甘蓝型油菜常规品种中双10号(ZS10)原始种子由中国农业科学院油料作物研究所张学昆研究员惠赠。为尽量提高试验结果的准确性, 将非胁迫植株种植在温室临近的田间网室, 接近自然条件, 整个生长期间没有显著的高温和干旱胁迫。将胁迫植株种植在玻璃温室, 在油菜植株进入抽薹期至收获期期间, 也就是在植株木质素合成与积累的旺盛期, 玻璃温室内温度在阴雨天比田间网室平均高2~5℃, 在强日照时平均比田间网室高5~10℃ (最高达38℃), 可以很好模拟高温干旱胁迫环境。当胁迫植株叶片出现萎蔫迹象时适当浇水(土壤含水量长时间保持在15%以下)。

取成熟期植株的中部茎秆和根, 用于冰冻切片组织化学染色观察和木质素总体含量极其单体成分的分析。本研究创立了针对油菜各组织器官的切片方法。

1.2.1 样品包埋 首先打开Leica CM1850冰冻切片机, 将机箱温度降到-20℃, 切取适合大小的新鲜茎秆和根的样品包埋, 在包埋样品时避免样品周围形成气泡。

1.2.2 回温处理 将机箱温度回升到-8 ~ -12℃保持30 min以上, 切片时的机箱温度可根据切片效果再次具体优化。

1.2.3 切片 按照切片机使用说明书切片。将切好的样片用预冷的毛笔或毛刷刷到盛水的培养皿里(最好事先在冰面预冷), 然后将培养皿放在冰面暂时保存。

1.2.4 切片组织化学染色 采用Phloroglucinol- HCl和Mä ule染色法^{[16, 33]}。Phloroglucinol HCl染色顺序为, 滴加适量1%间苯三酚溶液在切片上处理3~5 min→ 滴加适量浓HCl显色→ 盖上盖玻片吸掉多余的染液。Mä ule染色:在切片上滴加适量的1%高锰酸钾溶液, 浸染5 min→ 用蒸馏水清洗3次→ 滴加3% HCl浸泡2 min→ 用蒸馏水清洗3~5次→ 滴加29%氨水浸2 min→ 盖上盖玻片吸掉多余的染液。Mä ule染色可使G型木质素染为棕色, 使S型木质素染为红色^{[7, 16, 19]}。

1.2.5 显微观察 将染色的样片或者没有经染色处理的样片放在Nikon SMZ1500和Olympus MUX10体视显微镜以及Nikon Eclipse E600显微镜下, 根据仪器使用说明书观察。

所有提取试验过程都在通风橱内完成, 依据前人研究报道的方法^{[34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41]}, 并适当调整和优化处理。

1.3.1 细胞壁分离 将待测材料烘干打粉, 过80目筛; 称取60~70 mg样品装入带螺旋盖的2 mL离心管中进行细胞壁分离^[34], 完成后加入无水乙醇脱水。

1.3.2 总木质素含量测定 采用溴乙酰法^{[35, 36, 37]}并有改进, 测定总木质素含量。称取上一步所得的细胞壁成分1.5~2 mg, 加入200 µ L新鲜配制的25%溴乙酰溶液(用冰醋酸配制), 50℃条件下反应3 h, 期间每15 min振荡混匀一次。反应结束后冰浴至室温, 加2 mol L^-1氢氧化钠溶液800 µ L和新鲜配制的0.5 mol L^-1盐酸羟胺溶液140 µ L, 振荡混匀。将混合液转至15 mL具塞刻度试管中, 加冰醋酸稀释至15 mL, 混匀, 测定280 nm波长下的吸光度值。根据公式%ABSL= , 计算出木质素的百分含量ABSL, 其中Abs为吸光度值, Coeff为消光系数且Coeff = 23.35 g L^-1 cm^{-1 [36]}。

1.3.3 木质素单体测定 采用硫代酸解法^{[34, 38, 39, 40, 41]}并有改进, 测定木质素单体成分。称取第(1)步中得到的细胞壁成分5 mg, 加入带螺旋盖(带有聚四氟乙烯材质内垫)的5 mL刻度试管中。加新鲜配制好的裂解液1 mL (2.5%BF3和10%EtSH)。向试管中填充氮气, 100℃加热反应4 h, 每1 h振荡一次。待反应完成后冰浴冷却5 min。加0.4 mol L^-1 NaHCO₃溶液300 µ L, 调pH值到3~4。加蒸馏水2 mL、1 mg µ L^-1的用乙酸乙酯配制的二十四烷内标溶液100 µ L和乙酸乙酯900 µ L, 充分涡旋振荡30 s, 静置10 min使溶液分层。吸取300 µ L上层有机相到2 mL的离心管中。氮气吹干, 加200 µ L丙酮溶解, 继续用氮气吹干, 重复操作一次。最后加入500 µ L乙酸乙酯溶解, 用孔径为0.22 µ m的尼龙膜过滤。

上机前样品衍生化处理:取100 µ L上述得到的提取液到内插管内, 加入20 µ L吡啶, 100 µ L N, O-双(三甲基硅基)乙酰胺进行TMS衍生化, 25℃条件下反应2 h后采用Agilent 7000C三重四极杆GC-MS。上机条件:气象色谱柱采用Agilent HP-5 MS column (30.00 mm × 0.25 mm × 0.25 μ m); 进样量1 µ L, 分流模式; 进样口和检测器温度设为250℃; 载气为高纯氦气, 载气流速1.1 mL min^-1; 柱初始温度130℃下保留3 min, 然后以3℃ min^-1升温到250℃并且保留5 min, 再回到初始温度130℃, 其中溶剂延迟时长为30 min。

最后根据内标二十四烷进行各木质素单体的定量分析。H、G和S型分别对应的特征质荷比为239、269和299 m z^-1, 二十四烷对应的特征质荷比为57 m z^-1。

通过对比分析发现, 胁迫植株的茎和根中木质化组织被Phloroglucinol-HCl染色法^[42]和Mä ule染色法染出的颜色都比正常植株更深, 表明高温干旱胁迫导致全株木质素积累量明显增高(图1)。

图1

Fig. 1

Figure Option ViewDownloadNew Window

图1 成熟期植株中部茎(A~D)和根切片(E~H) A、B和E~H:Phloroglucinol-HCl染色法; C和D:Mä ule染色法。E和F:维管束间纤维较多类型的根切片; G和H:维管束间纤维较少类型的根切片。if:维管束间纤维; ph:韧皮部; pi:髓部; xy:木质部; ve:导管。A~D:bar = 200 μ m; E~H:bar = 500 μ m。Fig. 1 Sections of middle stem (A-D) and root (E-H) at mature stage A, B, and E-H:Phloroglucinol-HCl staining; C and D:Mä ule staining. E and F:root cross-sections with more interfascicular fibers; G and H:root cross-sections with less interfascicular fibers. if:interfascicular; ph:phloem; pi:pith; xy:xylem; ve:vessel. A-D:bar = 200 μ m; E-H:bar = 500 μ m.

对比经Mä ule染色法染色的茎秆切片(图1-C, 图1-D), 很容易看出胁迫植株的维管束间纤维被染出的红色更深, 表明其S型木质素含量更高。从形态学看, 胁迫植株的木质部比正常植株更厚(图1), 茎杆中导管的孔径明显变小(图1-A, 图1-D), 但是胁迫植株的根中导管的孔径却比正常植株明显大很多(图1-E和图1-F), 尤其是在纤维细胞所占比例较小的类型中(图1-G, 图1-H), 我们将油菜植株的根分为2个主要类型, 一种是纤维细胞所占比例较大的, 另一种是纤维细胞所占比例较小的, 另外其导管数量也明显增加。以上表明, 长期高温干旱胁迫下茎和根的木质化程度会大大提高。

2.2.1 木质素总体含量分析 根中木质素的含量比茎中显著高很多(图2), 根中木质素的百分含量(15.56%)比茎(12.29%)平均高3.27个百分点, 这主要是因为根部木质化组织所占体积比例比茎中高, 茎中存在大量髓部。胁迫茎的木质素含量(16.18%)比正常植株茎中(12.29%)显著高, 平均高3.89个百分点(图2)。这与前面的组织化学染色观察分析结果一致。进一步证明长期高温干旱胁迫下的油菜植株更加倾向于合成较多木质素, 以增加抗逆性。

2.2.2 木质素单体成分分析 不同环境下生长的植株茎秆中木质素单体构成之间存在显著差异(表1)。就被解离出的木质素单体总量(H + G + S)而言, 虽然胁迫茎的木质素含量比正常茎高31.64%, 但是胁迫茎被解离出的木质素单体总量却比正常茎降低了40.08%, 这也说明胁迫茎木质素的结构中含有更高比例的缩合键。另外胁迫茎中S型木质素所占比例比正常植株茎有显著增高, 胁迫茎的S/G值(1.82)比正常植株茎(1.29)高出41.09%。表明长期高温干旱胁迫下植株倾向积累更高比例的S型木质素。

油菜植株的茎秆和根的木质素单体成分构成之间也存在巨大差异(表1和图3)。虽然正常植株的根中测得的木质素含量比茎中高26.60%, 但对于木质素单体总量而言根却比茎低62.71% (表1), 这一结果表明根中木质素的结构含有更高比例的缩合键。H型木质素在双子叶被子植物中普遍很低, 一般所占单体总量的比例都低于1%或1%左右。经过测定显示, 油菜植株根中的H型单体所占比例基本都高于5%, 接近于茎的10倍(表1和图3)。另外, 根中G型木质素所含比例(62.28%)比茎中(43.35%)明显高很多, 根的S/G值(0.49)比茎中(1.29)也就低很多, 表明油菜茎中是S型木质素占主体, 而根中却是G型木质素占主体(表1和图3)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 木质素单体含量 Table 1 Lignin monomer content (%) 组织 Tissue H + G + S H G S S/G 正常茎 Normal stem 484.05 ± 90.40 0.83 ± 0.08 43.35 ± 0.25 55.82 ± 0.26 1.29 胁迫茎 Stressed stem 290.53 ± 8.07 0.66 ± 0.20 35.26 ± 0.59 64.08 ± 0.39 1.82 正常根 Normal stem 180.50 ± 8.22 7.43 ± 0.67 62.28 ± 2.68 30.29 ± 2.24 0.49

表1 木质素单体含量 Table 1 Lignin monomer content (%)

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 成熟期植株茎和根的总木质素含量 * 表示在0.01水平差异显著。Fig. 2 Total lignin content of mature plant stem and root * Significantly different at the 0.01 probability level.

图3

Fig. 3

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图3 GC-MS测定正常植株茎和根以及胁迫茎中木质素单体的色谱图 IS:二十四烷内标; H1、H2、G1、G2、S1和S2代表对应H、G和S木质素单体的同分异构体。Fig. 3 GC-MS detection of lignin monomers in stem and root of CK plants and in stem of stressed plants IS:internal standard tetracosane; H1, H2, G1, G2, S1, and S2 represent the isomers of corresponding H, G, and S.

对比分析发现, 胁迫植株的茎和根的切片被染出的颜色比正常生长下更深, 显示茎和根的木质化程度要高很多, 木质部也更厚, 木质素含量更高, 说明高温干旱下会促进木质素合成和细胞壁增厚, 减少水分散失, 并抵抗其他各种逆境^{[23, 43]}。

从形态学对比分析表明, 胁迫茎中木质部面积占比更大, 导管孔径更小, 但其根中的导管孔径更大, 且导管数量更多, 推测其原因是高温干旱下根部适应于吸取更多水分而其维管系统变得更发达, 地上部则适应减少水分散失其导管孔径就变小, 胞壁木质化程度就提高。总而言之, 油菜植株在抵御长期高温干旱逆境时, 其维管系统生长发育从不同器官组织的多个方面发生针对性的适应性改变。

硫代酸解法测定木质素单体, 主要是使木质素单体之间稳定性较差的β -O-4化学键断裂, 从而解离出对应的木质素单体, 它并不能解离内部含有抗性键(resistant inter-unit bonds)或被称为缩合键(condensed bonds)类型的木质素^{[38, 44]}。虽然胁迫茎所含木质素含量比正常茎高出很多, 但是胁迫茎被硫代酸解出来的木质素单体总量却下降了不少, 胁迫茎被解离出的H、G和S的总量比正常茎降低了40.08%, 这也说明在高温干旱下植株所合成的木质素结构中含有更高比例的缩合键, 造成被解离出的木质素单体含量较少。另外胁迫茎的S/G的比值比正常茎也高41.09%, 可能是因为长期高温干旱胁迫下植株在增强木质素合成以及提高木质素单体间缩合键的同时, 也合成了较高比例的S型木质素, 从而增强植株茎秆的机械强度和致密度, 进而增强抗旱和耐高温的能力。目前关于高温干旱对植株木质素结构的影响还很少有报道。Moura-Sobczak等^[22]对桉树干旱胁迫处理发现, 桉树中S/G值明显升高, 并指出不管是S型木质素含量的升高还是G型木质素含量的下降都在桉树适应干旱环境中起到重要的作用。

对比正常植株的茎和根之间解离出的木质素单体总量, 发现虽然根中的木质素含量比茎要高, 但是其被解离出的木质素单体总量却低很多, 说明根比茎含有更高比例的缩合键。其原因很可能是由于根木质素组成中含有更高比例的H和G型木质素单体, 因为H型和G型木质素单体的苯环甲基化程度比S型更低, 所以它们之间的连接就更容易形成缩合键^[1]。Ruel等^[45]指出缩合型木质素主要含G型木质素, 而非缩合型木质素主要含S型木质素。

在根中, S型木质素单体都比G型含量明显低很多, 并且H型木质素含量所占比例也比茎高, 茎中H含量所占比例为0.83%, 而根中则达到7.43%。根木质素结构中这种高比例H型和G型木质素有可能是因为其硬度或刚性不必像茎秆那么强, 而韧性或可弯曲性则应该更强, 便于其在地下弯曲生长, 高比例的H型和G型木质素就很有可能是有助于根这种本身特性的形成。

从系统性讲, 本研究理应对高温干旱胁迫处理后根木质素的变化也进行GC-MS测定, 但却没有测定, 这是由于从组织切片已看出根中发生了与茎中类似的变化趋势。现在看来这是本研究的一个不足, 有待于以后的研究来完善, 不排除根中木质素的成分比例和结构变化与茎中存在不同的特点。