陆地棉高秆突变体的激素变化与 Tp基因的染色体定位
陈旭升, 狄佳春, 周向阳, 赵亮
江苏省农业科学院经济作物研究所 / 农业部长江下游棉花与油菜重点实验室, 江苏南京 210014

第一作者联系方式: E-mail:njcxs@126.com, Tel: 025-84390371, 13951951371

摘要

以高秆突变体高秆1号为试验材料, 常规品种N099为对照, 利用酶联免疫法测定突变体种子浸泡24 h后种胚中激素含量。结果表明, 高秆1号的3种激素GA3、ZR、IAA的含量均高于对照, 其中GA3的含量显著高于对照。杂交F1表现为: GA3含量显著高于两亲本, 但ZR、IAA含量比正常株高亲本还要低。这暗示高秆1号是一种GA3富集型突变体; 而与ZR、IAA关联不大。采用陆陆杂交群体对高秆基因进行染色体定位, 有4个SSR分子标记与 Tp基因连锁, 分别是NAU2083、NAU4045、NAU2419和NAU4044, 位于 Tp基因两侧的分子标记为NAU4045和NAU2419, 其遗传距离分别为7.4 cM和41.2 cM。由此, 将陆地棉的一个高秆突变体基因 Tp定位在棉花Chr.1上。

关键词: 陆地棉; 高秆突变体; 激素; Tp基因; 染色体定位
Hormone Expression and Tp Gene Chromosomal Localization of Tall Plant Mutant from Upland Cotton
CHEN Xu-Sheng, DI Jia-Chun, ZHOU Xiang-Yang, ZHAO Liang
Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rape in the Lower Reaches of the Yangtze River, Ministry of Agriculture, Nanjing 210014, China
Abstract

Taking a tall plant mutant Gaogan 1 as test material, and a common variety N099 as control, three hormones from soaked seed embryos were determined with enzyme linked immunosorbent assay. The contests of GA3, ZR, and IAA in the mutant were respectively higher than those in the normal plant, especially the GA3content was significantly higher. GA3contents in F1 individuals were significantly higher than those in two parents, but ZR and IAA contests were even lower than those in normal plant parents, which showed that the mutant is a GA3 enrichment-type mutant. F2plants from a cross of Gaogan 1 × N099 were used to map the mutant gene Tp, showing four molecular markers including NAU2083, NAU4045, NAU2419, and NAU4044 linked with Tp gene. The Tp gene flanked with molecular markers NAU4045 and NAU2419, with the genetic distance of 7.4 cM and 41.2 cM, respectively. Thus, Tpgene is located in cotton Chr. 1.

Keyword: Upland cotton; Tall plant mutant; Hormone; Tp gene; Chromosomal localization

株高是农作物最重要的农艺性状之一, 株高与产量、经济系数、光合特性、植株的抗倒伏性等均存在密切关联[1, 2]。棉花的株高与产量性状、纤维品质、抗倒性等也存在相关[3, 4, 5]。关于植物的高秆突变体, 在禾本科作物中有较多报道[6, 7, 8, 9]。水稻的高秆突变作为质量性状, 在遗传上有的受隐性单基因控制、有的受显性单基因控制[10, 11, 12, 13]。在陆地棉中高秆突变体的报道很少, 陈旭升等[14]报道了陆地棉中一个自主发现的高秆突变体, 遗传学研究显示该性状是受一对显性基因控制的质量性状, 基因符号定为Tp。后经大田系选自交, 获得性状表达稳定的陆地棉高秆突变系高秆1号, 其第一果枝节位明显高于常规棉株, 且株型为筒型, 这些性状在机采棉育种中具有良好的应用潜力[15]。本文分析高秆突变体及其杂交F1的激素表达特征, 并利用SSR分子标记对突变体基因Tp进行染色体定位, 旨在为该性状在未来育种中的应用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 激素含量测定

取高秆1号与正常株高品系N099、杂交F1的饱满种子各30粒, 在25℃的恒温发芽箱中以清水浸泡24 h。而后挤出种胚, 用电子天平各称取0.1 g种胚。采用激素试剂盒, 按说明书以酶联免疫法(ELISA)测定3个材料种胚中赤霉素(GA3)、生长素(IAA)及玉米素(ZR)的含量, 3次重复。试剂盒购自南京钟鼎生物技术有限公司。采用多重比较进行显著性差异分析。

1.2 分离群体性状调查

在江苏省农业科学院的南京试验地, 取高秆1号、正常株高亲本N099及其杂交F1、F2群体的种子, 苗床播种后移栽营养钵育苗。在花蕾期调查各群体的株高, 植株打顶后再复核一次。获得的数据按χ 2进行适合性测验。另外, 在吐絮期调查2个亲本株高, 每个材料各测量20棵, 计算平均值与标准差。

1.3 多态性标记筛选与目的基因定位

在花蕾期从大田按单株取小真叶样品磨样, 采用Paterson’ s等[16]的方法提取DNA。选取F2群体的高秆株、正常株各10个单株, 取等量DNA混合, 构建近等基因混池。利用本实验室前期已获得的分布于棉花26对染色体上的234对SSR核心引物[17], 筛选F2近等基因混池的多态性差异标记, 再检测F2群体中各单株的基因型。

SSR分子标记的PCR扩增反应在PTC-200 (MJ research)上进行。PCR程序为94℃预变性2 min; 94℃变性40 s; 56℃退火45 s; 72℃延伸1 min, 30个循环; 最后72℃延伸7 min。扩增产物经8.0%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳: 电泳缓冲液为1× TBE, 200 V恒压电泳后, 参照张军等[18]方法染色。

统计多态性条带: 与正常株高亲本带型相同的单株基因型记为1, 与高秆亲本带型相同的记为2, 共显性杂合带型记为3, 缺失记为0。采用JoinMap 4.0软件进行分子标记的连锁分析和位点排序, 确定Tp基因在染色体上的位置。

2 结果与分析
2.1 陆地棉高秆突变系的表型特征

高秆1号株高平均130 cm, 是常规陆地棉品种株高的1.5倍以上。2016年由于气候原因, 棉花前期生长整体迟缓, 株高整体偏矮。吐絮期在大田调查高秆1号与亲本N099的株高分别为(119.5± 10.5) cm与(72.0± 10.4) cm, 高秆1号的平均株高为常规品系的1.66倍。

图1是大田中F2分离群体的典型高秆株(B)与正常株(A)。从形态看, 高秆株高为正常株高的2倍多, 且木枝较少。与正常株高亲本相比, 高秆亲本的第一节位高、株型呈筒型。这2个表型性状有利于棉花机械收割。

图1 F2分离群体的典型高秆株(B)与正常株(A)Fig. 1 Typical tall plant (A) and normal plant (B) from F2 segregation population

2.2 高秆1号的激素表达特征

表1可见, 突变体高秆1号胚中GA3、ZR和IAA的含量均高于对照, 特别是GA3的含量显著高于对照; 但ZR、IAA含量的差异未达显著水平。其次, 高秆1号与N099杂交F1种子的激素含量平均值以GA3显著高于两亲本, 而ZR、IAA低于两亲本。表明高秆1号是一种GA3富集突变体, 而与ZR、IAA的关联不大。

表1 高秆1号及杂交F1种胚中内源激素含量 Table 1 Endogenous hormone content in embryos of tall parent and its hybrid F1 (ng g-1)
2.3 突变体基因Tp的染色体定位

高秆突变体是一个典型的显性质量性状: 其杂交F1呈显性, F2分离拟合高秆∶ 正常株高=3∶ 1 (表2)。因此, 可以采用SSR分子标记进行单位点质量基因的染色体定位。

表2 高秆突变体与常规株高品种杂交后代的性状表现 Table 2 Plant height traits in hybrid offspring of a tall plant mutant crossing with normal plant variety

利用F2分离群体的高秆与正常株高的DNA混池检测234对核心引物, 发现其中3对具有多态性, 即NAU2083 (位于Chr.1)、NAU1042 (位于Chr.5)、NAU3368 (位于Chr.20)。而后依次检测F2分离群体各单株的基因型, 发现其中位于棉花第1染色体上的分子标记NAU2083与突变体基因Tp连锁, 初始连锁遗传距离7.2 cM。进一步合成Chr.1上距离分子标记NAU2083上下50 cM范围内的22对SSR分子标记。亲本多态性鉴定显示有5个分子标记具有多态性, 多态率为22.7%。通过检测F2群体中各个体的基因型, 再利用JionMap 4.0进行连锁分析, 最后有4个分子标记与Tp基因连锁, 分别是NAU2083、NAU4045、NAU2419和NAU4044。位于Tp基因两侧的分子标记为NAU4045和NAU2419, 其遗传距离分别为7.4 cM、41.2 cM (图2)。由此, 将陆地棉的高秆基因Tp定位在棉花Chr.1上。

图2 高秆基因Tp在Chr.1的连锁图谱Fig. 2 Linkage map of tall plant geneTp in Chr.1

3 讨论
3.1 突变体与激素的关联

目前棉花Chr.1上已定位的质量性状基因很少, 只有芽黄(v5)、细长裂叶(L1L)、栅栏结构异常(lp1)等少数几个[19]。在陆地棉中, 陈旭升等[14]曾报道一个具有典型质量性状遗传特征的高秆突变体基因Tp, 高秆性状在F1代呈显性表达。本研究以种胚为取样材料, 分析了高秆突变体与正常株高亲本及其杂交F1的激素的含量。已知棉种胚包括胚芽、胚轴、胚根[20]。尽管种胚在整个种仁中的占比很少, 约占整个种仁5%左右; 但却是形成棉花成株的潜在“ 胚胎” 。与叶片等组织相比, 在不同品种间利用种胚组织相互比较, 其取样误差相对更少。以种胚替代棉花叶片组织测定Bt毒蛋白含量, 这种方法已在授权专利技术中使用[21]。本文利用种胚测定激素GA3、ZR、IAA的含量, 结果高秆突变系均高于正常株高对照, 特别是GA3的含量显著高于对照; 但ZR、IAA的差异未达显著水平。杂交F1的激素含量测定结果显示, GA3表达量显著高于两亲本, 但ZR、IAA不但低于高秆亲本, 甚至还低于正常株高亲本。说明高秆突变体应该是激素GA3富集突变体; 其F1的高秆表型呈显性, 也主要与GA3的高表达相关联。

3.2 高秆突变体的潜在育种利用价值

随着分子技术的发展和遗传连锁图谱的构建, 对棉花株高QTL研究已取得长足的进展。Shappley等[22]利用陆地棉种内杂交F2群体定位到2个株高QTL, 分别位于第6和第23连锁群。于霁雯[23]利用中棉所36和海7124构建的F2:3家系群体, 检测到2个株高QTL, 分别位于棉花Chr.2和Chr.11上, 各解释表型变异的 9.18%和9.48%。何蕊等[24]以早熟品种中棉所36和海岛棉海1为亲本, 两者株高差异显著, 并在多环境进行株高QTL的检测, 其中有3个QTL在2个环境中被检测到(位于棉花Chr.1、Chr.3、Chr.17), 3个QTL在3个环境中被检测到(位于棉花Chr.14、Chr.20、Chr.25), 1个QTL在4个环境下被检测到(位于棉花Chr.14), 其株高增效基因全部来自海岛棉。

由于海岛棉本身表现高秆, 因此无法配制海陆杂交F2分离群体作为定位群体。本研究采用了陆陆杂交F2群体进行定位, 利用SSR分子标记, 将控制棉株高秆的质量突变基因Tp定位到棉花第1染色体上, 为棉花第1染色体增加了新的质量性状基因成员。随着陆地棉全基因测序工作的完成与结果的公布[25, 26], 对具有明确质量效应的突变基因进行染色体定位, 其现实意义是不言而喻的。它将为理解棉花Chr.1基因组序列的含义提供新的路标, 并且也为该突变体基因的图位克隆奠定良好基础。

机械化收花是中国棉花产业未来发展的主流方向。机采棉对棉花品种的株型有较高要求: 最好是筒形、第一果枝节位较高, 棉朵离地高度最好大于30 cm, 这样可提高籽棉的采净率。高秆突变体高秆1号具有第一果枝节位高、株型为筒型两个有利机采的性状特征, 因此本研究也为机采棉育种资源的挖掘与潜在利用提供了支撑。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。

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