引用本文
王瑞云, 季煦, 陆平, 刘敏轩, 许月, 王纶, 王海岗, 乔治军. 利用荧光SSR分析中国糜子遗传多样性. 作物学报, 2017, 43(4): 530-548
WANG Rui-Yun, JI Xu, LU Ping, LIU Min-Xuan, XU Yue, WANG Lun, WANG Hai-Gang, QIAO Zhi-Jun. Analysis of Genetic Diversity in Common Millet ( Panicum miliaceum) Using Fluorescent SSR in China . ACTA AGRONOMICA SINICA, 2017, 43(4): 530-548  
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利用荧光SSR分析中国糜子遗传多样性
王瑞云1,2,*,**, 季煦1,**, 陆平3, 刘敏轩3, 许月4, 王纶2, 王海岗2, 乔治军2,*
1山西农业大学农学院, 山西太谷 030801
2山西省农业科学院农作物品种资源研究所 / 农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室 / 杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室, 山西太原 030031
3中国农业科学院作物科学研究所, 北京100081
4吉林大学生命科学学院, 吉林长春 130012
* 通讯作者(Corresponding authors): 王瑞云, E-mail: wry925@126.com, Tel: 15234420135; 乔治军, E-mail: nkypzs@126.com, Tel: 0351-7065530
收稿日期:2016-08-12 接受日期:2016-11-02 网络出版日期:2016-11-15
基金:本研究由国家自然科学基金项目(31271791), 山西省回国留学人员科研资助项目(2016-066), 国家自然科学基金青年科学基金(31301386), 国家自然科学基金青年科学基金(31300279), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-07-13.5-A12), 山西省重点研发计划(一般项目)(农业)项目(201603D221003-5)资助
摘要

分析糜子种质资源的遗传多样性, 有助于了解糜子起源与进化, 可为糜子优异种质发掘及资源高效利用提供理论基础。本研究利用15个糜子特异性荧光SSR标记检测来源于中国11个省(区)的132份糜子种质资源, 检测到107个等位变异, 每个位点等位变异数为2~14个, 平均7个; 基因多样性指数为0.0936~0.8676, 平均0.5298; 多态性信息含量为0.0893~0.8538, 平均0.4864。采用遗传距离的聚类将试验材料分为4类, 类群I来自东北春糜子区, 类群II来自黄土高原春、夏糜子区, 类群III来自于北方春糜子区, 类群IV来自北方春糜子区和黄土高原春、夏糜子区。分析模型的遗传结构表明, 中国糜子资源来自4个(东北地区、黄土高原、北方地区和西北地区)基因库, 与基于遗传距离的聚类结果基本一致, 均与材料的地理起源相关。糜子遗传变异丰富, 主要存在于糜子材料间。该结果从分子水平上准确揭示了中国糜子的遗传多样性。

关键词: 糜子; 荧光SSR; 遗传多样性; 聚类分析; 遗传结构
Analysis of Genetic Diversity in Common Millet ( Panicum miliaceum) Using Fluorescent SSR in China
WANG Rui-Yun1,2,*,**, JI Xu1,**, LU Ping3, LIU Min-Xuan3, XU Yue4, WANG Lun2, WANG Hai-Gang2, QIAO Zhi-Jun2,*
1College of Agriculture, Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, China
2 Institute of Crop Germplasm Resources, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau, Ministry of Agriculture / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Genetic Improvement of Minor Crops, Taiyuan 030031, China
3 Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
4School of Life Sciences, Jilin University, Changchun 130012, China
Fund:This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31271791), the Scientific Research Foundation for Returned Scholars in Shanxi province (2016-066), the National Natural Science Foundation of China for Young Scientists (31301386, 31300279), the China Agriculture Research System (CARS-07-13.5-A12), and General Project of the Shanxi Provincial Key Research and Development Program for Agriculture (201603D221003-5).
Abstract

Understanding of the genetic diversity of common millet germplasm resources is a basis of research on its origin and evolution, as well as the effective utilization of elite germplasm. In this study, we analyzed the genetic diversity of 132 common millet accessions collected from 11 provinces of China using 15 millet-specific fluorescent-labelled simple sequence repeat (SSR) markers. A total of 107 alleles were detected with 7 alleles per locus ranging from 2 to 14. The expected heterozygosity ranged from 0.0936 to 0.8676 with the mean value of 0.5298. The polymorphism information content (PIC) ranged from 0.0893 to 0.8538 with the mean value of 0.4864. The 132 accessions were clustered into four groups according to genetic distance between accessions, which showed geographic and eco-regional distributions. Group I is a collection of germplasm from spring-sowing area of Northeast China, group II is composed of partial accessions from the spring and summer-sowing areas of Loess Plateau, group III is composed of partial accessions from the spring-sowing area of Northern China, and the remaining accessions comprises Group IV with geographic overlaps to groups II and III. Model-based genetic structure analysis indicated that the genetic resources of Chinese common millet were from four gene pools in Northeast, Loess Plateau, Northern, and Northwest China. Obviously, this result was very similar to that of clustering analysis, showing the importance of geographical relationship. Rich genetic variations were also found in Chinese common millet resources, mainly from different accessions. The above results provide an overall evaluation of genetic dive rsity of common millet in China at a molecular level.

Keyword: Common millet ( Panicum miliaceum L.); Fluorescent SSR; Genetic diversity; Cluster analysis; Genetic structure

糜子(Panicum miliaceum), 禾本科黍属一年生暖季草本植物, 主要分布于欧亚大陆干旱、半干旱地区, 在俄罗斯、中国、印度、中东和中欧大面积种植[1, 2]。目前俄罗斯、中国、乌克兰等国家种质资源库中至少保存有24 680余份糜子资源[3, 4, 5]。糜子抗旱、耐瘠、耐盐碱, 需水量少, 作为备荒作物及畜禽饲料被广泛栽培[6, 7]; 因其含有中和酸的碱性物质及抗性淀粉, 作为保健食品在治疗乳糜泻、预防糖尿病和心血管病等方面已得到广泛运用[8, 9]。

中国国家资源库有8700余份糜子资源, 黄土高原和内蒙古高原是糜子主产区, 年均栽培面积50~60万公顷。目前, 糜子遗传多样性研究主要集中在表型性状[10, 11, 12, 13, 14, 15]、品质特性[4]、抗逆性[4, 16, 17, 18, 19]、抗病虫性[4, 20]等方面。刘峰等[10]、董孔军等[11]、胡兴雨等[12, 13]和董俊丽等[14]研究了中国8643份糜子生物学特性差异, 发现穗重、生育期等在糜子种质间存在丰富的遗传变异。王瑞云等[15]调查了糜子叶片性状特征(叶脉和气孔密度)的解剖学差异, 发现气孔密度遗传变异丰富。王纶等[4]分析了中国6020份糜子资源的营养品质(蛋白质、脂肪和赖氨酸), 筛选出优异品质种质342份。王纶等[16]和王海岗等[17]评价了山西省520份糜子资源的抗旱性, 筛选出I级高度抗旱种质和抗旱性强的地方品种“ 黄糜子” , 从生理、农艺指标方面揭示了糜子的抗旱机制。王纶等[18]和刘敏轩等[19]鉴定了6534份糜子资源的耐盐性, 筛选出22份耐盐种质和卫大黄糜等3份耐盐性较强的糜子, 从芽苗期指标揭示了糜子的耐盐机制。王纶等[20]对中国6526份糜子资源进行了抗黑穗病鉴定, 筛选出11份高抗种质和574份抗病种质, 部分材料可直接用于黑穗病高发区。

分子标记是评估作物遗传多样性的有效工具, 其中, SSR标记在染色体上分布广泛、再现性好、多态性信息含量高, 在糜子遗传多样性研究中最为实用。Hu等[21]和Rajput等[22, 23]用385个种间SSR标记(来自柳枝稷、小麦、大麦、燕麦和水稻)分析了中国和美国糜子资源的遗传多样性。Hunt等[24]、董俊丽等[14]和Liu等[25]用90个糜子特异性SSR标记研究了中国和欧亚大陆糜子的遗传差异。常规SSR的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测由于不同批次的扩增条件、电泳时间和染色条件不一致, 无法准确识别等位变异, 基因分型结果准确性差。自动荧光SSR (正链引物5'端标记有荧光染料)检测系统能准确读出基因片段大小、定量扩增产物、分析通量大、费用低[26], 已经在玉米、高粱等植物中运用[27, 28], 但在糜子上应用很少[24]。本试验利用15个糜子特异性荧光SSR标记研究糜子主产区的132份试材, 从分子水平上分析糜子资源的遗传多样性和群体结构, 旨在为糜子的种质资源研究、品种遗传改良、优异种质鉴定和基因挖掘提供分子依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料

132份糜子资源(见附表1)来源于11个省(区), 一部分由中国农业科学院作物科学研究所(60份)、山西省农业科学院农作物品种资源研究所(4份)和山西省农业科学院高寒区作物研究所(11份)提供; 另一部分为本实验室近5年收集的当地品种(57份)。根据糜子栽培生态区划[21, 25, 29, 30], 132份糜子资源所属生态区包括东北春糜子区(17份), 黄土高原春、夏糜子区(48份), 北方春糜子区(57份: 包括西北地区31份、山西高寒区21份和蒙古高原5份), 北方夏糜子区(10份)。将材料种植在温室的直径10 cm塑料盆中。

表1 15个SSR标记的遗传参数 Table 1 Genetic parameters of 15 SSR markers used in this study
附表1 试验糜子资源一览表 Supplementary table 1 Accessions of common millet used in this study
1.2 DNA提取

取生长15~20 d的幼苗叶片, 用改良CTAB法[31]提取糜子基因组DNA。从每份样品取3~5株幼苗叶片混合提取(约2 g)。用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量, 终浓度调至30 ng µ L-1。

1.3 SSR引物、PCR扩增和自动荧光检测

参照Cho等[32]的引物序列(见附表2), 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。25 μ L PCR体系含2.5 µ L 10× Taq缓冲液、2 µ L MgCl2(25 mmol L-1)、正向引物(1 mmol L-1) 0.5 µ L [5° 端标记荧光素FAM (蓝色)、ROX (红色)、HEX (绿色)或TAMRA (黄色)(见附图1)]、反向引物(1 mmol L-1) 0.5 µ L、0.5 µ L dNTPs (10 mmol L-1)、0.2 µ L Taq DNA聚合酶(5 U L-1)、1 µ L模板DNA和17.8 µ L ddH2O。反应程序为95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 60℃ 30 s, 72℃ 30 s, 10个循环; 95℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72℃ 30 s, 20个循环; 72℃ 6 min。用15对引物(见附表2)扩增糜子试材, 用ABI3730XL (美国应用生物系统公司) DNA分析仪对PCR产物进行自动荧光检测。

图1 基于遗传距离的糜子种质资源聚类图Fig. 1 Cluster diagram of common millet germplasm based on genetic distance

表2 遗传结构图中各分类群的多样性统计 Table 2 Diversity statistics by Structure clusters

附图1 64号糜子样品15个引物扩增产物荧光标记峰型图Supplementary fig. 1 SSR amplicon graph of common millet No. 64 sample by 15 primers

附表2 PCR引物一览表 Supplementary table 2 Primers used for PCR in this study
1.4 数据分析

用Genemapper 4.0 (美国应用生物系统公司)软件自动生成每个位点的图谱文件, 给出PCR扩增片段长度和峰值(荧光强度值), 以PDF和Microsoft Excel数据导出。在每个位点对所有材料的等位基因依据最大峰值打分。

每个标记检测一个位点, 每一条多态性条带视为一个等位基因。用PowerMarker 3.25[33]计算每对引物的多样性参数, 包括等位基因数(Na)、等位基因频率、基因多样性指数(H)、多态性信息含量指数(PIC)和稀有等位基因数等。用PopGen1.32[34]计算不同样品间的Nei’ s遗传距离。用MEGA 5.0[35]构建Neighbour-Joining聚类图。用Structure 2.2[36]鉴定132份糜子资源的遗传类群。用GenALEx 6.5[37]分析分子变异、评价群组内和群组间的遗传分化。

2 结果与分析
2.1 SSR标记的多态性位点扩增分析

用15个标记在132份糜子材料中扩增出可赋分峰谱(见附图1)。其中12个标记(GB-PaM-004、GB-PaM-013、GB-PaM-014、GB-PaM-025、GB-PaM- 023、GB-PaM-061、GB-PaM-096、GB-PaM-107、GB-PaM-115、GB-PaM-121、GB-PaM-126、GB-PaM- 134)扩增出一组峰谱, 为单位点扩增, 3个标记(GB-PaM-066、GB-PaM-094和GB-PaM-145)扩增出2组峰谱, 为双位点(用a和b表示)扩增, 共扩增出18个位点。其中标记GB-PaM-094b在全部样品中的扩增片段相同, 不具多态性, 因此15个标记共扩增出17个多态性位点(表1)。

2.2 SSR标记的遗传多样性分析

从表1可以看出, 17个位点共有107个等位变异; 每个位点等位变异数为2~14个(平均7个), 其中, GB-PaM-134最高, 其次是GB-PaM-023和GB-PaM-126, GB-PaM-013和GB-PaM-145最低。PIC为0.0893~0.8538, 平均0.4864; GB-PaM-126最高, GB-PaM-066b最低。8个位点的PIC均大于0.5, 为高度多态性位点; 6个位点(GB-PaM-004、GB-PaM- 013、GB-PaM-014、GB-PaM-025、GB-PaM-061和GB-PaM-066a)的PIC为0.25~0.50, 为中度多态性位点; 3个位点(GB-PaM-066b、GB-PaM-145a和GB- PaM-145b)的PIC小于0.25, 为低度多态性位点。基因多样性指数为0.0936~0.8676, 平均0.5298。其中, GB-PaM-126最大, GB-PaM-066b最小。

2.3 基于遗传距离的聚类分析

聚类分析(图1)表明, 132份糜子材料聚为4个群组。群组I共6份材料, 青海(4份)、宁夏(1份)和内蒙(1份), 均属于北方春糜子区。群组II为31份材料, 黑龙江(2份)、吉林(2份), 河北(1份)、山东(3份), 甘肃(9份)、宁夏(7份), 山西(5份), 陕西(2份); 属于黄土高原春、夏糜子区、东北春糜子区、北方春糜子区和北方夏糜子区。群组III包括8份材料, 山西(5份)、陕西(2份), 甘肃(1份); 属于黄土高原春、夏糜子区和北方春糜子区。群组IV包括87份材料, 山西黄土高原生态区(36份)、陕西(1份), 黑龙江(10份)、吉林(1份)、辽宁(2份), 山西高寒区(18份)、内蒙古(4份)、甘肃(5份)、宁夏(3份)、青海(1份), 河北(5份)、山东(1份), 主要来自黄土高原春、夏糜子区、北方春糜子区和东北春糜子区。从图1还可以看出, 来自山西的地方品种有93%聚在群组IV中, 育成品种中有71.4%聚在群组III中。基于多态性SSR位点划分的类群与地理来源关系密切, 说明不同省区的糜子资源具有地域特色。

2.4 中国糜子种质资源群体遗传结构

用Structure 2.2软件评估中国不同省(区)的糜子材料, 发现遗传群体数在K=2和K=4处有明显的峰(图2), 因此在2种模式下分析糜子的遗传结构。K=2时, 划分为2个类群(图3)。类群I为红色部分(80份), 主要来自北方春糜子区和东北春糜子区, 包括山西(14份)和甘肃(13份), 其次是黑龙江(12份)和宁夏(10份); 类群II为绿色部分(52份), 主要来自黄土高原春、夏糜子区, 山西最多(31份)(图4)。从图4可以看出, 红色和绿色群组以长城为界, 分别分布在长城以北(北方春糜子区和东北春糜子区)和长城以南(黄土高原春、夏糜子区)。K=4时, 划分为4个类群(图3)。类群I为红色部分(25份), 主要来自东北春糜子区, 黑龙江最多(12份), 代表东北糜子基因库。类群II为绿色部分(37份), 主要来自黄土高原春、夏糜子区, 山西最多(34份), 代表黄土高原基因库。类群III为蓝色部分(30份), 主要来自北方春糜子区。类群IV为黄色部分(39份), 主要来自北方春糜子区和黄土高原春、夏糜子区, 山西最多(17份), 甘肃(8份)和宁夏(7份)次之(图4)。

图2 运用Structure对糜子基因库数目建模
Delta K根据Evanno等[38]的方法计算得到, 针对基因库数目(K)建模。Fig. 2 Modelling of number of genepools in common millet using structure
Delta K was calculated by the method of Evanno et al.[38] and model was established by the number of genepools (K).

图3 糜子种质资源群体遗传结构图
横坐标的数字代表糜子材料序号。Fig. 3 Population genetic structure graph of accessions
Numbers in the hori· zontal axis represent serial number of the accession.

图4 k=2 和 k=4遗传结构图中糜子种质资源的分布Fig. 4 Assignments of accessions from different provinces to genepools under the k=2 and k=4 model

红色群组(K=2)分化成红色、蓝色和黄色(K=4)。21份山西糜子资源中10份(47.6%)为蓝色, 10份(47.6%)为黄色; 13份甘肃糜子资源中3份(23.1%)为蓝色, 8份(61.5%)为黄色。

绿色群组(K=2)在K=4模式下绝大部分仍为绿色, 小部分为黄色和蓝色, 极少部分为红色。43份山西资源中33份(76.7%)仍为绿色; 7份(16.3%)为黄色; 2份(4.7%)为蓝色; 1份(2.3%)为红色。

K=2和K=4结构图中各群组的遗传多样性衡量指标见表2。K=2时, 红色群组资源的多样性比绿色群组丰富, 说明长城以北(北方春糜子区和东北春糜子区)资源的遗传多样性高于长城以南(黄土高原春、夏糜子区)的资源。K=4时, 各个分类群组的遗传多样性参数值差别较小。

2.5 分子遗传变异(AMOVA)分析

对Structure遗传结构划分类群的方差分析(表3)表明, 遗传结构分类群的遗传变异极显著(P< 0.001)。其中, 65%发生在样品间, 26%发生在地区内样品间, 说明糜子种质资源的遗传变异主要存在于糜子资源间。

表3 遗传结构图中糜子资源的AMOVA分析 Table 3 AMOVA analysis on accessions of genetic structure graph
2.6 遗传距离和遗传结构聚类分析的比较

比较遗传距离聚类和遗传结构(K=4)分析结果表明(表4), 内蒙古、宁夏、青海和山东4个省(区) 2种聚类结果完全一致; 甘肃省除1份材料外, 分为3个群组; 黑龙江省除2份材料外, 分为1个群组; 吉林省除1份材料外, 分为2个群组; 辽宁省除1份材料外, 分为1个群组; 山西省除1份材料外, 分为3个群组; 陕西省除1份材料外, 分为2个群组。可见基于模型的遗传结构聚类与基于遗传距离聚类结果基本一致, 均与糜子资源的地理起源相关。

表4 基于遗传距离和遗传结构(K=4)各分类群组在不同省份的糜子分布 Table 4 Distribution of accessions from different provinces based on genetic distance and Structure (K=4) cluster
3 讨论
3.1 基于SSR标记的多样性分析

分子标记是揭示糜子遗传多样性的有效手段, 已经有不少标记, 如ITS、ISJ、AFLP、ISSR、RAPD、SSR、SNP等[6, 21, 25, 30, 39, 40, 41, 42, 43, 44]用于分析糜子遗传差异。其中, SSR以共显性好、多态性丰富成为糜子最实用的检测标记。2009年, Hu等[21]首先用其他作物的SSR标记研究中国糜子资源的遗传多样性, 由于存在种间差异, 引物通用性低, 开发糜子特异性SSR并筛选出多态性高的核心引物, 对准确评价糜子遗传差异具有重要意义。Cho等[32]首次构建了25个糜子微卫星标记, 随后, 董俊丽等[14]、季煦等[45]和连帅等[46]用其中的部分标记分析了中国糜子的遗传多样性。然而, 由于传统SSR检测所用的聚丙烯酰胺凝胶电泳以分子量Marker作对照, 用肉眼粗略估计扩增片段大小, 难以区分几个碱基对的差异, 检测到的变异数低[14, 25, 45, 46]。2011年, Hunt等[24]首次利用SSR荧光标记分析欧亚大陆糜子资源的遗传多样性, 但仅包括少量中国材料(33份), 不足以准确反映中国糜子的遗传变异情况。本试验15个SSR标记中, 12个与董俊丽等[14]所用相同, 但由于引物标记了荧光, 能检测到聚丙烯酰胺凝胶电泳识别不出的等位变异。本研究检测到每对引物的平均等位基因数为7个, 而前人研究结果均小于6个[14, 24, 25, 32]。本研究每对引物检测到的PIC值为0.4864, 而前人研究结果最高为0.3926 [14, 24, 25, 32]。黄河流域的黄土高原是中国糜子的起源中心[21], 本研究所用材料多数来源于该区域, 故检测到丰富的遗传多样性。

本研究糜子试材来自11个省(区), 以每个地区为一个群体, 借助SSR标记在DNA水平上分析了糜子种质资源的遗传差异。其中, 3对引物(GB-PaM- 066、GB-PaM-094和GB-PaM-145)均扩增出2个变异位点, 且GB-PaM-066的2个变异位点均有多态性, GB-PaM-094仅一个位点具有多态性, 这与Hunt等[24]研究结果一致。本研究发现GB-PaM-145有2个多态性位点, 而Hunt等[24]仅检测到1个(位点b), 这可能与研究材料不同有关, 本研究用的中国资源(132份)是Hunt等[24](33份)的4倍。

王银月等[43]用高通量测序结合PCR扩增筛选出糜子特异性SSR引物116对(双碱基重复102对、三碱基重复14对)。前人用到的引物多为双碱基和三碱基重复, 四碱基重复仅一个(EF117731)[14, 32]。今后研究需要开发五碱基和六碱基重复及复合碱基SSR, 为糜子品质和抗性优异基因挖掘、遗传多样性、群体遗传结构及遗传连锁图谱构建等研究提供更多可靠的分子检测工具。

3.2 糜子种质资源遗传结构分析

132份糜子资源聚类结果中, 山西的地方品种93%聚在群组IV中, 育成品种71.4%聚在群组III中, 说明中国不同省的糜子资源具有地域特色, 这很可能与人们的食物偏好和文化差异有关。分析发现, 山西的地方品种在4个群组中均有呈现, 反映出山西糜子资源类型比较丰富, 这与董俊丽等[14]的研究结果一致。山西的育成品种大多集中在群组III中, 说明当代育成品种遗传基础狭窄, 可能与种质资源的利用不充分有关。建议当代的糜子育种家要加强育种材料的交换, 扩大育成品种的遗传基础, 提高品种的适应性和育种水平。

本研究基于遗传距离的聚类将132份糜子分为4个群组, 与基于模型的遗传结构(K=4)分类结果相符。不同地理来源糜子的遗传多样性分析表明, 山西资源的多项遗传多样性衡量指标(等位基因数、H和PIC)均最高, 说明山西的糜子资源多样性相对较丰富, 这与前人研究结果[14, 47]相符, 可能也与本研究中山西糜子材料数多有关。分析山西64份糜子资源的遗传结构表明大部分资源属于黄土高原春、夏糜子区, 其中, 山西资源在不同类群中均有呈现, 这与以往研究结果相符[14, 25]。

3.3 糜子群体遗传结构类群间的遗传分化

群体间存在显著遗传分化的物种分化系数大于0.15[48], Hunt等[35]研究欧亚大陆糜子资源的遗传多样性发现, K=2和K=6时糜子材料的分化系数分别为0.162和0.324, 均高于本研究结果, 原因在于其材料来源广泛, 地理差异明显。本研究AMOVA分析发现K=2和K=4时糜子材料的分化系数分别为0.088和0.084, 说明中国糜子结构类群间遗传分化不明显, 这与遗传结构类群间的多样性丰富程度类似相符。今后研究需进一步丰富育种材料, 以取得更加可靠的结果。

4 结论

中国糜子资源遗传多样性丰富, 利用模型的遗传结构聚类和基于遗传距离的聚类结果一致, 均可以把材料划分为4个群组。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

参考文献
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