高粱(Sorghum bicolor)红缨子品种、烟草(Nicotiana tabacumcv. Xanthin)种子由本实验室保存, MultiScribe Reverse Transcriptase Kit和Power SYBR Green PCR Master Mix均购于ABI公司; Plant RNA Kit购于OMEGA公司; RT-PCR相关引物均由Invitrogen公司合成; 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase, SOD)、脯氨酸(proline, PRO)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和过氧化物酶(peroxidase, POD)检测试剂盒均购于苏科科铭生物技术有限公司。

利用已报道的水稻SKC1蛋白序列, 在GenBank数据库中进行BlastP搜索, 获得高粱同源基因的氨基酸及cDNA序列并已获得GenBank登录号。根据cDNA序列用Premier 5.0设计并合成引物(F: 5° -ATGAAGTCCATCTCCGTCCCTAGGCCCTC GGCT-3° ; R: 5° -TTAGCCTAGCTTCCATGCCTGAC CCCCATGC-3° )。用高保真酶PrimeSRAR HS DNA Polymerase进行基因扩增, 扩增产物送上海英潍捷基生物技术公司测序。通过用BamH I和EcoR I双酶切, T4 DNA连接酶连接, 获得表达载体pSH-SbSKC1 (图1), 该载体含有SbSKC1基因表达元件, CaMV35S启动子驱动NPT1l::GUS融合基因作为筛选标记基因和报告基因。

图1

Fig. 1

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	图1 pSH-SbSKC1植物表达载体构建Fig. 1 Construction of the plant expressing vector pSH-SbSKC1

采用National Center for Biotechnology Information (NCBI)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的在线工具DNAMAN8.0、MegAlign软件和多序列比对程序ClustalX2进行cDNA序列Blast分析。采用Serial cloner-2.0氨基酸翻译工具。借助ClustalX2和MEGA5.0软件构建系统进化树。

采用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的叶盘法将SbSKC1基因遗传转化烟草^[19]。将T₀代转基因烟草和野生型烟草种子分别装入1.5 mL离心管, 用无菌水洗2~3次后, 用75%的无水乙醇消毒30 s, 再用10% H₂O₂消毒30 min, 最后用灭菌水冲洗3~5次, 用吸水纸吸干表面的水分, 将野生型烟草和转基因烟草种子分别播于0、50、100、150、200、250和300 mmol L^-1 NaCl的MS培养基上进行种子萌发抗盐性试验, 设置6个重复, 每个重复50粒烟草种子, 以胚根完全伸出种皮为种子萌发标准, 在室温25℃ 16 h光照/8 h黑暗光周期、光照强度200~300 μ mol m^-2 s^-1条件下生长。将培养一周没有处理的幼苗转移到不同浓度的培养基上再培养一周观察转基因和野生型烟草根的生长。将转基因烟草和野生型烟草种子分别播于含有基质花盆中, 6周后选取长势相似的幼苗用300 mmol L^-1NaCl处理^[20], 处理前和处理后分别采取相同部位的转基因和野生型烟草叶片提RNA作RT-PCR基因表达分析、测定转基因和野生型烟草生理生化指标。

根据SbSKC1基因序列, 设计基因的RT-PCR扩增引物, 以烟草Actin基因作为内参, 定量分析基因的相对表达量。引物设计序列为F: 5° -CTCTT CATGTCCGTCAACTCCAGG-3° ; R: 5° -GGCGGTA GATACATCATGAGCACAT-3° 。分别取转基因和野生型烟草植株相同部位的叶片0.1 g, 总RNA提取试剂盒购自OMEGA Bio-tek Inc., Georgia, USA, 参照ABI公司试剂盒反转录为cDNA。以烟草Actin作为内参基因, 利用SYBR Green实时定量PCR染料法分别对相关基因的表达进行分析。参照ABI公司的仪器使用说明(7500 Real-time PCR System), 按照2^{-Δ Δ CT}法计算和分析基因的表达水平。Real-time PCR体系20 μ L, 含Power SYBR Green PCR Master Mix (2× ) 10 μ L、引物各1.0 μ L、cDNA 4 μ L和ddH₂O 4.0 μ L。扩增条件为95℃ 10 min; 95℃ 15 s; 60℃ 1 min, 40个循环。每个样品取样3次, 每次设置3个重复。

取长势一致的烟草叶片, 用去离子水冲洗后擦干, 105℃杀青15 min。70℃烘箱中烘至恒重。精确称取0.5 g干材料, 置马弗炉500℃灰化至材料呈白色粉末状态后取出。冷却至室温后用硝酸溶解, ddH₂O定容于100 mL容量瓶中, 摇匀, 用火焰光度计6400 (Flame Photometer 6400, 上海仪电科学仪器股份有限公司)测定Na⁺和K⁺的含量^[20], 并计算K⁺/Na⁺比, 每个处理3个重复。

使用酶标仪测定保护性酶活。样品处理前按照组织质量(g):生理盐水或0.05 mol L^-1磷酸钾缓冲溶液(pH 7.8)体积比例(mL)为1:5~10 (称取0.1 g组织, 加入1 mL生理盐水或磷酸钾缓冲溶液), 以液氮研磨成匀浆。8000× g 4℃离心10 min, 取上清液, 置冰上用苏科科铭生物技术有限公司试剂盒说明书按步骤测定氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)活性和脯氨酸(PRO)、丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)含量^[21]。

采用Microsoft Excel 2003和SPSS22.0软件数据分析, 并绘制图表。

比对结果表明, 克隆得到的SbSKC1序列与数据库中的CDS (GI: 242057180)比对完全一致。序列分析表明, SbSKC1基因的ORF (open reading frame)全长1497个核苷酸, 编码498个氨基酸残基。将测序后的SbSKC1 cDNA序列进行BlastX分析显示, 显示其与玉米(Zea mays)的LOC100382359 (NP_ 001162576.1)相似性最高, 为79%, 与芦苇(Phragmites australis)的HKT1.5 (BA066168.1)、小麦(Triticum aestivum)的HKT8 (ABG33945.1)、大麦(Hordeum vulgare)的HKT1.5 (ABK58096.1)相似性均为67% (图2), 进一步证明SbSKC1基因为编码cDNA全长。选取其中最具代表性的11种物种氨基酸序列运用MEGA 5.0进行系统进化树分析显示, 高粱SbSKC1在进化过程中与玉米亲缘性较近(图3)。

图2

Fig. 2

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图2 SbSKC1与其他物种的氨基酸序列同源比对结果 参与同源比对的分别为冰叶花、白桦、玉米、芦苇、小麦、节节麦、水稻、大豆、可可树、毛果杨、大麦; 黑色表示相同残基, 红色表示保守替换, 绿色表示半保守替换。Fig. 2 Homologous analysis of amino acid sequences among different plants Amino acid sequence homology comparison were analysed in Mesembryanthemum crystallinum, Betula platyphylla, Zea mays, Phmites australis, Triticum aestivum, Aegilops tauschii, Oryza sativa, Glycine soja, Theobroma cacao, Populus trichocarpa, Hordeum vulgaresubsp. vulgare, respectively. The same residue is shown in black, conservative alternative is shown in red, and semi conservative alternative is shown in green.

图3

Fig. 3

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图3 推定SbSKC1基因与其他物种氨基酸系统进化树 各节点处数值表示BootStrap值(迭代1000次)。比对物种冰叶花、白桦、玉米、芦苇、小麦、节节麦、水稻、大豆、可可树、毛果杨、大麦。Fig. 3 Phylogenetic tree of putative SbSKC1protein and other species Each node is represented by a bootstrap value (iteration 1000). Amino acid sequence homology comparison were analysed in Mesembryanthemum crystallinum, Betula platyphylla, Zea mays, Phmites australis, Triticum aestivum, Aegilops tauschii, Oryza sativa, Glycine soja, Theobroma cacao, Populus trichocarpa, Hordeum vulgaresubsp.vulgare, respectively.

以烟草叶片为外植体, 通过农杆菌介导转化法共获得抗性植株40株。在植株长至2~3片叶时选取抗性植株和野生植株的叶片进行GUS组织化学染色和PCR鉴定, 获得转基因植株30株, 说明SbSKC1基因整合到植株中。将其移栽到花盆中, 收获种子。不同株系的转基因种子经消毒后分别播于0、100和200 mmol L^-1NaCl的MS培养基上培养15 d, 观察种子发芽和幼苗生长情况, 结果表明在不含NaCl培养基上转基因株系与野生株系并无明显差异, 而随着NaCl的浓度增加转基因株系和野生型发芽率都受到抑制, 在200 mmol L^-1 NaCl的MS培养基上, 转基因烟草株系种子的发芽率都在55%以上, 而野生型烟草种子的发芽率不到20%。说明在含有NaCl的MS培养基上野生型烟草比转基因烟草种子发芽率受到的抑制更为明显(图4和图5)。

图4

Fig. 4

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	图4 不同浓度NaCl处理的烟草种子Fig. 4 Tobacco seeds treated with different concentrations of NaCl

图5

Fig. 5

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	图5 不同浓度NaCL处理下烟草种子的发芽率Fig. 5 Germination rate of tobacco seeds treated with different concentrations of NaCl

在MS培养基上生长15 d的野生型和转基因烟草幼苗, 转接到含有0、100和200 mmol L^-1 NaCl的培养基上生长7 d (图6), 野生型烟草根系生长较转基因株系缓慢, 随着NaCl浓度的增加, 野生型烟草根系生长受到的抑制更加明显, 表明转基因株系较野生型烟草耐受盐胁迫。

图6

Fig. 6

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	图6 不同浓度NaCl胁迫下烟草根的变化Fig. 6 Changes of tobacco roots under different concentrations of NaCl stress

生长8周龄转基因和野生型烟草植株用300 mmol L^-1NaCl胁迫10 d后(图7)野生型烟草叶片开始枯萎, 而转基因株系叶片正常。以上结果表明, 过度表达SbSKC1提高转基因烟草植株抗盐胁迫能力, 同时对种子萌发和根系伸长都有影响。

图 7

Fig. 7

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	图 7 盐胁迫下(用300 mmol L-1 NaCl灌溉10 d)烟草生长状态 A: 盐胁迫前; B: 盐胁迫10 d。Fig. 7 Tobacco growth state under salt stress ( 300 mmol L-1 NaCl irrigation for ten days) A: before stress; B: stress.

如图8所示, SbSKC1基因表达分析表明, 在盐胁迫前野生型烟草和转基因烟草SbSKC1基因的表达无显著性差异, 盐胁迫10 d后, 野生型烟草和转基因烟草SbSKC1基因的表达差异显著, 其中TP3-11株系的SbSKC1表达达到了野生型烟草的5倍。在盐胁迫下, 转基因烟草和野生型烟草Na⁺和K⁺以及K⁺/Na⁺比存在显著差异。在无盐胁迫下, K⁺和Na⁺含量在转基因株系和野生型之间无显著差异(图8-B, C)。然而, 在盐胁迫下转基因植物中Na⁺和K⁺含量及钾钠比例升高(图8-D)。这表明高表达SbSKC1起到调节阳离子含量的作用。

图8

Fig. 8

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	图8 盐胁迫下SbSKC1基因表达及对Na+、K+含量的影响 A: 基因相对表达; B: Na+含量; C: K+含量; D: K+/Na+。Fig. 8 SbSKC1 gene expression and the influence on Na+, K+contents under salt stress A: relative expression level; B: Na+ content; C: K+ content; D: K+/Na+.

转基因烟草与野生型烟草经300 mmol L^-1NaCl胁迫10 d后, MDA和H₂O₂的含量变化明显。从图9可以看出, 在正常条件下, 转基因烟草与野生型MDA、H₂O₂含量差异不显著, 用300 mmol L^-1 NaCl处理后, 转基因烟草株系MDA的平均含量分别比野生型烟草降低了1.99倍; 转基因烟草株系H₂O₂的平均含量比野生型烟草降低了2.20倍。说明在NaCl胁迫下, 转基因烟草膜脂过氧化程度低于野生型烟草, 有利于维持膜的功能。

图9

Fig. 9

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	图9 盐胁迫对转基因烟草中H2O2和MDA含量的影响 A: H2O2含量; B: MDA含量。Fig. 9 Salt stress Influence of salt stress on H2O2 and MDA contents in transgenic tobacco A: H2O2 content; B: MDA content.

正常条件下转基因烟草和野生型烟草中POD、SOD、CAT活性和脯氨酸含量无显著差异, 而在300 mmol L^-1 NaCl胁迫下, 转基因烟草的POD、SOD和CAT活性分别是野生型的2.02、1.96和3.64倍(图10-A, B, D), 脯氨酸含量比野生型提高了62.9% (图10-C)。

图10

Fig. 10

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	图10 盐胁迫对转基因烟草中POD、SOD、CAT活性及脯氨酸含量的影响 A: POD活性; B: SOD活性; C: 脯氨酸含量; D: CAT活性。Fig. 10 Effects of salt stress on activities of POD, SOD, and CAT and proline content in transgenic tobacco A: POD activity; B: SOD activity; C: proline content; D: CAT activity.