利用抗小麦白粉病的德国品种Tabasco与本实验室培育的糯性感病品种糯麦1号, 经杂交和自交获得4129个宁糯麦1号× Tabasco F₂单株, 用于抗性遗传分析; 从436个F_2:3家系^[19]中随机选择115个家系组成分离群体用于新开发分子标记的多态性分析和定位。

利用“ 中国春” 及其缺失系del5DS-1、del5DS-2和del5DS-5进行目标分子标记的染色体臂定位, 其中del5DS-1保留有5DS末端63%长度, 缺失了37%的染色体长度, del5DS-5保留有染色体5DS末端67%长度, 缺失了33%的染色体长度, del5DS-2保留有5DS末端78%长度, 缺失了22%的染色体长度^[21]。

参考高海东等^[19]报道的方法评价白粉病抗性。将小麦种子播在72孔的穴盘, 亲本品种及家系各播种15~20粒, 每穴盘随机种植9粒感病对照苏麦3号。于幼苗一叶期人工接种, 将充分发病的足量苏麦3号叶片悬于待接叶片上方, 轻轻抖落病菌孢子, 菌种为南京地区流行的Bgt18。在人工智能气候室(14 h光照/10 h黑暗, 18~22℃, 相对湿度80%~90%)中培养接种后的麦苗。接种后7 d当感病对照表现出明显病症时调查病情, 按盛宝钦^[22]的0~4级分类方法记录, 即0级为免疫, 植株无病斑, 0; 级为坏死反应, 叶片有枯死斑, 1级为高抗, 病斑直径小于l mm, 菌丝层稀薄可见绿色叶面, 偶见较大病斑, 但仍透绿, 产孢量极少, 2级为中抗, 叶片病斑直径小于l mm, 但菌丝层较厚, 不透绿, 能产生一定量孢子, 3级为中感, 叶片病斑多, 且直径大于l mm, 菌丝层厚, 产孢量大, 但病斑不连片, 4级为高感, 叶片病斑直径大于l mm, 菌丝层厚, 产孢量多, 病斑连片。

1.3.1 基于ddRAD测序获得的序列 根据前期F_2:3家系的分子鉴定结果^[19], 从中随机选取50个纯合抗病家系和50个纯合感病家系, 每家系选取8株, 将其DNA等量混合构建抗池(B_R)和感池(B_S), 由南京集思慧远生物科技有限公司进行ddRAD测序。根据抗感池序列SNP是否产生酶切位点差异, 决定转化成CAPS或dCAPS标记。如果抗、感池间的SNP存在酶切位点的差异, 则直接将该SNP标记转化成CAPS标记, 即在SNP位点两侧设计引物, 并利用相应的限制性内切酶进行酶切; 如果抗、感池间的SNP不存在酶切位点的差异, 则利用软件dCAPS Finder 2.0 (http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)和Primer 5.0将SNP转化成dCAPS标记, 即在引物中引入错配与SNP位点形成新的酶切位点。新开发的多态标记信息见表1。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 基于ddRAD测序和粗山羊草基因组序列新开发的标记信息 Table 1 Information of primers newly developed based on ddRAD-seq and Aegilops tauschii genome sequence 引物 Primer 引物序列 Primer sequences (5′ -3′ ) 限制性内切酶及最适温度 Restriction enzyme and optimum temp. 退火温度 Annealing temp. (° C) 标记类型 Type of markers ddRAD测序 ddRAD-seq MP928 F: GTAGTACGGCAATTTCTT R: TCTACCTTTAGCTCCTCA Acc I, 37° C 44 CAPS MP930 F: TCACAAATCTTGGAGCAG R:CCAAAATACGCATAGCAG Mae II, 65° C 48 CAPS MP931 F: CCATCCTGCTTGTAGTGA R: TCTGCTTTGAGCCATCTA ― 48 STS MP936 F:TGAGATACTCTGTCAGGTGCTT R: TCCGCCACTTGATTTACG Hpy 188 I, 37° C 58 CAPS 粗山羊草基因组序列 Genome sequence of Aegilops tauschii MP1089 F: TGACCCCTCTAGTGCTTGGT R: GCTGTCCGTGACTATCCTCC ― 60 gSSR MP1112 F: ATGCTGCATCGACATGAATC R: TTCCTTTCCTTCAGGAACCA ― 60 gSSR

表1 基于ddRAD测序和粗山羊草基因组序列新开发的标记信息 Table 1 Information of primers newly developed based on ddRAD-seq and Aegilops tauschii genome sequence

1.3.2 基于粗山羊草基因组序列 高海东等^[19]鉴定出Pm48的紧密连锁标记Xmp510。本研究利用Xmp510序列及ddRAD测序获得的多态标记序列, 在线搜索比对粗山羊草标记序列(http://probes.pw.usda.gov/WheatDMarker/ phpblast/blast.php)。先对相应的粗山羊草基因组序列进行SSR筛查, 然后用MACVECTOR V8.0 (Accelrys, UK)设计引物, 并进行亲本及抗感池间多态性筛选。新开发的多态标记信息见表1。

参照Ma等^[23]报道的SDS法, 从小麦嫩叶中提取总DNA, -4℃保存。在SENSOQUEST LABCYCLER PCR仪(德国)上扩增, 反应体系为10 µ L, 包括1× buffer 10 µ L (含MgCl₂ 15 nmol), DNA模板1 ng, 上、下游引物各2 pmol, 2 nmol的dNTPs, 1 U Taq酶。PCR程序为94℃预变性5 min, 然后按94℃变性30 s、50~60℃退火45 s、72℃延伸50 s进行36个循环扩增, 最后72℃延伸7 min。扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳, 银染法显色。

CAPS标记选择特定的限制性内切酶(TaKaRa), 如Alu I、Acc I、Mae II、Hpy 188I和Taq I, 按生产商说明书进行酶切反应, 反应体系8 µ L, 含PCR产物约50 ng, 于37° C或65° C (依酶特性而定)过夜, 用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测酶切产物。

采用MapMaker 3.0b/EXP^[24]和MapDraw V2.1^[25]构建连锁图谱, 选用Kosambi函数^[26]计算遗传距离, 连锁判断LOD阈值设为3.0。

对抗池、感池进行ddRAD测序, 获得81个可能与Pm48关联的SNP序列, 将其中14个关联性强的SNP标记转化为STS或者CAPS标记。其中, Xmp931在抗、感亲本间有多态性, 且与抗、感池表现一致; Xmp928(图1-A)、Xmp930(图1-B)和Xmp936经相应的限制性内切酶酶切后, 在抗、感亲本以及池间表现一致多态性。利用这4个新开发的标记检测115个F_2:3家系, 结果4个标记均被定位于Pm48的遗传图谱上, 其中Xmp928与目标基因共分离, Xmp931、Xmp936和Xmp930位于远着丝粒的一侧, 与目标基因分别相距7.8、9.7和15.7 cM (图2-A)。

图1

Fig. 1

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	图1 Xmp928(A)、Xmp930(B)和Xmp1089(C)在两亲本及抗、感池的扩增带型 M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: 宁糯麦1号; 3: 抗病池; 4: 感病池。Fig. 1 Polymorphism patterns between the parents and the bulks detected with markers Xmp928(A)、Xmp930(B), and Xmp1089(C) M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: Ningnuomai 1; 3: resistant pool; 4: susceptible pool.

图2

Fig. 2

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图2 抗白粉病基因Pm48的遗传图谱(A)和物理图谱(B) A图中左侧数字为遗传距离(cM); B图中右侧括号内数字是着丝粒到染色体断点处长度与染色体短臂总长度的比值, 下方椭圆代表着丝粒。Fig. 2 Genetic (A) and physical (B) maps of the powdery mildew resistance gene Pm48 In linkage map A, numbers on the left indicate genetic distances (cM). In physical map B, numbers in the parentheses indicate the ratio of length from centromere to chromosome breakpoint/total length of the short arm of chromosome and the ellipse at the bottom shows the position of centromere.

利用已定位Pm48连锁标记序列信息, 比对粗山羊草基因组序列, 开发了71个gSSR标记, 其中Xmp1089(图1-C)和Xmp1112 (图3)在抗、感基因型间存在多态性, 并且被整合到Pm48连锁图谱中, 距Pm48分别为3.1 cM和10.8 cM (图2-A)。

图3

Fig. 3

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	图3 Xmp1112在杂交亲本和中国春5DS缺体中的扩增带型 M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: 宁糯麦1号; 3~5: 中国春缺体系del5DS-1、del5DS-2和del5DS-5; 6: 中国春。箭头指示目标带缺失。Fig. 3 Profiles of Xmp1112 amplified in cross parents and Chinese Spring 5DS deletion lines M: 50 bp DNA ladder; 1: Tabasco; 2: Ningnuomai 1; 3-5: Chinese Spring deletion lines del5DS-1, del5DS-2 and del5DS-5; 6: Chinese Spring. The arrow shows vacancy of target band.

利用3个中国春5DS缺失系对Pm48进行染色体臂定位, 结果显示Xmp1112位于小麦5DS 0.63~0.67的染色体区段(图3), 在该染色体区段中已定位标记Xcfd81^[19], 同时连锁图谱显示Pm48位于这2个标记之间(图2-A), 因此认为Pm48位于小麦5DS 0.63~0.67的染色体区段(图2-B)。

利用4129个F₂单株, 通过接种Bgt18鉴定抗病性, 结果有3103个抗病单株和1026个感病单株, 符合单个显性基因的3︰1分离(χ ²=0.04; χ ²_{0.05, 1}=3.84)。这些感病单株移栽后完成整个生育期并收获种子的有671个家系, 对每个家系衍生的15~20个植株进行表型鉴定后, 推测均为纯合感病家系。利用位于Pm48两侧的分子标记对这671个纯合感病家系进行基因型检测, 其中共显性标记Xmp1112和Xcfd81分别筛选到12个和8个重组家系; 标记Xmp928和Xmp510对这19个重组体进行基因型的分析结果表明, Xmp510检测到5个重组体, Xmp928没有检测到重组体, 与目标基因共分离(表2)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 19个纯合感病重组体基因型分析和分类 Table 2 Genotype classification of the 19 homozygous susceptible recombinants 重组体类型 Recombinant type 重组体单株数 No. of recombinant 重组体基因型Genotype of recombinant Xmp1112 Xmp928 Xmp510 Xcfd81 I 11 AB BB BB BB II 1 AB BB A_ AB III 4 BB BB A_ AB IV 3 BB BB BB AB Only one recombination occurred in types I, III, and IV at the marker interval of Xmp1112-Xmp928, Xmp928-Xmp510, and Xmp510- Xcfd81, respectively; whereas twice recombinations occurred in type II at marker intervals of Xmp1112-Xmp928 and Xmp928-Xmp510. A: Tabasco allele; B: Ningnuomai 1 allele; A_: dominant genotype including Tabasco genotype and heterozygous genotype. 重组体I、III、IV只发生1次重组, 分别在Xmp1112-Xmp928、Xmp928-Xmp510、Xmp510-Xcfd81标记区间; 重组体II发生2次重组, 分别在Xmp1112-Xmp928和Xmp928-Xmp510标记区间。A: Tabasco等位位点; B: 宁糯麦1号等位位点; A_: 显性基因型, 包括Tabasco基因型和杂合基因型。

表2 19个纯合感病重组体基因型分析和分类 Table 2 Genotype classification of the 19 homozygous susceptible recombinants