选取海岛棉材料新海14 (母本, 感病), 06-146 (父本, 抗病)及其杂交后的F_2:6RIL群体中的抗、感株系RIL10893 (超抗)、RIL10895 (高抗)、RIL10897 (感病)和RIL10796 (易感)共6份材料进行转录组测序。选取海岛棉抗病材料06-146、埃棉2号(抗病)、DJ-07-136 (抗病)、5917 (抗病)、新海14、海92-3 (感病)和埃及棉424 (感病)共7份材料进行相关基因表达分析(表1和表2)。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 转录组测序材料 Table 1 Variety list of RNA-seq 品种Variety 枯萎病抗性Wilt resistance 来源Source 新海14 Xinhai 14 感病 Susceptible 中国新疆 Xinjiang, China 06-146 抗病 Disease-resistant 中国新疆 Xinjiang, China RIL10895 高抗 High resistance 新海14 × 06-146杂交后F2:6 RIL群体 Xinhai 14 × 06-146 after hybridization F2: 6 RIL groups RIL10893 超抗 Super resistance 新海14 × 06-146杂交后F2:6 RIL群体 Xinhai 14 × 06-146 after hybridization F2: 6 RIL groups RIL10897 感病 Susceptible 新海14 × 06-146杂交后F2:6 RIL群体 Xinhai 14 × 06-146 after hybridization F2: 6 RIL groups RIL10796 易感 Susceptible disease 新海14 × 06-146杂交后F2:6 RIL群体 Xinhai 14 × 06-146 after hybridization F2: 6 RIL groups

表1 转录组测序材料 Table 1 Variety list of RNA-seq

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 实时荧光定量材料 Table 2 Variety list of q-PCR 品种Variety 枯萎病抗性Wilt resistance 来源Source 新海14 Xinhai 14 感病 Susceptible 中国新疆 Xinjiang, China 海92-3 Hai 92-3 感病 Susceptible 中国内地 China Mainland 埃及棉424 Egyptian cotton 424 感病 Susceptible 埃及 Egypt 06-146 抗病 Disease-resistant 中国新疆 Xinjiang, China 埃棉2号 Egyptian cotton 2 抗病 Disease-resistant 埃及 Egypt 5917 抗病 Disease-resistant 前苏联 The former Soviet Union DJ-07-136 抗病 Disease-resistant 中国新疆 Xinjiang, China

表2 实时荧光定量材料 Table 2 Variety list of q-PCR

选取饱满种子, 经75%乙醇冲洗3次, 双氧水浸泡4~5 h后, 放入ddH₂O里浸泡催芽24 h左右至露白, 将种子放在铺有湿润滤纸的发芽盒中, 28℃避光恒温培养至芽长3 cm左右, 移至霍格兰氏(Hoagland’ s)营养液中, 在25℃, 光暗周期16 h/8 h的条件下培养。待第一片真叶完全展开时, 接种稀释至1× 10⁶个mL^-1的枯萎病菌(生理小种7号)。选取0 h及接菌后40 h的棉株下胚轴, 经液氮速冻处理, -80℃超低温冰箱保存备用。

从0 h及接菌后4、10、18、28和40 h的棉株下胚轴提取RNA进行转录组测序, 得到的Reads用Trinity软件进行无方向组装, 将短的Reads拼装成长的转录本, 用以鉴定转录本的亚型, 对unigene进行RPKM (Reads Per Kilobase per Million mapped reads, 每百万reads中来自某基因每千碱基长度的reads数)处理, 再用DEG进行差异分析(筛选阈值为Q< 0.005且|log₂Fold Change|> 1)。使用DAVID (The Database for Annotation, Visualization and Intergrated Discovery)在线平台(https://dauid.ncifcrf.gov/)对这些基因进行功能聚类分析, 明确海岛棉在抗病过程中涉及的相关代谢通路中主要基因, 以及这些基因在不同品种和不同接菌时期的表达差异。

将得到的差异表达序列, 运用NCBI中的ORF finder和BlastX找到序列的保守区域, 利用Primer 5.0设计qRT-PCR引物(表3)。使用天根生化科技有限公司的试剂盒(RNA plant Plus Reagent), 按照产品说明书提取总RNA。参照Thermo Fisher Scientific科技公司RNA纯化试剂盒(Thermo Scientific Gene JET)的具体步骤对总RNA进行纯化, 利用Titertek-Berthold检测系统有限公司(Titertek-Berthold)的超微量分光光度计(Colibri)检测总RNA浓度和质量, RNA浓度大于80 ng μ L^-1, 且A₂₆₀/A₂₈₀大于1.8, 采用赛默飞世尔(Thermo Fisher Scientific)公司逆转录试剂盒(RevertAid First strand cDNA Synthesis kit)反转录提取后的RNA, 用ddH₂O稀释cDNA样品5倍后, 置-80℃备用。使用全式金生物技术(TransGen Biotech)有限公司qRT-PCR试剂盒(TransStart Green qPCR SuperMix), 通过美国ABI公司Prism 7500 Fast System, 以UBQ7为内参, 检测7个品种(3个感病品种, 4个抗病品种), 6个接菌时期(0、4、10、18、28和40 h)的基因表达量变化。每个反应重复3次。根据Ct值, 利用公式2^{-Δ Δ Ct}计算基因的相对表达量。

2^{-Δ Δ Ct}=2^{-[(Ct目的基因-Ct内参基因)处理组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组]}

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 荧光定量引物 Table 3 Primers for qPCR 基因 Gene 正向引物序列 Forward primer sequence (5° -3° ) 反向引物序列 Reverse primer sequence (5° -3° ) UBQ7 GAAGGCATTCCACCTGACCAAC CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG ANR CAGCAATGACGCAACGAATC AGTGTTTCTTCGTCGGAGTCG C4H CTCCGTACACCGTGAAAACCA TCGAATGGGACAGCGTAATCTA CHI CAATGACTGTGGAGCCGACA CCCAGAGATGATGATTCAGTGG CHS GGTCCATGTGGTGTTGATGATT CGGTTTTGCCTTCTTCTGTTG DFR GTTCCCACCAAGTTCAAAGATG GAAGCAGTCCCTTTTCTCGG LDOX CTCCACTGTTCCCTCCTCGTA AAATAAAACAGGTAAAGGGGAGC FLS GAGGAAGGTGGTGGATAAACTGT TCGCCAATGTGAATAATAAGGG TT7 GCTTGCGAGATCAATGGCTACT CAGCACCAAATGGAATCAACTC

表3 荧光定量引物 Table 3 Primers for qPCR

于2014年和2015年4月中旬将材料种植于新疆阿拉尔市新开岭镇枯萎病重病田中, 2次重复。在每年10月5日左右, 选择连续5株棉株, 采用剖杆的方法考察海岛棉的枯萎病抗性, 参照五级分类法^[18]判断棉花的发病级别并计算病情指数。

病情指数(DI) = ∑ 级数× 每级病株数/(调查总株数× 最高级值)× 100

转录组测序分析DEG数据得出两亲本差异表达基因755个, 抗病亲本上调表达的基因1185个。利用RIL群体中抗病材料RIL 10895和RIL 10893, 感病材料RIL 10897和RIL 10796作进一步分析(表4)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 转录组测序中类黄酮代谢相关基因的表达 Table 4 Expression of related genes in flavonoids by RNA-seq 基因 Gene 品种 Variety 表达趋势 Expression trend 差异倍数 Fold change 基因 Gene 品种 Variety 表达趋势 Expression trend 差异倍数 Fold change CHS 06-146 Up 15.81 LDOX/ANS 06-146 Up 13.30 RIL 10893 Up 23.90 RIL 10893 Up 11.36 RIL 10895 Up 4.88 RIL 10895 Up 2.80 Xinhai 14 Up 2.34 Xinhai 14 Up 2.00 RIL 10796 Up 2.18 RIL 10796 Up 1.53 RIL 10897 Up 2.15 RIL 10897 Up 1.18 CHI-1 06-146 Up 11.54 DFR-1 06-146 Up 8.27 RIL 10893 Up 9.22 RIL 10893 Up 8.35 RIL 10895 Up 2.52 RIL 10895 Up 1.38 Xinhai 14 Up 1.03 Xinhai 14 Up 1.02 RIL 10796 Up 1.83 RIL 10796 Down 0.46 RIL 10897 Up 1.06 RIL 10897 Up 1.18 CHI-2 06-146 Up 12.99 DFR-2 06-146 Up 8.17 RIL 10893 Up 10.97 RIL 10893 Up 9.12 RIL 10895 Up 2.63 RIL 10895 Up 3.23 Xinhai 14 Up 1.45 Xinhai 14 Up 1.68 RIL 10796 Up 2.01 RIL 10796 Up 1.25 RIL 10897 Up 1.84 RIL 10897 Up 1.74 TT7-1 06-146 Up 11.54 ANR 06-146 Up 6.37 RIL 10893 Up 10.61 RIL 10893 Up 4.97 RIL 10895 Up 6.10 RIL 10895 Up 2.04 Xinhai 14 Up 5.90 Xinhai 14 Up 1.28 RIL 10796 Up 4.50 RIL 10796 Down 0.94 RIL 10897 Up 4.04 RIL 10897 Up 1.29 TT7-2 06-146 Up 5.72 RIL 10893 Up 4.50 RIL 10895 Up 2.62 Xinhai 14 Up 1.89 RIL 10796 Down 0.90 RIL 10897 Up 1.72 The same gene has two forms, for example, CHI gene is displayed as CHI-1 and CHI-2, in fact, CHI-1and CHI-2 are similar to the same sequence of TAIR, this phenomenon is caused by different parts of a sequence alignment. But its expression trends are similar. So in the following gene analysis process unified the display for CHS. 在表中出现同一基因的2个表达, 例如: CHI基因为CHI-1和CHI-2, 实际上CHI-1和CHI-2序列均与拟南芥库中的同一个基因相似, 这种现象是由比对到序列部位不同而导致, 但其表达趋势均类似。因此后续基因分析过程中统一用CHI代表。

表4 转录组测序中类黄酮代谢相关基因的表达 Table 4 Expression of related genes in flavonoids by RNA-seq

接菌后, 类黄酮代谢途径中6个关键基因(CHS、CHI、LDOX、DFR、ANR和TT7)在抗病亲本及RIL高抗, 超抗材料中均显著上调表达(表2)。CHS基因在抗病亲本及RIL超抗材料中上调表达的倍数分别为15.81和23.90, 比感病亲本及RIL感病材料高出7倍和11倍。CHI-2在抗病亲本及RIL超抗材料中的表达量高出感病亲本及RIL感病材料6倍之多。DFR, ANR基因在接菌前后表达量差异倍数的高低同棉花的抗性相一致, DFR-1为RIL10893 (8.35) > RIL10895 (1.38) > RIL10897 (1.18) > RIL10796 (1.46), DFR-2为RIL10893 (9.12) > RIL10895 (3.23) > RIL10897 (1.74) > RIL10796 (1.25); ANR: RIL10893 (4.97) > RIL10895 (2.04) > RIL10897 (1.29) > RIL10796 (0.94)。暗示类黄酮代谢途径相关基因可能与海岛棉不同抗性表型的产生关系密切。

为进一步验证类黄酮代谢途径相关基因与海岛棉枯萎病抗性的关系, 选取7个抗性表现不同的资源材料对类黄酮代谢通路中的8个基因进一步研究表明在接菌后18 h、40 h抗病材料的ANR (花青素还原酶)表达量显著高于感病材料, 且在这2个时间点, 感病材料的变异系数大于抗病材料, 说明该基因在感病材料之间的表达量有差异(图1和表5)。除海92-3外, 另外2个感病材料在4、10和28 h、40 h的表达量均上调, 且4 h和10 h上升幅度明显大于28 h和40 h, 在40 h所有材料的表达量均上调, 但是抗病材料的表达量显著高于感病材料。推测该基因的表达量在感病材料中前期上调明显, 在抗病材料中后期上调明显。

图1

Fig. 1

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	图1 类黄酮代谢通路相关基因表达水平Fig. 1 Expression levels of flavonoid metabolism pathway related genes

表5

Table 5

表5(Table 5)

表5 类黄酮代谢通路相关基因表达量在抗感材料之间的差异 Table 5 Expression level of flavonoid metabolism pathway related genes in resistant- and susceptible materials 基因 Gene 接菌后时间 Inoculated time 抗病材料 Resistant material 感病材料 Susceptible material 均值 Mean 极小值Minimum 极大值Maximum 变异系数 CV 均值 Mean 极小值Minimum 极大值Maximum 变异系数CV CHI 10 h 11.16 0.71 5.28 0.68 0.66 0.12 0.37 0.52 18 h 16.60 0.79 7.58 0.71 1.57 0 0.45 1.50 28 h 20.44 1.38 7.31 0.87 0.37 0 0.11 1.44 40 h 36.17 4.13 9.88 0.94 1.22 0 0.32 1.58 DFR 4 h 2.14 1.06 6.06 0.66 0.78 1.69 0.01 0.86 10 h 3.99 1.95 9.21 0.48 0.29 0.15 0.43 0.43 18 h 1.04 0.39 1.47 0.36 0.28 0 0.93 1.44 28 h 2.08 0.01 7.00 1.22 0.13 0 0.41 1.36 40 h 3.27 0.14 7.28 0.77 0.24 0 0.74 1.57 TT7 10 h 2.81 0.33 11.58 1.27 0.24 0.02 0.50 0.74 18 h 7.37 0.29 13.61 0.72 1.13 0 3.39 1.48 40 h 4.23 2.11 6.70 0.38 0.59 0 1.84 1.47 ANR 18 h 1.03 0.20 2.36 0.80 0.30 0.01 0.71 0.82 40 h 4.72 2.50 11.99 0.58 1.25 0.18 2.51 0.71 C4H 40 h 1.80 0.33 3.65 0.58 0.32 0.02 0.87 1.10 CHS 18 h 0.91 0.02 2.82 1.17 0.15 0 0.43 1.22 40 h 6.55 1.43 15.00 0.73 1.45 0.29 4.62 1.20 LDOX 10 h 2.30 0.28 6.19 0.96 0.35 0.12 0.48 0.39 28 h 0.69 0.01 1.82 0.83 0.16 0 0.50 1.46 40 h 2.80 0.90 6.35 0.72 0.31 0 1.19 1.55 FLS 10 h 1.31 0.22 2.57 0.64 0.58 0.10 1.50 1.00 28 h 1.55 0.01 4.33 1.03 0.19 0 0.55 1.40 40 h 3.53 1.31 5.59 0.47 0.33 0 1.07 1.40

表5 类黄酮代谢通路相关基因表达量在抗感材料之间的差异 Table 5 Expression level of flavonoid metabolism pathway related genes in resistant- and susceptible materials

C4H (肉桂酸-4-羟化酶)(图1和表5), 在接菌后40 h, 在抗病材料中的表达量显著高于感病材料, 在感病材料中表达量的变异系数大于抗病材料, 说明在40 h感病材料之间的表达量也存在较大差异。感病材料中除了在4 h有上调表达外, 在其余接菌时间段均无明显上调。抗病材料除DJ-07-136外, 都在40 h拥有最大值。该基因在接菌后40 h抗病材料的瞬时表达量增加明显。

DFR (二氢黄酮醇还原酶)(图1和表5), 在接菌胁迫后, 在抗病材料中的表达量均显著或极显著高于感病材料。除10 h外, 抗病材料在各时期表达量的变异系数均小于感病材料, 说明该基因的表达量在感病材料之间也存在差异。在感病材料中, 该基因的表达量除埃及棉424在4 h有少量上调外, 其余均为下调。而在抗病材料中, 该基因的表达量在4 h均上调表达, 并且在10 h持续上升, 在18 h全部下调, 在28 h除06-146外其余无明显上调。该基因的表达量在抗病材料和感病材料中有显著差异。在抗病材料中除DJ-07-136外, 其余均有上升下降在上升的趋势, 且均在接菌后期(28 h和40 h)达到峰值, 推测该基因可能在海岛棉抗枯萎病中起着重要作用。

TT7 (类黄酮3’ 羟化酶)(图1和表5), 接菌胁迫后18、28和40 h在抗病材料中的表达量显著高于感病材料, 在28 h和40 h的变异系数小于感病材料, 说明在这2个时间点该基因的表达量在感病材料之间也存在较大差异。从图1可知, 除DJ-07-136外该基因的表达量在4~18 h均无明显上调。在28 h, 新海14 (感病)、06-146 (抗病)、DJ-07-136 (抗病)、埃棉2号(抗病)表达量有大幅上升, 但新海14 (感病)的表达量显著低于另外3种抗病材料, 且在这3个抗病材料中, 该基因的表达量在此时有最大值。该基因在感病材料中无明显变化, 在抗病材料中后期明显上调表达。

CHI (查尔酮异构酶)(图1和表5), 接菌胁迫后10、18、28和40 h, 在抗病材料中的表达量显著高于感病材料, 但其变异系数小于感病材料。说明在感病材料之间该基因的表达水平有差异。抗病材料DJ-07-136和5917的表达量在18 h拥有最大值, 抗病材料06-146, 埃棉2号的表达量在40 h拥有最大值。该基因在感病材料中无明显上调表达。推测该基因可能与海岛棉抗枯萎病有关。

CHS (查尔酮合成酶)(图1和表5), 在接菌后18 h和40 h抗病材料的表达量显著高于感病材料, 变异系数小于感病材料, 可能该基因的表达量在感病材料之间也存在差异。除06-146外, 该基因在抗病材料中4 h和10 h的表达量较18 h和28 h更加活跃。除埃棉2号外, 该基因在抗病材料中的表达量均有上升下降再上升的趋势, 且第1个表达峰值出现在10 h, 第2个表达峰值在40 h。

LDOX (花色素合成酶)(图1和表5), 在接菌后10、28和40 h抗病材料的表达量显著高于感病材料, 且在28 h和40 h抗病材料表达量的变异系数小于感病材料, 说明该基因在接菌后28 h和40 h, 感病品种之间的表达水平也有差异。该基因在抗病材料中4 h和10 h的表达量较18 h和28 h更加活跃。在抗病材料中该基因的表达量均有上升下降再上升的趋势, 第1个表达峰值在4 h和10 h, 第2个表达峰值在40 h。推测该基因在抗病材料中的表达趋势可能是一个达到峰值后逐渐降低又回升的过程, 在感病材料中没有这种趋势。

FLS (黄酮醇合成酶)(图1和表5), 在接菌后10、28和40 h抗病材料的表达量显著高于感病材料, 而其变异系数小于感病材料, 说明该基因的表达量在感病材料之间也存在差异。在接菌后该基因的表达量在感病材料中均有下调的趋势。除DJ-07-136外, 抗病材料相对表达量的变化均有上升下降, 再上升的趋势。

这8个基因在4个抗病材料中的表达量较感病材料上调更加明显, 尤其是在40 h。除4 h外, CHI基因在抗病材料中各个时期的表达量均显著高于感病材料。DFR基因在抗病材料中各时期的相对表达量均显著高于感病材料。TT7的基因表达量在感病材料中无明显变化, 在抗病材料中后期明显上调表达。ANR、C4H、DFR和ANS在抗病材料中4 h和10 h的相对表达量高于18 h和28 h。CHS、FLS、LDOX和DFR的表达量在抗病材料中均有上调后下调又回升的趋势, 但在感病材料中并无这种趋势。C4H、CHI和CHS基因在感病材料接菌后4 h的表达量有明显上调, 但是在4 h之后表达量上调不如抗病材料明显。

接菌40 h后, 8个基因在抗、感材料间均有极显著差异(表6)。在除接菌后4 h以外的时期, CHI基因的表达量在抗、感材料间均呈极显著差异。DFR基因的表达量在抗、感材料之间, 除在4 h和28 h有显著差异外, 在其他时期均有极显著差异。在抗、感材料之间, TT7基因的表达量在28 h和40 h有极显著差异。在方差分析中发现抗病材料内部以及感病材料内部基因表达量的变异系数较大, 但是仍然发现抗、感材料之间的基因表达量有显著差异, 说明抗、感材料之间的差异极显著。

表6

Table 6

表6(Table 6)

表6 抗、感材料间基因表达量方差分析 Table 6 Variance analysis of gene expression between resistant and susceptible varieties 基因 Gene 接菌后时间 Times after inoculation 4 h 10 h 18 h 28 h 40 h CHI 2.283 16.527* * 15.362* * 11.335* * 9.414* * DFR 6.991* 32.341* * 19.942* * 5.232* 12.719* * TT7 3.094 4.641* 2.529 11.492* * 37.741* * ANR 3.268 0.773 6.473* 0.421 13.133* * C4H 1.596 4.316 1.921 1.323 16.759* * CHS 0.011 1.910 4.446* 0.882 9.133* * LDOX 2.225 6.885* 0.317 6.990* 13.033* * FLS 1.348 5.079* 3.690 6.276* 30.590* * * and * * indicate significant difference between resistant and susceptible genotypes at P< 0.05 and P< 0.01, respectively. * 和* * 分别表示在P< 0.05和P< 0.01水平抗、感材料间差异显著。

表6 抗、感材料间基因表达量方差分析 Table 6 Variance analysis of gene expression between resistant and susceptible varieties

从表6可看出, 尽管在转录组测序的DEG分析中未检测出C4H和FLS基因, 但是在接菌后40 h时8个基因的表达量在抗、感材料之间均差异极显著, 这说明类黄酮途径中的关键基因与海岛棉枯萎病抗性关系密切。从表6还可看出, 在接菌后多个时间点CHI和DFR基因的表达量在抗、感材料之间均差异显著。

将抗、感共7份材料2014— 2015年的病情指数与类黄酮代谢通路相关基因表达量的相关性分析(表7)表明, 在接菌40 h后, TT7, FLS基因的表达量与病情指数呈极显著负相关, CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。接菌28 h后, CHI与LDOX基因的表达量与病情指数呈显著负相关。接菌10 h后DFR基因表达量与病情指数呈显著负相关。从表7可以看出CHI和DFR基因分别在2个时期都被检测出的基因表达量与病情指数之间显著负相关, 说明这2个基因可能在海岛棉枯萎病抗性中起着重要的作用。

表7

Table 7

表7(Table 7)

表7 海岛棉病情指数与类黄酮代谢途径相关基因表达量的相关系数 Table 7 Correlation coefficient between flavonoid metabolism pathway genes and disease index of Gossypium barbadense L. 接菌后时间 Time after inoculation CHI DFR TT7 FLS C4H LDOX ANR CHS 40 h -0.807* -0.736* -0.938* * -0.917* * -0.802* -0.646 -0.486 -0.443 28 h -0.786* -0.694 -0.592 -0.713 — -0.752* — — 18 h -0.514 -0.685 — — — — -0.701 -0.290 10 h -0.543 -0.768* -0.494 -0.670 — -0.722 — — 4 h — -0.361 — — — — — — * and * * indicate significant difference at P< 0.05 and P< 0.01, respectively. * 和* * 分别表示在P< 0.05和P< 0.01水平差异显著。

表7 海岛棉病情指数与类黄酮代谢途径相关基因表达量的相关系数 Table 7 Correlation coefficient between flavonoid metabolism pathway genes and disease index of Gossypium barbadense L.