2014— 2015年在扬州大学江苏省栽培生理重点实验室进行盆栽试验。盆钵直径40 cm, 高50 cm, 每盆装土20 kg过筛的沙壤土。以转Bt基因棉常规品种泗抗1号和杂交品种泗抗3号为材料(分别以代号SK-1和SK-3表示), 4月3日营养钵播种育苗, 5月15日移栽于盆钵。2年盆钵土壤含有机质1.88%、水解氮134.7 mg kg^-1、速效磷22.5 mg kg^-1和速效钾81.3 mg kg^-1。根据本地高产栽培技术要求进行肥料与化控运筹。

2014年盛蕾期设置4个土壤涝渍处理, 即Y1 (土壤含水量为最大持水量的90%)、Y2 (土壤含水量为最大持水量)、Y3 (土壤淹水, 土表上方保持2 cm水层)、CK (土壤含水量为土壤最大持水量的75%)。所有水分逆境处理持续96 h。

在盛蕾期前10 d控制水分, 如遇下雨, 将处理盆钵移入防雨棚内。使用WET土壤三参数速测仪(HH2)监测土壤水分, 根据土壤饱和含水量, 用称重法调控土壤水分, 即当监测发现土壤水分低于设计值时, 于早、中、晚分别进行定量补水, 保持土壤持水量在处理水平。

在2014年试验研究基础上, 2015年以土壤持水量为最大持水量90%作为水渍试验处理, 探讨水分胁迫持续时间对Bt棉棉蕾杀虫蛋白表达影响。于盛蕾期设置土壤水渍持续24、48、72、96和120 h处理。同时设对照(CK, 土壤含水量为最大持水量的75%)。各处理土壤水分的调控方法与2014年试验相同。

试验胁迫处理完毕后, 取相同部位相15日龄的棉蕾, 液氮冷冻后贮存于-20℃低温冰箱, 用于测定其Bt蛋白浓度、氮代谢主要物质含量及关键酶活性。

应用酶联免疫法(ELISA)测定Bt杀虫蛋白含量, 药盒由中国农业大学提供。应用G-250考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白含量。应用抗坏血酸茚三酮染色法测定游离氨基酸含量。谷氨酸丙酮酸转氨酶(GPT)和谷氨酸草酰乙酸转氨酶(GOT)活性鲜样经Tris-HCl缓冲液研磨离心后, 用赖氏比色法测定提取液。分别用考马斯亮蓝法、茚三酮和抗坏血酸比色法测定可溶性蛋白质含量、游离氨基酸含量, 计算蛋白酶和肽酶活性。采用磺胺比色法测定硝酸还原酶活性。参照文献[17]测定谷氨酰胺合成酶(GS)活性和谷氨酸合成酶(GOGAT)活性, 参照赵鹏等^[18]和闫桂萍等^[19]方法测定GOGAT活性。

运用Microsoft Excel、SPSS16.0等软件统计分析数据。

图1-A表明, 随着土壤涝渍程度加大, 棉蕾中Bt蛋白含量明显下降, 且随着土壤涝渍程度的加大, 下降幅度越大。与对照比, 常规种SK-1在Y1、Y2和Y3处理下, 棉蕾中Bt蛋白含量分别下降36.5%、42.1%和51.4%; 杂交种SK-3分别下降19.2%、57.2%和64.5%。多重比较表明, 在土壤持水量为90%时(Y1处理)就已显著低于对照。杂交种的下降速度大于常规种。

图1-B表明, 随着土壤涝渍时间的延长, 棉蕾中杀虫蛋白表达量呈下降趋势, 且持续时间越长下降幅度越大。与对照比, 在胁迫96 h后Bt蛋白表达量显著下降, 其中, 常规种SK-1下降20.8%, 杂交种SK-3下降17.6%。随胁迫时间的延长, 杂交种SK-3下降幅度大于常规种SK-1。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 不同涝渍程度(A)和涝渍持续时间(B)对2个品种棉蕾中Bt蛋白含量的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 1 Effects of water logging on bud Bt protein content of cultivars in different levels (A) and different water logging stress (B) Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

图2-A、B表明, 随着土壤涝渍程度的加大, 棉蕾中游离性氨基酸含量显著上升, 而可溶性蛋白含量显著下降。与对照相比, 常规种SK-1在Y1、Y2和Y3处理下游离性氨基酸含量分别增加18.3%、30.1%和59.6%; 杂交种SK-3分别增加16.3%、31.7%和48.4%。随土壤涝渍程度增加, 游离性氨基酸含量上升幅度加大, 且在土壤相对含水量为90% (Y1处理)时, 棉蕾中氨基酸含量已显著高于对照。

常规种SK-1在Y1、Y2和Y3处理下, 棉蕾中可溶性蛋白分别下降了16.9%、25.6%和44.3%; 杂交种SK-3分别下降8.1%、28.6%和50.6%。随土壤涝渍程度的增加, 可溶性蛋白含量下降幅度也增加, 且同样在土壤相对含水量为90% (Y1处理)时, 棉蕾中可溶性蛋白含量已显著低于对照。

图2-C、D表明, 随着土壤涝渍持续时间的延长, 棉蕾中游离性氨基酸含量呈上升趋势, 而可溶性蛋白含量呈下降趋势。游离性氨基酸含量在胁迫96 h后显著增加, SK-1增加11.6%, SK-3增加10.7%, 且随着持续时间的延长上升幅度越大。品种间表现为SK-3随涝渍胁迫时间的延长, 增加幅度较SK-1大。可溶性蛋白在持续胁迫96 h后显著下降, SK-1下降20.7%, SK-3下降28.7%, 且随胁迫持续时间的延长下降的幅度也越大。品种间表现为随胁迫持续时间的延长, 杂交种SK-3下降幅度比常规种大。

图2

Fig. 2

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	图2 不同涝渍程度(A, B)和涝渍持续时间(C, D)对2个品种棉蕾中游离性氨基酸和可溶性蛋白含量的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 2 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on free amino acids and soluble protein contents in bud of cultivars Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

图3表明, 硝酸还原酶活性随涝渍程度的增加或胁迫时间的延长都呈下降趋势。与对照相比, SK-1在Y1、Y2和Y3处理下硝酸还原酶活性分别下降30.0%、25.6%和44.3%; SK-3分别下降25.0%、35.6%和56.3%。无论常规种还是杂交种在土壤相对持水量为90% (Y1处理)时硝酸还原酶活性就已经显著下降。90%相对持水量96 h后棉蕾硝酸还原酶活性开始显著下降, SK-1下降22.7%, SK-3下降33.3%, 且随持续胁迫时间的延长下降幅度越大。品种间表现为随胁迫时间的延长SK-3下降速度较SK-1快。

图3

Fig. 3

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	图3 不同涝渍程度(A)和涝渍持续时间(B)对2个品种棉蕾中硝酸还原酶活性的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 3 Effects of water logging level (A) and duration time (B) on NR activity in bud of cultivars Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

图4-A、B表明, 随着土壤涝渍程度的加大, 棉蕾中GPT和GOT含量均呈明显下降趋势, 且随土壤涝渍程度的增加下降幅度也越大。与对照相比, 常规种SK-1在Y1、Y2和Y3处理下棉蕾中GPT活性分别下降17.8%、27.3%和45.3%; 杂交种SK-3分别下降12.8%、22.5%和45.0%, 且在土壤持水量为90%时(Y1处理)就已与对照产生显著差异。不同涝渍程度下棉蕾GOT活性变化表现相同的效应。

图4-C、D表明, 2个不同类型Bt棉品种盛蕾期90%土壤持水量持续胁迫24~120 h, 棉蕾中GPT、GOT活性都随着胁迫时间延长呈下降趋势, 且胁迫时间越长, 下降幅度越大。与对照(未胁迫)相比, GPT活性在胁迫96 h后显著下降, SK-1下降21.3%, SK-3下降17.2%。品种间表现为随着涝渍胁迫时间的延长SK-3下降速率较SK-1大。GOT同样在胁迫96 h后显著下降, SK-1下降23.3%, SK-3下降21.2%。品种间表现为随着涝渍持续时间的延长, SK-3下降速度较SK-1快。

图4

Fig. 4

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	图4 不同涝渍程度(A, B)和涝渍持续时间(C, D)对2个品种棉蕾中GPT和GOT活性的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 4 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on GPT and GOT activities in bud of two cultivars Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

图5-A、B表明, 随着土壤涝渍程度的加大, 棉蕾中GS和GOGAT活性都呈显著下降趋势, 且随着土壤涝渍程度的加大, 下降幅度也越大。与对照相比, 常规种SK-1 Y1、Y2和Y3处理下, GS活性分别下降26.1%、31.1%和71.5%, 杂交种SK-3分别下降30.1%、34.2%和63.0%, 且在土壤持水量为90%时(Y1处理)就已与对照产生显著差异。不同涝渍程度下棉蕾GOGAT活性变化表现相同的效应。

图5-C、D表明, 2个不同类型的Bt棉品种在土壤水渍持续胁迫24~120 h条件下, 盛蕾期棉蕾中GS和GOGAT活性随着胁迫时间延长都呈下降趋势, 且胁迫时间越长, 下降幅度越大。与对照(未胁迫)相比, 盛蕾期棉蕾在胁迫96 h后GS活性显著下降, SK-1下降28.5%, SK-3下降16.3%。随着水渍胁迫时间的延长SK-3下降速率较SK-1增大。棉蕾中GOGAT活性表现为同样的趋势。

图5

Fig. 5

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	图5 不同涝渍程度(A和B)和涝渍持续时间(C和D)对2个品种棉蕾中GS和GOGAT活性的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 5 Effects of water logging level (A and B) and duration time (C and D) on GS and GOGAT activities in bud two cultivars Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

图6-A、B表明, 随着土壤涝渍程度的增加, 棉蕾中蛋白酶和肽酶活性都呈明显的增加趋势, 且随着土壤涝渍程度的加大, 增加幅度也越大。与对照相比, 常规种SK-1在Y1、Y2和Y3处理下, 棉蕾中蛋白酶活性分别上升103.2%、142.8%和184.7%; 杂交种SK-3分别上升44.3%、73.5%和142.7%, 且在土壤相对持水量90% (处理Y1)时就已显著增加。在不同涝渍程度下棉蕾肽酶活性变化表现相同的效应。

图6-C、D表明, 对2个不同类型的Bt棉品种, 土壤水渍持续胁迫24~120 h使盛蕾期棉蕾中蛋白酶和肽酶活性随着胁迫时间延长呈上升趋势, 且胁迫时间越长, 增加幅度越大。与对照(未胁迫)相比, 棉蕾中蛋白酶活性在胁迫96 h后显著增加, SK-1增加19.7%, SK-3增加22.5%。品种间相比表现为杂交种SK-3随着水渍胁迫时间的延长, 上升速率较SK-1大。肽酶活性同样在胁迫96 h后显著增加, SK-1增加30.2%, SK-3增加34.8%。品种间相比表现为杂交种SK-3随着水渍胁迫时间的延长, 上升速率较SK-1大。

图6

Fig. 6

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	图6 不同涝渍程度(A, B)和涝渍持续时间(C, D)对2个品种棉蕾中蛋白酶和肽酶活性的影响 标以不同字母的柱值在0.05水平上差异显著。Fig. 6 Effects of water logging level (A, B) and duration time (C, D) on protease and peptidase activities in bud of cultivars Bars indexed with different letters are significantly different at the 0.05 probability level.

表1和表2表明, 无论是在不同涝渍程度, 还是持续胁迫条件下, 2个类型品种盛蕾期棉蕾中杀虫蛋白含量均与可溶性蛋白含量, 硝酸还原酶、GOT、GPT、GS和GOGAT活性呈显著正相关; 与游离性氨基酸含量, 肽酶、蛋白酶活性呈极显著负相关。涝渍逆境下可溶性蛋白含量、硝酸还原酶、GOT、GPT、GS和GOGAT活性下降, 游离性氨基酸含量, 肽酶、蛋白酶活性增加进一步说明涝渍逆境下, 棉蕾蛋白质合成能力下降、分解能力增强, 导致Bt杀虫蛋白表达量下降, 从而抗虫能力下降。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同涝渍程度条件下生殖器官Bt杀虫蛋白含量与氮代谢相关物质和关键酶活性的相关性分析 Table 1 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under water logging 品种 Cultivar 可溶性蛋白 Soluble protein 游离性氨基酸 Amino acid NR GOT GPT GS GOGAT 肽酶 Peptide 蛋白酶 Protease SK-1 0.923* * -0.906* * 0.969* * 0.930* * 0.932* * 0.879* * 0.798* * -0.953* * -0.987* * SK-3 0.945* * -0.967* * 0.939* * 0.945* * 0.916* * 0.888* * 0.967* * -0.940* * -0.920* * * * 表示极显著相关(P< 0.01)。* * Significantly correlation at P< 0.01.

表1 不同涝渍程度条件下生殖器官Bt杀虫蛋白含量与氮代谢相关物质和关键酶活性的相关性分析 Table 1 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under water logging

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 水分涝渍持续胁迫下杀虫蛋白含量与氮代谢相关物质和关键酶活性相关性分析 Table 2 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under waterlogging stress 品种Cultivar 可溶性蛋白 Soluble protein 游离性氨基酸 Amino acid NR GOT GPT GS GOGAT 肽酶 Peptide 蛋白酶 Protease SK-1 0.998* * -0.993* * 0.998* * 0.999* * 0.980* * 0.998* * 0.997* * -0.990* * -0.997* * SK-3 0.985* * -0.974* * 0.953* * 0.976* * 0.993* * 1.000* * 0.987* * -0.950* * -0.987* * * * 表示极显著相关(P< 0.01)。* * Significantly correlation at P< 0.01.

表2 水分涝渍持续胁迫下杀虫蛋白含量与氮代谢相关物质和关键酶活性相关性分析 Table 2 Correlation coefficients of insecticidal protein content with substances related to nitrogen metabolism and key enzyme activities under waterlogging stress

国内外研究已表明土壤淹水对Bt棉抗虫性有明显的抑制作用, 但当涝渍解除后, Bt棉的抗虫性仍可得到恢复^{[20, 21]}。王永慧等^[22]研究指出同一生育期, 高温高湿度下叶片Bt蛋白含量降幅最小, 胁迫解除后恢复能力最强; 低温低湿度下叶片Bt蛋白含量降幅最大, 恢复能力最弱。束春娥等^[23]研究发现连续2日以上50 mm暴雨就能降低叶片40%~50% Bt蛋白表达量, 但上述研究主要集中于水分对叶片抗虫性影响。本研究表明, 土壤水分由最大持水量的90%至淹水2 cm的涝渍逆境胁迫4 d时, 无论常规种还是杂交种, 棉蕾的Bt蛋白含量显著下降, 且随着土壤涝渍程度的加大, 下降幅度也越大, 在土壤持水量为最大持水量的90%时就已与对照产生显著差异。而在土壤持水量为最大持水量的90%的水渍逆境胁迫下, 棉蕾的Bt蛋白含量在胁迫至96 h后就显著下降。这表明, Bt棉棉蕾发育阶段短时间轻度的涝渍都可能影响棉蕾中Bt杀虫蛋白的表达量, 从而影响抗虫性。因此在棉花盛蕾期要及时排水, 避免3 d及以上的涝渍影响Bt棉蕾的抗虫性。

此外, 本文中杂交种的Bt蛋白含量和其他氮代谢的本底水平(即对照处理的含量)均高于常规种, 且两个类型品种间Bt蛋白表达量也具显著差异, 这可能与杂种优势有关。正常情况下, 具有杂种优势的杂交种抗逆性更强。但是, 在涝渍胁迫条件下, 杂交种Bt蛋白含量下降速度比常规种更快, 这可能与杂交种外来基因的翻译过程更易受外界环境影响有关^[24]。

在环境影响Bt棉抗虫性下降机理上, 国内外学者有较多的研究^{[25, 26, 27, 28, 29]}, 陈德华等^[30]研究发现高温胁迫下Bt棉杀虫蛋白表达量的变化与氮代谢有着密切关系, 高温引起叶片Bt蛋白含量的下降是蛋白质合成能力下降, 分解能力增强的结果。吕春花等^[31]研究也表明, 高温逆境下Bt棉生殖器官蕾铃中氮代谢合成关键酶GPT、GOT活性及可溶性蛋白含量与Bt杀虫蛋白含量成显著正相关; 氮代谢分解关键酶蛋白酶活性、氨基酸含量与Bt杀虫蛋白含量成显著负相关。本研究同样表明, 水渍逆境下, Bt棉棉蕾中Bt杀虫蛋白表达量同样与氮代谢生理密切相关。在土壤不同程度涝渍胁迫4 d及持水量90%持续胁迫逆境下, 盛蕾期棉蕾的可溶性蛋白含量、NR、GPT、GOT、GS、GOGAT活性下降, 而氨基酸含量、肽酶、蛋白酶活性增加, 且随涝渍程度加大或胁迫时间延长, 增加或下降的幅度越大。由此可见, 水渍逆境使Bt棉蕾的蛋白质合成能力下降, 分解能力增强, 从而导致Bt杀虫蛋白表达量下降。因此, 在涝渍逆境下通过外部手段促进棉蕾中与蛋白质合成相关的酶活性, 降低与分解相关的酶活性可能会有利于增加棉蕾Bt杀虫蛋白含量, 增强其抗虫性。