取高秆1号与正常株高品系N099、杂交F₁的饱满种子各30粒, 在25℃的恒温发芽箱中以清水浸泡24 h。而后挤出种胚, 用电子天平各称取0.1 g种胚。采用激素试剂盒, 按说明书以酶联免疫法(ELISA)测定3个材料种胚中赤霉素(GA₃)、生长素(IAA)及玉米素(ZR)的含量, 3次重复。试剂盒购自南京钟鼎生物技术有限公司。采用多重比较进行显著性差异分析。

在江苏省农业科学院的南京试验地, 取高秆1号、正常株高亲本N099及其杂交F₁、F₂群体的种子, 苗床播种后移栽营养钵育苗。在花蕾期调查各群体的株高, 植株打顶后再复核一次。获得的数据按χ ²进行适合性测验。另外, 在吐絮期调查2个亲本株高, 每个材料各测量20棵, 计算平均值与标准差。

在花蕾期从大田按单株取小真叶样品磨样, 采用Paterson’ s等^[16]的方法提取DNA。选取F₂群体的高秆株、正常株各10个单株, 取等量DNA混合, 构建近等基因混池。利用本实验室前期已获得的分布于棉花26对染色体上的234对SSR核心引物^[17], 筛选F₂近等基因混池的多态性差异标记, 再检测F₂群体中各单株的基因型。

SSR分子标记的PCR扩增反应在PTC-200 (MJ research)上进行。PCR程序为94℃预变性2 min; 94℃变性40 s; 56℃退火45 s; 72℃延伸1 min, 30个循环; 最后72℃延伸7 min。扩增产物经8.0%聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳: 电泳缓冲液为1× TBE, 200 V恒压电泳后, 参照张军等^[18]方法染色。

统计多态性条带: 与正常株高亲本带型相同的单株基因型记为1, 与高秆亲本带型相同的记为2, 共显性杂合带型记为3, 缺失记为0。采用JoinMap 4.0软件进行分子标记的连锁分析和位点排序, 确定Tp基因在染色体上的位置。

高秆1号株高平均130 cm, 是常规陆地棉品种株高的1.5倍以上。2016年由于气候原因, 棉花前期生长整体迟缓, 株高整体偏矮。吐絮期在大田调查高秆1号与亲本N099的株高分别为(119.5± 10.5) cm与(72.0± 10.4) cm, 高秆1号的平均株高为常规品系的1.66倍。

图1是大田中F₂分离群体的典型高秆株(B)与正常株(A)。从形态看, 高秆株高为正常株高的2倍多, 且木枝较少。与正常株高亲本相比, 高秆亲本的第一节位高、株型呈筒型。这2个表型性状有利于棉花机械收割。

图1

Fig. 1

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	图1 F2分离群体的典型高秆株(B)与正常株(A)Fig. 1 Typical tall plant (A) and normal plant (B) from F2 segregation population

由表1可见, 突变体高秆1号胚中GA₃、ZR和IAA的含量均高于对照, 特别是GA₃的含量显著高于对照; 但ZR、IAA含量的差异未达显著水平。其次, 高秆1号与N099杂交F₁种子的激素含量平均值以GA₃显著高于两亲本, 而ZR、IAA低于两亲本。表明高秆1号是一种GA₃富集突变体, 而与ZR、IAA的关联不大。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 高秆1号及杂交F1种胚中内源激素含量 Table 1 Endogenous hormone content in embryos of tall parent and its hybrid F1 (ng g-1) 试验材料Material GA3 ZR IAA 高秆1号 Gaogan 1 13.3 b 23.5 a 153.8 a [高秆1号× N099]F1 [Gaogan 1× N099]F1 27.1 a 12.2 b 134.7 b N099 (正常株高) Normal height 7.0 c 17.8 a 145.4 ab Values followed by different letters are significantly different at P < 0.05. 同列数据后不同小字母表示该数据间差异达显著水平(P< 0.05)。

表1 高秆1号及杂交F1种胚中内源激素含量 Table 1 Endogenous hormone content in embryos of tall parent and its hybrid F1 (ng g-1)

高秆突变体是一个典型的显性质量性状: 其杂交F₁呈显性, F₂分离拟合高秆∶ 正常株高=3∶ 1 (表2)。因此, 可以采用SSR分子标记进行单位点质量基因的染色体定位。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 高秆突变体与常规株高品种杂交后代的性状表现 Table 2 Plant height traits in hybrid offspring of a tall plant mutant crossing with normal plant variety 世代 Generation 亲本及组合 Parent and cross 高秆株 Tall plant 常规株 Normal plant 理论比例χ 2值 χ 2value of expected ratio BC2→ 1:1/F2→ 3:1 概率 Probability P1 高秆1号 Gaogan 1 45 0 全部高秆 Whole tall plant — P2 N099 (正常株高) Normal plant 0 46 正常株高 Normal plant — F1 高秆1号× N099 Gaogan 1× N099 38 0 全部高秆 Whole tall plant — F2 [高秆1号× N099]自交 Gaogan 1× N099 selfcross 99 45 3.00 0.05-0.10

表2 高秆突变体与常规株高品种杂交后代的性状表现 Table 2 Plant height traits in hybrid offspring of a tall plant mutant crossing with normal plant variety

利用F₂分离群体的高秆与正常株高的DNA混池检测234对核心引物, 发现其中3对具有多态性, 即NAU2083 (位于Chr.1)、NAU1042 (位于Chr.5)、NAU3368 (位于Chr.20)。而后依次检测F₂分离群体各单株的基因型, 发现其中位于棉花第1染色体上的分子标记NAU2083与突变体基因Tp连锁, 初始连锁遗传距离7.2 cM。进一步合成Chr.1上距离分子标记NAU2083上下50 cM范围内的22对SSR分子标记。亲本多态性鉴定显示有5个分子标记具有多态性, 多态率为22.7%。通过检测F₂群体中各个体的基因型, 再利用JionMap 4.0进行连锁分析, 最后有4个分子标记与Tp基因连锁, 分别是NAU2083、NAU4045、NAU2419和NAU4044。位于Tp基因两侧的分子标记为NAU4045和NAU2419, 其遗传距离分别为7.4 cM、41.2 cM (图2)。由此, 将陆地棉的高秆基因Tp定位在棉花Chr.1上。

图2

Fig. 2

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	图2 高秆基因Tp在Chr.1的连锁图谱Fig. 2 Linkage map of tall plant geneTp in Chr.1

目前棉花Chr.1上已定位的质量性状基因很少, 只有芽黄(v₅)、细长裂叶(L₁^L)、栅栏结构异常(lp₁)等少数几个^[19]。在陆地棉中, 陈旭升等^[14]曾报道一个具有典型质量性状遗传特征的高秆突变体基因Tp, 高秆性状在F₁代呈显性表达。本研究以种胚为取样材料, 分析了高秆突变体与正常株高亲本及其杂交F₁的激素的含量。已知棉种胚包括胚芽、胚轴、胚根^[20]。尽管种胚在整个种仁中的占比很少, 约占整个种仁5%左右; 但却是形成棉花成株的潜在“ 胚胎” 。与叶片等组织相比, 在不同品种间利用种胚组织相互比较, 其取样误差相对更少。以种胚替代棉花叶片组织测定Bt毒蛋白含量, 这种方法已在授权专利技术中使用^[21]。本文利用种胚测定激素GA₃、ZR、IAA的含量, 结果高秆突变系均高于正常株高对照, 特别是GA₃的含量显著高于对照; 但ZR、IAA的差异未达显著水平。杂交F₁的激素含量测定结果显示, GA₃表达量显著高于两亲本, 但ZR、IAA不但低于高秆亲本, 甚至还低于正常株高亲本。说明高秆突变体应该是激素GA₃富集突变体; 其F₁的高秆表型呈显性, 也主要与GA₃的高表达相关联。

随着分子技术的发展和遗传连锁图谱的构建, 对棉花株高QTL研究已取得长足的进展。Shappley等^[22]利用陆地棉种内杂交F₂群体定位到2个株高QTL, 分别位于第6和第23连锁群。于霁雯^[23]利用中棉所36和海7124构建的F_2:3家系群体, 检测到2个株高QTL, 分别位于棉花Chr.2和Chr.11上, 各解释表型变异的 9.18%和9.48%。何蕊等^[24]以早熟品种中棉所36和海岛棉海1为亲本, 两者株高差异显著, 并在多环境进行株高QTL的检测, 其中有3个QTL在2个环境中被检测到(位于棉花Chr.1、Chr.3、Chr.17), 3个QTL在3个环境中被检测到(位于棉花Chr.14、Chr.20、Chr.25), 1个QTL在4个环境下被检测到(位于棉花Chr.14), 其株高增效基因全部来自海岛棉。

由于海岛棉本身表现高秆, 因此无法配制海陆杂交F₂分离群体作为定位群体。本研究采用了陆陆杂交F₂群体进行定位, 利用SSR分子标记, 将控制棉株高秆的质量突变基因Tp定位到棉花第1染色体上, 为棉花第1染色体增加了新的质量性状基因成员。随着陆地棉全基因测序工作的完成与结果的公布^{[25, 26]}, 对具有明确质量效应的突变基因进行染色体定位, 其现实意义是不言而喻的。它将为理解棉花Chr.1基因组序列的含义提供新的路标, 并且也为该突变体基因的图位克隆奠定良好基础。

机械化收花是中国棉花产业未来发展的主流方向。机采棉对棉花品种的株型有较高要求: 最好是筒形、第一果枝节位较高, 棉朵离地高度最好大于30 cm, 这样可提高籽棉的采净率。高秆突变体高秆1号具有第一果枝节位高、株型为筒型两个有利机采的性状特征, 因此本研究也为机采棉育种资源的挖掘与潜在利用提供了支撑。