根据克隆用到的启动子引物序列, 分别加上酶切位点EcoR I和Nco I (TaKaRa)作为新的克隆引物, 分别以1.2中测序正确的MnACO1、MnACO2基因启动子转化大肠杆菌DH5α 的菌液为扩增模板, 扩增程序为94℃预变性4 min; 94℃变性45 s, 58℃退火45 s, 72℃延伸60 s, 35个循环; 结束后72℃延伸10 min。分别用EcoR I和Nco I双酶切扩增产物和植物表达载体pCAMBIA1301, 回收启动子片段和表达载体片段, 将这些启动子片段替换pCAMBIA1301载体上启动GUS 基因表达的CaMV35S启动子, 与GUS基因融合构建植物表达载体并双酶切鉴定, 鉴定正确的重组表达载体被命名为pMnACO1::GUS和pMnACO2::GUS。以构建好的表达载体转化农杆菌菌株GV3101, 利用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥^{[22, 23]}, 同时以pCAMBIA1301载体转化拟南芥作为阳性对照。

T₀代种子分别经75%酒精清洗1~2 min, 无菌ddH₂O清洗3次, 0.1% HgCl₂清洗2 min, 无菌ddH₂O清洗3次, 点播于含有20 mg L^-1潮霉素和1%琼脂的1/2MS培养基上, 于室温25℃光照培养, 观察其生长情况。2周后, 将生长正常的拟南芥转移至灭菌土中。分别以转化植物表达载体pCAMBIA1301质粒的拟南芥和野生型拟南芥作阳性和阴性对照, 采用2× CTAB法^[24](略有改动), 提取T₁代植株基因组DNA, 利用1.2中引物和扩增程序, 筛选阳性植株。设计pCAMBIA1301载体中LB序列的2对反向的巢式引物(表1), 用反向PCR^[24]技术检测其插入位点。

将PCR验证正确及确定插入位点的单拷贝T₂代种子按1.4中方法消毒播种, 1周后转移至铺消毒脱脂棉和滤纸的培养皿中, 生长至2周时, 分别用0.3 mol L^-1 NaCl、100 μ mol L^-1ABA、500 μ mol L^-1SA处理拟南芥, 用镊子夹伤叶片模拟机械损伤, 并设置阴性和阳性对照。于处理后的3、12和24 h对整个植株进行GUS染色^[23], 利用体式显微镜观察和照相。参考雷建峰等^[25]的方法测定GUS活性, 取每种处理的GUS染液上清液, 以现配制的GUS染液为对照, 在其最大光吸收波长620 nm处测定其光吸收值, 测定3次, 并用SPSS分析显著性差异。另在拟南芥播种后的1、2、4周和花序轴开始生长期, 以及成熟期进行GUS组织化学染色分析, 观察其不同生长阶段GUS的表达活性。

1.6.1 桑幼苗胁迫处理 以桂优62为试验材料, 播种于铺消毒脱脂棉和滤纸的培养皿中, 2周后的幼苗分别经NaCl、损伤、ABA和SA处理, 于3、12和24 h取样, 以未处理的桑幼苗为对照, 按照北京全式金公司TransZol Plant RNA抽提试剂盒说明书提取总RNA。分别取适量体积RNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 并用紫外分光光度计检测总RNA的浓度。以总RNA为模板, 参照TaKaRa公司反转录酶M-MLV说明书合成cDNA第1链, 存于-20℃备用。

1.6.2 实时荧光定量PCR分析 以MaACO基因全长设计定量PCR引物^[20](表1), 对胁迫后桑幼苗中MaACO1和MaACO2基因进行qRT-PCR分析。定量PCR试剂为SYBR Premix Ex TaqII (TaKaRa), 反应体系为Premix Ex Taq II (2× ) 10 μ L, 10 μ mol L^-1上下游引物各0.8 μ L, 50× ROX Reference Dye (50× ) 0.4 μ L, cDNA 2 μ L和DEPC水6 μ L。参照TaKaRa公司的SYBR Premix Ex Taq试剂盒操作说明书进行Real-time PCR分析, 热启动程序为95℃ 30 s, 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 共40个循环, 对每个样品设3次重复取其平均值, 并以MaACTIN3 (HQ163775.1)^[26]作为内参基因。用2^{-Δ Δ CT}法计算基因的相对表达量, 以SPSS分析显著性差异。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 本研究所用引物 Table 1 Primers sequences used in this study 引物名称 Primer 上游引物序列 Forward primer (5° -3° ) 下游引物序列 Reverse primer (5° -3° ) MnACO启动子片段扩增 MnACO1 GATTCAACCCACAAAGGCTGAATT TTTTCTGTTTGTGAAACTGG MnACO promoters MnACO2 CACTGGT TTGCTGCCGGTTGTA CTCTCTCGCTTTCTTTCTGA MaACO基因qRT-PCR qRT-MnACO1 AAGGTGATGAGGGAATTTGC GGTCCCTTTGAGCCATAGAA MnACO genes for qRT-PCR qRT-MnACO2 TCTTGGACTGGAGAAAGGGT CCCTTGATCAGGTCTGGTTT 巢式PCR Nested-PCR Cycle1 TATGGAGAAACTCGAGCTTGTC GATCCCCCGAATTAATTCGGCG Nested-PCR Cycle2 AGATCCGGTCGGCATCTACTCT AGCGTCAATTTGTTTACACCAC

表1 本研究所用引物 Table 1 Primers sequences used in this study

通过PCR扩增获得MnACO1和MnACO2基因启动子序列, 它们分别为1518 bp和1429 bp (图1)。通过对启动子序列分析(图2和图3), 发现MnACO1和MnACO2启动子区域有较多的功能元件, 预测的转录起始位点分别在起始密码子上游-101 bp处和-106 bp处。在启动子区域含有大量的TATA-box和CAAT-box, 这些都是启动子发挥作用的重要元件。此外, 两者都含有响应外界环境刺激的TC-rich repeats 和响应赤霉素的GARE-motif, 含有响应外界热刺激的元件, MnACO1为MBS, 而MnACO2为HSE。MnACO1含有响应植物激素的AuxRE元件, MnACO2含有响应水杨酸的TCA-element元件。

图1

Fig. 1

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图1 MnACO启动子序列扩增及重组质粒酶切鉴定Fig. 1 Amplification of promoters of MnACOand enzyme digestion of the recombinant plasmid A:MnACO启动子序列; 1:MnACO1启动子序列1518 bp: 2:MnACO2启动子序列1429 bp; M: Trans 5000; B: pMnACO::GUS重组表达载体双酶切; 1: pMnACO1::GUS; 2: pMnACO2::GUS; M: Trans 5000。 A: promoter sequences of MnACO; 1: promoter of MnACO1, 1518 bp; 2: promoter of MnACO2, 1429 bp; M: Trans 5000; B: enzyme digestion of recombinant plasmid pMnACO::GUS; 1: pMnACO1::GUS; 2: pMnACO2::GUS; M: Trans 5000.

图2

Fig. 2

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	图2 MnACO1启动子序列及主要顺式作用元件Fig. 2 Promoter sequence and major cis-acting elements of MnACO1 方框内为TATA-box; 阴影部分为CAAT-box; ↓ 处为转录起始位点; 其余元件均用下画线标出。 The boxes showed TATA-box; the shadows showed CAAT-box; ↓ is transcription start site; other elements were underlined.

图3

Fig. 3

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	图3 MnACO2启动子序列及主要顺式作用元件Fig. 3 Promoter sequence and major cis-acting elements of MnACO1 方框内为TATA-box; 阴影部分为CAAT-box; ↓ 处为转录起始位点; 其余元件均用下画线标出。 The boxes showed TATA-box; the shadows showed CAAT-box; ↓ is transcription start site; other elements were underlined.

将转化的T₀代植株种子消毒后播于含20 mg L^-1潮霉素的1/2MS培养基上, 大部分能正常萌发, 但根系不能正常生长, 一段时间后植株无法继续生长而死亡。经过初步筛选, 获得能正常生长的4株(编号1-1至1-4) pMnACO1::GUS和10株(编号2-1至2-10) pMnACO2::GUS以及2株转pCAMBIA1301载体的转基因拟南芥植株。提取拟南芥基因组并通过PCR检测(图4和图5), 分别进一步确定了2株(编号为1-3, 1-4)和4株(编号为2-4, 2-5, 2-9, 2-10)阳性转基因植株。反向PCR分析发现, 在编号为2-9的拟南芥中检测到2个插入位点, 其余株系中均只有1个插入位点。

图4

Fig. 4

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	图4 pMnACO1::GUS转基因拟南芥PCR检测Fig. 4 PCR amplification of transgenic Arabidopsis plants with pMnACO1::GUS 泳道1~4分别表示编号为1-1至1-4的转基因株系, 泳道5~6表示转pCAMBIA1301的转基因珠系, 泳道7表示野生型拟南芥, M: Trans 5000。 Lanes 1-4: the transgenic plants from number 1-1 to 1-4, Lanes 5-6: the pCAMBIA1301 transgenic plant, Lane 7: the wild typeArabidopsis, M: Trans 5000.

图5

Fig. 5

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	图5 pMnACO2::GUS转基因拟南芥PCR检测Fig. 5 PCR amplification of transgenic Arabidopsis plants with pMnACO2::GUS 泳道1~10分别表示编号为2-1至2-10的转基因株系, 泳道11和泳道12表示转pCAMBIA1301的转基因珠系, 泳道13表示野生型拟南芥, M: Trans 5000。 Lanes 1-10: the transgenic plants from number 2-1 to 2-10, Lanes 11 and 12: the pCAMBIA1301 transgenic plant, Lane 13: the wild type Arabidopsis, M: Trans 5000.

转基因拟南芥不同生长阶段GUS表达部位及表达活性不同。pMnACO1::GUS植株生长发育的各时期均能检测到GUS活性(图6-A), 且较pMnACO2:: GUS植株高。生长1周和2周的pMnACO2::GUS植株, 根尖中GUS活性较叶片高, 生长至4周时, 在根尖和莲座叶片中均没有检测到明显GUS活性, 仅莲座叶丛的中心有少量GUS活性(图6-B)。在pMnACO1::GUS植株的花瓣、花药、花丝以及柱头中有较高GUS活性, 花柱和花序轴中的活性较低; pMnACO2::GUS植株的花瓣、花药、花丝、柱头和茎生叶中, 能检测到GUS活性, 但花柱和花序轴中无GUS活性(图7-A)。pMnACO1::GUS果柄以及果荚中有少量GUS活性, 但pMnACO2::GUS的果荚和果柄中无GUS活性(图8-B)。

图6

Fig. 6

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	图6 pMnACO1::GUS(A)和pMnACO2::GUS(B)转基因植株不同生长阶段GUS活性Fig. 6 GUS activities during the development of pMnACO1::GUS (A) and pMnACO2::GUS (B) transgenic plants a: 幼苗生长1周; b: 幼苗生长2周; c: 幼苗生长4周; d: 幼苗花序轴开始生长。a, b的比例尺为1 mm; c, d的比例尺为1 cm。 a: one-week-old seedling; b: two-week-old seedling; c: four-week-old seedling; d: inflorescence start growing. Bars = 1 mm in a and b, Bars = 1 cm in c and d.

图7

Fig. 7

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	图7 pMnACO1::GUS (A)和pMnACO2::GUS (B)转基因植株成熟期GUS活性Fig. 7 GUS activities in the adult plant of pMnACO1::GUS (A) and pMnACO2::GUS (B) a: 成熟期拟南芥整株中GUS活性检测; b, c: 花GUS活性检测; d: 果荚GUS活性检测; a比例尺为1 cm; b~d比例尺为1 mm。a: GUS activities in the whole adult plant; b, c: GUS activities in the inflorescence and flowers; d: GUS activities in the siliques; bars = 1 cm in a, bars = 1 mm in b-d.

对单拷贝的T₃代转基因拟南芥进行不同胁迫处理, 组织化学染色后发现, 阴性和阳性对照植株在处理前后均没有颜色改变, MnACO1和MnACO2启动子对不同胁迫呈现不同的响应模式, 且MnACO1启动子在经胁迫处理后GUS活性变化更明显(图8)。pMnACO1::GUS植株在经过300 mol L^-1的NaCl处理后, 染色较其他处理深, 且随处理时间的延长而加深, 而对ABA的响应与NaCl相反, 在处理3 h后染色最深, 且随处理时间延长而变浅。经过损伤处理和SA处理3 h后的拟南芥染色比对照深, 随后颜色变化不明显。结合对每种处理GUS染色上清液光吸收值的测定发现, 总体而言, 转pMnACO1::GUS拟南芥植株中的GUS活性随处理时间延长而减弱, 而转pMnACO2::GUS拟南芥植株中的GUS活性随处理时间延长而增加(图10)。经NaCl处理后, 吸光值显著上升, 24 h最高。经ABA处理3 h后, 吸光值达到最高, 随后吸光值下降并保持平稳。植株经损伤处理和SA处理后, 吸光值的变化与GUS染色情况有差异, 经损伤处理12 h后, 吸光值显著上升, 随后下降。SA处理植株的前12 h, 吸光值无显著性差异, 处理后24 h, 吸光值显著上升。

图8

Fig. 8

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	图8 不同胁迫处理对pMnACO1::GUS植株GUS活性的影响Fig. 8 Effect of various stresses on the GUS activities of pMnACO1::GUS 比例尺为2 mm。Bars = 2 mm.

图9

Fig. 9

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	图9 不同胁迫处理对pMnACO2::GUS植株GUS活性的影响Fig. 9 Effect of various stresses on the GUS activities of pMnACO2::GUS 比例尺为2 mm。Bars = 2 mm.

图10

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	图10 pMnACO::GUS植株胁迫处理后GUS染液光吸收值 Fig. 10 Light absorption value at 620 nm of staining solution after stress treatment of pMnACO::GUS * 为差异性显著(P< 0.05)。* indicates significant difference (P < 0.05).

MnACO2启动子经处理后其活性提高, 在根和叶片都有不同程度的表达(图9)。pMnACO2::GUS植株叶片经损伤12 h染色明显, 经NaCl、ABA和SA处理24 h, 叶片出现蓝色。GUS染色上清液光吸收值随NaCl处理时间的延长不断上升, 损伤处理后, 吸光值随时间先升高再降低, 12 h吸光值最高, 而经过ABA处理后吸光值在3 h急剧上升, 随后缓慢上升, 经SA处理3 h和12 h时的吸光值下降, 在24 h骤然升高。

为探究MnACO基因启动子与该基因表达之间的关系, 采用qRT-PCR检测2周苗龄的桑幼苗在经过胁迫处理后MaACO1和MaACO2的基因表达量。MaACO基因的表达模式与启动子GUS染液吸收值变化趋势一致(图10和图11), NaCl处理上调了MaACO1基因的表达, 3 h基因的表达量显著上调, 然后继续上调; 损伤处理上调MaACO1基因的表达, 12 h时表达量最高, 但是变化幅度较小; ABA处理3 h, MaACO1表达量迅速上调, 随后表达量下降; SA处理后, MaACO1表达量在24 h显著上升。MaACO2基因的表达也被NaCl上调; MaACO2基因表达量经ABA处理3 h显著上升, 随后上升趋势缓慢; SA处理桑幼苗3 h和12 h, MaACO2基因表达量都下降, 但在处理24 h升高。

图11

Fig. 11

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	图11 桑幼苗胁迫处理后MaACO基因的相对表达量Fig. 11 Effect of various stresses on the MaACOexpression levels in mulberry seedlings * 为差异性显著(P< 0.05)。* indicates significant difference (P < 0.05).