异与品种来源的系谱分析结果基本吻合,首选核心引物不仅可以对品种(系)的真实性做出鉴定,而且对遗传距离狭窄的品种(系)具有很好的鉴别力. Abstract： In this study, genomic DNA from thirty-two approved cotton cultivars were amplified with 2 000 primer pairs selecting from cotton marker database (CMD) by using polymerase chain reaction (PCR), twenty-six core primer pairs with polymorphism were selected, of which eleven core primer pairs were proposed as preferred primer pairs for identification of cotton cultivars, at the same time a formula for calculating the maximum number of cotton cultivars that the eleven core primer pairs can identify in theory was advanced: N=G1x...xGn, and according to theory, it has deduced that eleven core primer pairs were effective. Genetic clustering analysis of different combinations of cotton cutlivars (lines) used in this study and authenticity identification of A approved cutlivar and twenty-five cotton varieties in Shandong provincial regional trial were performed based on SSRs fingerprint database, the result showed that genetic basis of the tested materials were limited, difference of thirty-two approved cotton cultivars at DNA level was in accordance with the result of pedigree analysis of them, the preferred eleven core prime pairs not only can identify the authenticity of cotton cultivars (lines), but also had good power in identification of cotton cultivars (lines) with limited genetic basis.

... 由于许多形态学性状鉴定周期长、调查性状易受栽培条件及环境因素影响, 使其时效性和可靠性受到一定限制^[2], 难以及时监控市场上的种子质量问题和解决品种侵权等纠纷 ...

2015

0.0

周大云, 杨伟华, 魏守军, 王延琴, 匡猛, 马磊, 方丹, 侯爱玲. 棉种纯度和真实性3种鉴定方法简介. 中国棉花, 2015, 42(8): 5-7

Zhou D

, Yang W

, Wei S

, Wang Y

, Kuang

, Ma

, Fang

, Hou A

. A brief introduction of 3 methods for identification of purity and authenticity of cotton seed. China Cotton, 2015, 42(8): 5-7 (in Chinese)

... 分子生物学的发展使农作物品种鉴定进入基因水平, 其中以微卫星序列为基础的SSR标记具有扩增稳定可靠、重复性好等优点, 因此被广泛应用于棉花品种鉴定^[3] ...

2001

0.0

武耀廷, 张天真, 郭旺珍, 殷剑美. 陆地棉品种SSR标记的多态性及用于杂交种纯度检测的研究. 棉花学报, 2001, 13: 131-133

Wu Y

, Zhang T

, Guo W

, Yin J

. Detecting polymorphism among upland cotton ( Gossypium hirsutumL . ) cultivars and their roles in seed purity of hybrids with SSR markers. Cotton Sci, 2001, 13: 131-133 (in Chinese with English abstract)

... 武耀廷等^[4]利用48对SSR标记检测了30个陆地棉栽培品种和4个高优势杂交种亲本的多态性, 并建立了杂交种的SSR指纹图谱用于分子鉴定和纯度检测 ...

2005

0.0

朱美霞, 李英芝, 王建书, 侯英梅, 孟艳玲. 利用SSR方法鉴定棉花品种纯度. 安徽农业科学, 2005, 33: 2010-2016

Zhu M

, Li Y

, Wang J

, Hou Y

, Meng Y

. Purity identification of cotton varieties with SSR technique. J Anhui Agric Sci, 2005, 33: 2010-2016 (in Chinese with English abstract)

... 朱美霞等^[5]以5个棉花栽培品种为材料, 利用15对SSR引物确定了分析品种纯度所需引物数, 为棉花品种指纹图谱的建立提供了理论依据 ...

... 朱美霞等^[5]认为对于纯度较高的品种只需要2~4对引物即可获得满意的检测结果 ...

2007

0.0

殷剑美, 陈旭升, 狄佳春, 许乃银, 肖松华, 刘剑光, 吴巧娟. 杂交棉苏杂118的SSR指纹图谱构建. 江苏农业科学, 2007, (4): 29-31

Yin J

, Chen X

, Di J

, Xu N

, Xiao S

, Liu J

, Wu Q

. Establishment of finger printing of SSR mark for Suza 118 hybrid. Jiangsu Agric Sci, 2007, (4): 29-31 (in Chinese)

... 殷剑美等^[6]从217对引物中筛选出21对多态性引物, 构建苏杂118的SSR指纹图谱, 实现了对苏杂118真实性和纯度的快速鉴定 ...

2012

0.0

... Yu等^[7]选择105对均匀分布于染色体的引物, 对棉属6个种的12个基因型进行多态性分析, 揭示了棉属种间和陆地棉种内的DNA多态信息 ...

2013

0.0

刘国栋, 王芙蓉, 宫永超, 马和欢, 张军. 棉花品种遗传纯度的SSR分子标记鉴定技术研究. 棉花学报, 2013, 25: 382-387

Liu G

, Wang F

, Gong Y

, Ma H

, Zhang

. A new method for identification of the genetic purity of cotton varieties by SSR markers. Cotton Sci, 2013, 25: 382-387 (in Chinese with English abstract)

To establish a method for genetic purity identification of cotton ( Gossypium hirsutum L.) varieties by SSR markers, marker genotypes of 12 conventional cotton genotype varieties were surveyed using 78 pairs of core SSR primers. By comparing SSR loci from different individuals of all tested cotton varieties, the non-homozygous SSR alleles of cotton variety were divided into three typical scenarios at the molecular level. Consequently, a method for the genetic purity identification of cotton varieties using SSR markers was proposed based upon analysis of the comprehensive influences of both non-homozygous SSR loci and the rate of heterotype individuals in the cotton varieties. For the genetic purity of 12 cotton varieties tested by this method, three varieties (C5, C9 and C11) were above 98%, while two varieties (C3 and C6) were 67.31% and 31.79%, respectively. The method proposed takes into account both the influences of farraginous individuals detected by SSR markers and the inherited non-homozygous SSR loci on the purity of a cotton varieties, and therefore, provides an effective and reliable way to identify the uniformity and stability of cotton varieties.

为建立适合于SSR标记的棉花品种纯度鉴定方法，利用78个SSR标记对12个棉花常规品种进行标记基因型分析。通过比较不同品种不同单株标记基因型，发现棉花品种的非纯SSR位点存在3种主要类型。通过综合分析非纯SSR位点率和异型单株率对品种遗传纯度的影响，建立了利用SSR标记在分子水平上鉴定棉花品种纯度的方法。利用该方法鉴定的12个棉花品种中有3个品种（C5、C9和C11）的遗传纯度在98%以上，非纯SSR 位点和异型株均较高的2个品种（C3和C6）遗传纯度分别为67.31%和31.79%，该方法弥补了以往分子纯度计算方法中只考虑单株混杂、不考虑SSR位点混杂的缺陷，可比较客观地反映品种的遗传纯度状况。

... 刘国栋等^[8]利用78个SSR标记对12个棉花品种进行标记基因型分析, 通过分析非纯位点率和异型单株率对品种遗传纯度的影响, 建立了利用SSR标记鉴定棉花品种纯度的方法 ...

... org/)以及文献资料^[8,11,12]已公布的引物 ...

... 刘国栋等^[8]认为选择标记时, 应尽量覆盖到棉花的26条染色体 ...

2011

0.0

... 在盛铃期^[9]分别调查4个品种的株型、铃形、叶形等, 作为田间品种纯度鉴定的依据 ...

1997

0.0

... 1 棉花基因组DNA的提取采用改良CTAB法快速提取棉花基因组DNA^[10] ...

2014

0.0

张小娟, 陆徐忠, 何团结, 路曦结, 郑曙峰, 倪金龙, 张冰清, 杨剑波. 利用SSR分子标记进行棉花品种鉴定的研究. 棉花学报, 2014, 26: 483-491

Zhang X

, Lu X

, He T

, Lu X

, Zheng S

, Ni J

, Zhang B

, Yang J

. Identification of cotton varieties using SSR molecular markers. Cotton Sci, 2014, 26: 483-491 (in Chinese with English abstract)

利用均匀分布于棉花26条染色体上的39对SSR核心引物对16个不同来源的棉花品种样品进行区别与鉴定实验,探讨了棉花品种鉴定的取样方案和位点异同判读方法.通过比较不同取样量样品包含的遗传信息,确定了基本的取样量,并将样品间位点异同类型分为相同位点、疑似相同位点和差异位点.据此对16个品种进行位点异同性分析,结果表明同一品种的不同样品间差异位点数均在0～2间,而不同品种间的差异位点数介于5～25.结合品种间差异位点的阈值分析,研究认为当两样品间差异位点数＞2时,即判定为不同品种;当差异位点数≤2时,即判定为近似或极近似品种.

... org/)以及文献资料^[8,11,12]已公布的引物 ...

... 当取样量在12个及12个以上单株时, 品种包含的遗传变异占比均超过95%, 且随着取样量的增加占比变化幅度不显著^[11] ...

2014

0.0

聂新辉, 尤春源, 李晓方, 秦江鸿, 黄聪, 郭欢乐, 王夏青, 赵文霞, 林忠旭. 新陆早棉花品种DNA指纹图谱的构建及遗传多样性分析. 作物学报, 2014, 40: 2104-2117

Nie X

, You C

, Li X

, Qin J

, Huang

, Guo H

, Wang X

, Zhao W

, Lin Z

. Construction of DNA fingerprinting and analysis of genetic diversity for Xinluzao cotton varieties. Acta Agron Sin, 2014, 40: 2104-2117

摘　要：以新疆2013年前审定的51个新陆早常规棉花品种为材料,从5000对SSR引物中筛选出多态性高、稳定性好、且定位在棉花26条染色体上（每条染色体上选择2-3对）的75对核心引物,检测到多态性位点226个,每个标记检测到的基因型位点数在2-12之间,平均为3.01个;引物多态信息量（PIC）值介于0.0799-0.8752之间,平均值为0.6624。结果显示,在51份新陆早棉花常规品种中,可利用特征引物将21份品种一次性区分开。利用40对引物可以完全区分开新陆早51份常规品种,并构建供试品种的指纹图谱。同时利用NTSYS-pc V2.10软件聚类分析表明,51个新陆早棉花品种遗传相似系数变化范围为0.4269-0.9873,平均值为0.7071,说明新陆早棉花品种之间遗传多样性较狭窄;遗传相似系数矩阵和聚类分析将51个新陆早品种分为4大类型,与原品种选育系谱高度吻合。

... org/)以及文献资料^[8,11,12]已公布的引物 ...

2014

0.0

艾先涛, 梁亚军, 沙红, 王俊铎, 郑巨云, 吐尔逊江, 多力坤, 李雪源, 华金平. 新疆自育陆地棉品种SSR 遗传多样性分析. 作物学报, 2014, 40: 369-379

Ai X

, Liang Y

, Sha

, Wang J

, Zheng J

, Tu-Er-Xun-Jiang, Duo L K, Li X Y, Hua J P. Genetic diversity analysis on local upland cotton cultivars in Xinjiang based on SSR markers. Acta Agron Sin, 2014, 40: 369-379 (in Chinese with English abstract)

Xinjiang, the largest prior cotton production region in China, has made remarkable genetic improvement in upland cotton ( Gossypium hirsutum L.). There has been a substantial raise in yield potential , cotton-planting area and total production in Xinjiang since 1970s. The new upland cotton cultivars have contributed a lot to yield increase, in which Xinjiang-bred upland cotton varieties play an important role in cotton production in both Northern and Southern Xinjiang. However, seldom research on genetic basis of genetic diversity and pedigree relationship has been evaluated in upland cotton varieties in Xinjiang so far. This study aimed to reveal the genetic diversity of 94 upland cotton varieties in Xinjiang by genome analysis using SSR markers. The results indicated that SSR molecular markers could be employed in revealing the genetic diversity. One hundred and fifty-three polymorphic loci were detected by amplified with 54 pairs of primers with allelic variation of 2-6 per primer pair and the average of 2.93. The genotypic diversity (H’) spanned from 0.0439 to 0.7149, with the average of 0.4491. The PIC value ranged from 0.0430 to 0.6640, and the average was 0.3831. The coefficients of genetic similarity among 94 tested cultivars varied from 0.3846 to 0.9835. And more than 71.9% of similarity coefficients fell into the interval of 0.601–0.800, indicating that the genetic similarity among the cultivars was high, whereas the genetic diversity might not be abundant. According to UPGMA cluster analysis, 94 tested cultivars were divided into two clusters when the threshold valve was given as 0.63, showing the relatively simple genetic relationship among the upland cotton varieties in Xinjiang, and relatively low genetic diversity and narrow gen etic basis. The results of molecular clustering on genetic diversity of upland cotton coincided in large degree with the pedigree relationship. In conclusion, there is no much difference on molecular level among Xinjiang-bred upland cotton varieties. Materials with much wider genetic backgrounds are suggested to be used to diversify the genetic basis of cotton varieties in Xinjiang.

利用 SSR 标记对 94 份新疆自育陆地棉品种的基因组进行分析，研究新疆陆地棉品种的遗传多样性。结果 : 从分布于棉花全基因组的 206 对 SSR 标记中筛选出 54 对具有稳定多态性的引物 , 共检测出 153 个多态性位点 , 每对引物的等位变异为 2 ~ 6 个，平均为 2.93 个；基因型多样性 (H′) 变幅为 0.0439–0.7149 ，平均为 0.4491 ；引物多态信息含量 (PIC) 为 0.0430–0.6640 ，平均为 0.3831 。表明 SSR 标记在品种间可以反映较丰富的遗传多样性信息。 94 份品种间成对遗传相似系数变幅为 0.3846 ~ 0.9835 , 71.9% 的品种相似系数在 0.601~0.800 内，反映出新疆陆地棉品种间的遗传相似性相对较高。根据 UPGMA 聚类分析，在阈值为 0.63 时，将 94 份品种划分为 2 个类群，说明新疆陆地棉品种间遗传关系相对简单，品种的遗传基础相对狭窄，品种遗传组分差异较小，总体上遗传多样性不够丰富；分子聚类结果与品种本身遗传系谱背景和演变趋势吻合度较高，符合品种的真实特性。研究证明，自育品种在分子水平上差异不大，需要努力拓宽品种选育的遗传基础。

... 参考艾先涛等^[13] PCR方法, 产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 快速银染法^[14]染色(仅需12 min) ...

2000

0.0

张军, 武耀廷, 郭旺珍, 张天真. 棉花微卫星标记的PAGE/银染的快速检测. 棉花学报, 2000, 12: 267-269

Zhang

, Wu Y

, Guo W

, Zhang T

. Fast screening of microsatellite markers in cotton with PAGE/ silver staining. Cotton Sci, 2000, 12: 267-269 (in Chinese with English abstract)

摘　要：利用一种简便、快速的PAGE／银染方法检测了异源四倍体棉花栽培种陆地棉与海岛棉之间的微卫星多态性，并检测到了微卫星在陆地棉品种间的多态及微卫星标记位点在陆地棉品种间的复等位性。

... 参考艾先涛等^[13] PCR方法, 产物经8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离, 快速银染法^[14]染色(仅需12 min) ...

2000

0.0

李莉, 杨剑波, 汪秀峰, 向太和, 吴家道. 利用RAPD和微卫星标记对协优杂交稻及其亲本进行区别与鉴定. 中国水稻科学, 2000, 14: 203-207

, Yang J

, Wang X

, Xiang T

, Wu J

. Identification of Xieyou combinations of hybrid rice and their three parents by using RAPD and microsatellite markers. Chin J Rice Sci, 2000, 14: 203-207 (in Chinese with English abstract)

... 若供试样品与标准样品无差异位点, 则判定为相同品种^[15] ...

2007

0.0

... 利用SSR标记进行品种真实性鉴定和纯度检测在大多作物中已有报道^[16,17,18], 在棉花品种鉴定研究中也取得了一定进展 ...

2007

0.0

王立新, 李云伏, 常利芳, 黄岚, 李宏博, 葛玲玲, 刘丽华, 姚骥, 赵昌平. 建立小麦品种DNA指纹的方法研究. 作物学报, 2007, 33: 1738-1740

Wang L

, Li Y

, Chang L

, Huang

, Li H

, Ge L

, Liu L

, Yao

, Zhao C

. Method of ID constitution for wheat cultivars. Acta Agron Sin, 2007, 33: 1738-1740 (in Chinese with English abstract)

... 利用SSR标记进行品种真实性鉴定和纯度检测在大多作物中已有报道^[16,17,18], 在棉花品种鉴定研究中也取得了一定进展 ...

2009

0.0

... 利用SSR标记进行品种真实性鉴定和纯度检测在大多作物中已有报道^[16,17,18], 在棉花品种鉴定研究中也取得了一定进展 ...

... 这与王俊芳^[18]在棉花上的研究结果一致 ...

2014

0.0

计怀春, 孙君灵, 周中立, 潘兆娥, 贾银华, 何守朴, 庞保印, 王立如, 杜雄明. 陆地棉繁殖群体大小对遗传完整性的影响. 棉花学报, 2014, 26: 145-152

Ji H

, Sun J

, Zhou Z

, Pan Z

, Jia Y

, He S

, Pang B

, Wang L

, Du X

. Effects of population size on seed increase for genetic integrity of cotton. Cotton Sci, 2014, 26: 145-152 (in Chinese with English abstract)

利用形态标记和SSR分子标记技术分析了澳L23/757(鸡脚叶)、中棉所19(正常叶)、红桃(红叶)的25、50、100、150株不同自然授粉繁殖群体的遗传完整性.结果表明,3个种质间的形态标记的天然异交率和SSR标记遗传纯度有显著差异,但4个群体大小间的天然异交率和SSR标记遗传纯度的差异均不显著.说明棉花繁殖群体为25株时,可作为棉花种质繁殖更新过程中的最低繁殖群体量,能较好地保持繁殖种质的遗传完整性.

... 棉花是常异花授粉作物, 天然异交率达5%~20%^[19], 种群内遗传多样性丰富, 刘文献等^[20]认为最佳取样量应包含品种95%以上的遗传变异类型 ...

2006

0.0

刘文献, 李立会, 刘伟华, 张正茂, 吴振海, 王成社. 华山新麦草居群取样策略的SSR分析. 麦类作物学报, 2006, 26: 16-20

Liu W

, Li L

, Liu W

, Zhang Z

, Wu Z

, Wang C

. SSR analysis on the sampling strategy of psathyrostachys Huashanic keng population. J Triticeae Crops, 2006, 26: 16-20 (in Chinese with English abstract)

To investigate the Genetic diversity of Chinese endemic grass species Psathyrostachys huashanica Keng effectively,two natural populations distributed in altitude of Huangpuyu(500 m) and Dafuyu(1 218 m) were evaluated by 10 pairs of simple sequence repeat(

为了研究我国特有植物华山新麦草（Psath yrostachys huashanica Keng）的遗传多样性并获得更为科学、合理的结论，以分布于不同海拔高度黄埔峪（海拔500m）和大夫峪（海拔1218m）的2个华山新麦草居群为研究对象，每个居群分单株采集30株并以6、10、14、18、22、26和30株为单位，利用10对SSR引物对其遗传多样性进行分析。结果表明：（1）分布于较低海拔的黄埔峪居群的平均等住变异数（6．3）和遗传多样性指数（0．713）大于分布于较高海拔的大夫峪居群的等位变异数（5．1）和遗传多样性指数（0．662）；（2）随着分析单位个体数目从6株增加到30株，黄埔峪居群和大夫峪居群的等位变异数（42～63和43～51）和遗传多样性指数（0．643～0．713和0．618～0．662）均表现增大的趋势，但当分析单住的个体数目达到26株以上时，等位变异数和遗传多样性指数基本不再发生变化；（3）当分析单位个体数目为18株时，2个居群的等位变异数和遗传多样性指数分别包含了各自居群95％以上的遗传变异，建议在利用SSR技术进行华山新麦草居群遗传多样性研究中，以单个居群随机采集18株华山新麦草为最佳分析单位个体数目。

... 棉花是常异花授粉作物, 天然异交率达5%~20%^[19], 种群内遗传多样性丰富, 刘文献等^[20]认为最佳取样量应包含品种95%以上的遗传变异类型 ...

2011

0.0

匡猛, 杨伟华, 张玉翠, 许红霞, 王延琴, 周大云, 冯新爱, 苏畅, 周红. 棉花杂交种纯度的SSR标记检测及其与田间表型鉴定的相关性. 作物学报, 2011, 37: 2295-2305

Kuang

, Yang W

, Zhang Y

, Xu H

, Wang Y

, Zhou D

, Feng X

, Su

, Zhou

. Cotton hybrid purity tested by SSR markers and its correlation with phenotype identification in field. Acat Agron Sin, 2011, 37: 2295-2305 (in Chinese with English abstract)

Cotton is one of the most important cash corps. Hybrid cotton is extensively grown in China. Hybrid seeds are generally planted and used for purity identification. The processtakes long time and much money. Therefore, it is important to explore a new method to inspect the purity of hybrid cotton. In order to explore the validity of hybrid cotton purity identification using SSR marker technique, the purity for six hybrids was tested by SSR approach and morphological assessment, and the correlation between the two methods was researched. Primers with complementary band type screened out from 36 evenly distributed SSR pairs were applied in purity identification. Morphological traits including plant type, boll, leaf shape, flower and stem were observed. Two statistics methods were used for testingpurity based on SSR marker, and the results were compared to that of morphological identification. Among the six hybrid cottons, 34 primer pairs had 101 heterozygous loci, with an average of 16.8 heterozygous loci for on each hybrid. The purity based on morphology was higher than that on SSR markers, the results of “Single locus on average” (the average value of purity test by each SSR locus) had a higher correlation with morphology compared to “Double locus difference” (if more than two SSR loci of an individual are different from the tested cultivar’s, the individual is considered as farraginous plant), and the correlation would be better after calibration (correlation coefficient reached to 0.7841). Correlation based on EST-SSR was much better than that on Genomic-SSR. There was certain relativity at different loci of the same chromosome. The purity was relevant to different statistics method and marker type. There will be a good correlation for purity identification between methods of SSR marker and morphology if the hybrid parents are highly pure.

以分布于棉花26条染色体的36对SSR核心引物，在6份成套中棉所系列杂交种间筛选双亲互补型杂合位点作为纯度检测标记, 采用单位点平均法与双位点差异法统计SSR标记检测结果; 在棉铃期考察棉花株型、铃形、叶形、花及茎等性状, 比对田间表型与分子检测结果, 分析相关性。结果表明, 34对核心引物在6个杂交种上获得101个杂合位点，平均每个杂交种具有16.8个。田间表型鉴定结果高于分子标记检测结果，单位点平均法的相关性高于双位点差异法，校正后的相关性进一步提高，相关系数 r =0.7841，呈高度相关。EST-SSR标记的检测结果与田间表型鉴定结果的相关性显著高于Genomic-SSR标记。相同染色体上的不同引物检测结果差异较小。不同的统计方法与标记类型获得的分子标记检测结果差异较大。高度纯合的亲本将会有效提高分子标记鉴定结果与表型鉴定结果的相关性。

... 品种纯度的鉴定则以本品种的株数占供检样品总株数的百分率表示, 匡猛等^[21]认为用SSR标记鉴定棉花品种纯度时, 不同的统计方法与标记类型获得的分子标记检测结果差异较大 ...