引用本文
王建花, 张耀文, 程须珍, 王丽侠. . 绿豆分子遗传图谱构建及若干农艺性状的QTL定位分析. 作物学报, 2017, 43(7): 1096-1102
WANG Jian-Hua, ZHANG Yao-Wen, CHENG Xu-Zhen, WANG Li-Xia. . Construction of Genetic Map and Identification of QTLs Related to Agronomic Traits in Mung Bean. ACTA AGRONOMICA SINICA, 2017, 43(7): 1096-1102  
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绿豆分子遗传图谱构建及若干农艺性状的QTL定位分析
王建花1,2,3, 张耀文3, 程须珍2,*, 王丽侠2,*
1山西大学, 山西太原 030006
2中国农业科学院作物科学研究所, 北京 100081
3山西省农业科学院作物科学研究所, 山西太原 030031
*通讯作者(Corresponding authors): 程须珍, E-mail: chengxuzhen@caas.cn, 王丽侠, E-mail: wanglixia03@caas.cn, Tel: 010-62180535

第一作者联系方式: E-mail: 986254540@qq.com

收稿日期:2016-12-11 接受日期:2017-03-02 网络出版日期:2017-03-19
基金:本研究由国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-09)和中国农业科学院农业科技创新工程资助
摘要

利用花叶1号×紫茎1号杂交后代衍生的208个F2家系组建群体, 构建含有95个SSR标记位点的遗传连锁图谱, 该图谱包含11个连锁群, 全长1457.47 cM, 标记平均间距为15.34 cM。利用复合区间作图法, 对株高、幼茎色、主茎色、生长习性、结荚习性、复叶叶形和成熟叶色等农艺性状进行QTL分析, 分别检测到与株高、幼茎色、主茎色、复叶叶形有关的QTL各1个, 贡献率在8.49%~66.64%之间; 与结荚习性有关的QTL3个, 贡献率在60.32%~80.36%之间; 与成熟叶色有关QTL 4个, 贡献率在69.06%~87.35%之间; 与生长习性有关的QTL数量最多, 共26个, 贡献率在58.32%~99.51%之间。上述QTL主要分布在LG1、LG2、LG4、LG8和LG10连锁群, 其中LG1最少, 仅检测到生长习性的1个QTL, LG4最多, 包含了幼茎色、主茎色、结荚习性、生长习性、复叶叶形、成熟期叶色6个农艺性状的15个QTL; 这些QTL既可以应用于绿豆育种的分子标记辅助选择, 也对深入研究这些性状的遗传奠定了基础。

关键词: 绿豆; 连锁遗传图谱; SSR标记; 复合区间作图法; QTL; 贡献率
Construction of Genetic Map and Identification of QTLs Related to Agronomic Traits in Mung Bean
WANG Jian-Hua1,2,3, ZHANG Yao-Wen3, CHENG Xu-Zhen2,*, WANG Li-Xia2,*
1 Shanxi University, Taiyuan 030006, China
2Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
3Institute of Crop Science, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China
Fund:This study was supported by the China Agriculture Research System (CARS-09) and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS
Abstract

Two hundreds and eight individuals of F2 population, derived from a cross between two mung bean genotypes (Huaye 1 and Zijing 1) were used to construct genetic map, and to identify QTLs related to important agronomic traits. This genetic map contained 11 linkage groups with a total length of 1457.47 cM and an average interval of 15.34 cM. QTLs mapping was conducted for plant height, young stem color, main stem color, growth habit, podding habit, trilobate leaf shape and mature leaf color using composite interval mapping method. Only one QTL for each trait was detected including plant height, young stem color, main stem color and trilobate leaf shape, and with a contribution ranging from 8.49% to 66.64%. Three QTLs with high contribution rates from 60.32% to 80.36% were identified for the trait of pod habit in mung bean. Four QTLs related to mature leaf color showed at contribution rate from 69.06% to 87.35%. There were 26 QTLs related to growth habit, the most of the tested QTLs, with a contribution rate each from 58.32% to 99.51%. The present QTLs for seven agronomic traits distributed on LG1, LG2, LG4, LG8, and LG10, respectively, could be used in molecular breeding based on marker-assisted selection in mung bean, and also lay a foundation for further study of the inheritance of these traits.

Keyword: Mung bean; Genetic linkage map; SSR markers; Composite interval mapping (CIM); QTL; Contribution rate

绿豆[Vigna radiata (L.) Wilczek](2n=2x=22)是豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionaceae)菜豆族(Phaseoleae)豇豆属(Vigna)的一个种, 是一种快速生长的热季豆类作物, 主要在亚洲发展中国家种植, 是世界上重要的豆类作物。绿豆的基因组较小, Kang等[1]使用MAKER pipeline[2]预测并通过测序得到绿豆的基因组为421 Mbp (占全基因组得到的80%), 与豆科模式植物百脉根和蒺藜苜蓿基因组(均约为470 Mbp)大小相近[3], 并绘制了豇豆属的第一个基因组序列草图。

图谱构建与基因定位是绿豆基因组研究的重要环节, 是基因克隆乃至基因组结构与功能研究的基础。目前, 绿豆的基因定位研究还处于起步阶段, 已定位的性状主要有抗白粉病和抗豆象, Humphry等[4]、Reddy[5]、Parinya等[6]、Chaitieng等[7]、Young等[8]都有相关报道, 其中Reddy[5]以3个抗白粉病绿豆株系(V4718、V4758、V4785)为研究材料, 证明抗白粉病基因是由单显性基因控制的, 主要有Pm1、Pm2等。梅丽等[9]、赵丹等[10]、钟敏[11]和吴传书等[12]利用Berken/ACC41为材料, 将抗豆象基因定位在第9连锁群上一个2.4 cM的区间内, 离其两侧的标记C220和Vr2-627的距离分别为0.7 cM和1.7 cM。此外, 梅丽等[9]以Berken/ACC41为材料, 利用基于混合线性模型[13]的QTLNetwork 2.0[14]软件的复合区间作图法进行QTL分析, 并检测出播种到出苗时间、播种到开花时间、生育期等9个农艺性状相关的33个加性效应位点(赵丹等[10]和钟敏[11])。

绿豆中除了产量相关性状外, 还有好多表型性状可用于品种纯度鉴定、特性鉴别等研究中, 如花青甙显色、叶形等等。本研究利用具有特异叶形的花叶1号和具有明显花青甙显色的紫花1号的后代群体, 对某些表型性状进行QTL定位, 旨在尽可能发掘有利用价值的等位基因, 将分子标记辅助选择用于育种实践, 以培育优质高产和多抗新品种; 另一方面可从众多绿豆种质资源中选择出有价值的材料。

1 材料与方法
1.1 分离群体材料

2015年选用紫茎1号为父本、花叶1号为母本, 配制杂交组合。以幼茎色鉴别真假杂种后, 将杂种F2种植在北京, 小区行长1 m, 株距10 cm, 田间对亲本及208个F2群体的株高(PH)、幼茎色(YSC)、主茎色(MSC)、生长习性(GH)、结荚习性(PHA)、成熟叶色(MLC)(注: 收荚时叶片的颜色)和复叶叶形(TLS)性状, 严格按照《绿豆种质资源描述规范和数据标准》[15]的分级标准统计分析(其中复叶叶形人为划分为花、半圆、圆3个等级)并转换为“ 1” 、“ 2” 、“ 3” 。

1.2 SSR引物

SSR引物均基于SSR富集文库, 利用磁珠富集法开发[15], 其中单核苷酸单元重复序列引物(Vr1) 2007对, 二核苷酸单元重复序列引物(Vr2) 1696对, 三核苷酸单元重复序列引物(Vr3) 1485对, 共5188对。均由北京赛百盛生物技术有限公司合成。

1.3 总DNA提取和PCR扩增

采集亲本以及F2群体每个单株的幼嫩叶片, 分别放入液氮罐中备用。用Retsch MM400混合型碾磨仪研磨, 改良的CTAB法[16]提取基因组DNA, 紫外分光光度计法检测DNA的质量。

PCR扩增反应总体积10 μ L, 含30 ng基因组DNA, 1× Taq缓冲液 (20 mmol L-1 Tris-HCl, pH 8.8; 10 mmol L-1 KCl; 10 mmol L-1 (NH4)2SO4; 1.5 mmol L-1 MgCl2; 0.1% Triton X-100), 1 mmol L-1 dNTPs, 上下游引物各0.25 μ mol L-1和1 U Taq DNA聚合酶。PCR程序为95℃预变性5 min, 95℃变性30 s, 55℃退火45 s, 72℃延伸45 s, 进行35个循环, 最后72℃延伸5 min, 4℃保存。整个反应在东胜EDC-810 PCR扩增仪上进行。

用8%的聚丙烯酰胺非变性凝胶电泳分离扩增产物, 在200 V恒压下电泳, 根据SNP分子量的大小及差异带型的可辨程度调整电泳时间, 一般在1.0~1.5 h左右。将凝胶用蒸馏水洗涤2次后, 用0.2%的AgNO3溶液染色10 min, 蒸馏水洗涤2次后用1.5% NaOH加0.5%甲醛溶液显影至条带清晰, 蒸馏水洗涤2次后读带。

1.4 连锁图谱的构建

根据电泳结果, 用A、B、H、“ -” 表示标记的母本、父本、杂合、缺失。根据已知分子量的Marker (600 bp DNA marker)计算各多态性条带的分子量。将SSR多态性带按亲本来源归类, 分别转化为“ 0” 、“ 2” 、“ 1” 、“ -1” 。根据各位点在作图群体中的分离比, 采用JoinMap 4.0软件构建F2群体的遗传连锁图谱。

1.5 QTL定位分析

利用QTL IciMapping V4.0软件进行QTL的定位。采用区间作图法对基因型和性状进行分析, 将Permutation次数设置为1000次, LOD≥ 3.68作为QTL的入选临界值。检测性状与作图标记之间的关系及QTL位点在遗传连锁图谱上的位置, 估算出与农艺性状相关基因位点的贡献率等参数。最后利用JoinMap 4.0整合的MapChart输出图谱。

2 结果与分析
2.1 SSR标记的多态性分析

共筛选5188对SSR引物, 4281对引物有稳定的扩增产物, 亲本间有多态且扩增稳定的的引物99对。其中Vr1引物有效扩增1651对, 有效扩增率82.26%, 多态性引物64对; Vr2引物有效扩增1309对, 有效扩增率77.18%, 多态性引物55对; Vr3引物有效扩增1321对, 有效扩增率88.96%, 多态性引物32对, 表明二核苷酸单元重复序列引物多态性比率(4.20%)最高, 单核苷酸单元重复序列引物的多态性比率(3.88%)次之, 三核苷酸单元重复序列引物多态性比率(2.42%)最低。另外还从豇豆SSR引物和绿豆公布序列引物中分别得到亲本多态性引物1对和3对。

表1 不同引物在F2群体亲本中的扩增 Table 1 Amplification of different markers in parents of F2
2.2 连锁图谱的构建

利用筛选的99对引物分析208个F2群体后, 应用JoinMap 4.0软件进行连锁分析, 构建绿豆遗传连锁图谱。该图谱包含了95个SSR标记(其中Vr3-985、Vr2-657、Vr1-574和Vr2-1430未连锁上), 分属11个连锁群(LG), 总覆盖基因组长度1457.47 cM, 各连锁群长度在5.52~613.74 cM之间, 其中LG6最短, LG4最长。不同连锁群上包含的标记位点在2~28个之间, 标记之间平均距离在1.38~21.92 cM之间。

根据已知绿豆基因组引物标记分布情况, 比对本文连锁图谱可知, 第一连锁群(LG1)有11个标记, 其中只有Vr2-401位于绿豆基因组的Chr.6; LG2有19个标记, 其中70%的标记对应于绿豆基因组的Chr.9; LG3有7个标记, 其中43%的标记对应于绿豆基因组的Chr.1; LG4有28个标记, 7个标记对应绿豆基因组的Chr.4, 8个对应绿豆基因组的Chr.5, 7个标记对应绿豆基因组的Chr.8; LG5有3个标记, 全都对应绿豆基因组的Chr.1; LG6有4个标记, 2个对应绿豆基因组的Chr.1, 另外2个对应Chr.7; LG7有2个标记, 对应绿豆基因组Chr.8; LG8有4个标记, 全都对应绿豆基因组Chr.7; LG9有5个标记, 其中3个对应绿豆基因组Chr.11; LG10有7个标记, 与绿豆基因组无明显的对应关系; LG11有5个标记, 全部对应绿豆基因组Chr.7。

表2 遗传图谱分析 Table 2 Analysis of genetic map
2.3 绿豆重要农艺性状在F2群体中的表现

分析表明, 数量性状株高在F2群体中存在差异。各单株的株高差异明显, 标准差为5.92, 变异幅度大, 且株高在F2群体中均呈正态分布(图1)。其余6个均为质量性状, 且用SAS统计软件对F2群体208个单株进行统计分析, 株高(PH)、幼茎色(YSC)、主茎色(MSC)、生长习性(GH)、结荚习性(PHA)、复叶叶形(TLS)成熟叶色(MLC)的卡方检验结果(P=0.05)均不符合孟德尔遗传分离比(图1)。故可认为7个农艺性状均为多基因控制的遗传性状。

图1 F2群体中数量性状与质量性状的分布Fig. 1 Distribution of quantitative and quality traits in F2 population

2.4 绿豆重要农艺性状的QTL定位

应用复合区间作图法, LOD等于3.68作为阈值。检测到7个性状的38个QTL (表3)。检测到1个株高QTL, 位于连锁群8的Vr3-932-Vr2-1233 (11.79 cM)区间, 与Vr2-1233的遗传距离为11.79 cM, 遗传贡献率为8.49%。

表3 绿豆7个产量相关性状的QTL及其遗传分析 Table 3 QTLs for seven yield-related traits and their genetic analysis in F2 population

检测到1个幼茎色QTL, 位于连锁群4的Vr2-1042- Vr1-1057 (63.74 cM)区间, 与Vr2-1042的遗传距离为28 cM, 遗传贡献率为66.64%。

检测到1个主茎色QTL, 位于连锁群4的Vr04-12148918- Vr2-1042 (45.49 cM)区间, 与Vr2-1042的遗传距离为19 cM, 遗传贡献率为38.68%。

检测到3个结荚习性QTL, 一个位于连锁群2的Vr3-837-Vr2-440 (25.54 cM)区间, 与Vr2-440的遗传距离为9.7 cM, 遗传贡献率为60.32%; 另外2个都位于连锁群4的Vr1-545-Vr3-1177 (63.36 cM)区间, 其中一个位于346 cM处, 与Vr1-545的遗传距离为25.99 cM; 另一个位于361 cM处, 与Vr3-1177的遗传距离为22.37 cM, 遗传贡献率分别为67.82%、80.36%。

检测到26个生长习性QTL, 一个位于连锁群1的Vr3-791-Vr3-303 (3.55 cM)区间, 与Vr3-303的遗传距离为1.58 cM, 遗传贡献率为58.32%; 16个位于连锁群2的Vr3-837-Vr2-440 (25.54 cM)、Vr2-440-Vr1-1509 (53.86 cM)区间, 遗传贡献率均为99.51%; 8个位于连锁群4的Vr3-1117-Vr3-1177 (98.33 cM)区间, 遗传贡献率均为99.51%; 1个位于连锁群10的Vr3-1246-Vr3-40 (17.87 cM)区间, 与Vr3-40的遗传距离为6.29 cM, 遗传贡献率均为99.51%。

检测到一个复叶叶形QTL, 位于连锁群4的Vr1-598~ Vr1-2059 (67.79 cM)区间, 与Vr1-2059的遗传距离为31.32 cM, 遗传贡献率为54.96%。

检测到4个成熟期叶色QTL, 2个位于连锁群2, 其中一个位于Vr2-1675-Vr3-107 (52.14 cM)区间, 与Vr3-107的遗传距离为25.14 cM; 另一个位于Vr2-440-Vr1-1509 (53.86 cM)区间, 与Vr1-1509的遗传距离为25.56 cM, 遗传贡献率分别为87.35%和69.06%; 2个位于连锁群4, 其中一个位于Vr1-598-Vr1-2059 (67.79 cM)区间, 与Vr1-2059的遗传距离为32.32 cM; 另一个位于Vr04-12148918- Vr2-1042 (45.49 cM)区间, 与Vr04-12148918的遗传距离为21.49 cM, 遗传贡献率分别为87.2%、84.3%。

图2 检测到的主效QTL在连锁群上的分布(LG)Fig. 2 Location of additive effects QTLs on linkage groups（GH: growth habit; MLC: mature leaf color; PHA: podding habit; TLS: trilobate leaf shape; MSC: main stem color; YSC: young stem color; PH: plant height.）

3 讨论
3.1 绿豆遗传图谱的构建

遗传图是定位和挖掘基因的基本工具。绿豆现有遗传图的标记密度仍然很低, 并且只有少数基因被定位。早期图谱由RFLP标记构建的14个连锁群组成, 平均标记间距为9 cM [18], 另2个图谱由12个连锁群组[19]组成, 而基于RFLP标记的另一个连锁图谱只有9个连锁群[20]。Wang等[21]整合了一张含有560个标记物的11个连锁群遗传图谱, 连锁群的长度为45.2~117.0 cM, 总覆盖度为732.9 cM, 平均间隔在1.3 cM之间, 是比较饱和的遗传图谱。本研究所构建的新图谱大于钟敏[11]构建图谱的长度735.0 cM, 小于赵丹等[10]的1831.8 cM, 且标记间距远大于Humphry等[22]和Wang等[21]的3.0 cM和1.3 cM, 图谱上的标记较少。其主要原因是试验所用的亲本都为栽培品种, 与前人用的野生种、野生种加栽培种相比, 栽培种之间的遗传背景相似, 基因组变化较小, 所以筛选到的多态性引物比较少, 导致所绘制的连锁图谱长度比之前研究发表的图谱长, 标记间平均距离大。另外本文使用的是F2群体的208个家系, 前人研究所用材料为RIL群体, 对图谱的构建也会造成一定影响。

3.2 绿豆农艺性状的QTL定位相关分析

本研究所构建图谱与赵丹等[10]、钟敏[11]加密连锁图谱的QTL定位结果相比, 将株高QTL定位在LG8, 与梅丽[23]的研究结果(第2、第8、第9连锁群)基本一致, 对其他6个农艺性状都是首次进行QTL定位。且本研究中发现, 控制生长习性的QTL主要集中在第2、第4连锁群, 且成簇出现。在第2连锁群Vr3-837~Vr1-1509之间79.4 cM, 检测到16个生长习性QTL, 且各个位点之间的距离为2~15 cM, 第4连锁群Vr3-1117~Vr3-1177之间98.33 cM, 检测到8个生长习性QTL, 且各个位点之间的距离为2~31 cM。在钟敏[11]的研究中也发现相同的现象, 影响荚长的QTL在第9连锁群的P3-334~P1-37有2个。复叶叶形(TLS) QTL被定位在LG4的Vr1-598~Vr1-2059之间, 相距67.79 cM, 且Vr1-598属于第5染色体, Vr1-2059属于第8染色体, 而Jiao等[24]将叶瓣边缘基因(lma)定位在绿豆的Chr.3, 结果不一致。

对比已知的绿豆基因组染色体标记可知, LG2= Chr.9; LG3上43%的标记与LG5上全部标记对应于绿豆基因组的第1染色体上, 理论上LG3和LG5为同一条连锁群, 即LG3+ LG5=Chr.1; LG8与LG11的所有标记全都对应于绿豆基因组的第7染色体上, 理论上LG8和LG11为同一条连锁群, 即LG8+LG11=Chr.7; LG9上60%标记全都对应于绿豆基因组的第11条染色体上, 理论上LG9=Chr.11; LG4上由Chr.4、Chr.5和Chr.8的标记所组成, 理论上应该拆分为3条染色体, 即Chr.4、Chr.5和Chr.8。其余的连锁群上标记分布散乱, 无规律可循, 导致上述结果的原因可能是标记数量少、各连锁群上的标记区间过大。实验所观测的7个农艺性状主要集中在LG1、LG2、LG4、LG8、LG10上, 其中LG1最少, LG4最多; 其余连锁群没有检测到相关农艺性状的QTL。

今后的研究工作应注重构建新的NIL群体用于连锁图谱分析, 增加结果的可靠性, 并开发新的标型记类, 提高引物多态性, 提高连锁图谱上的标记密度。

The authors have declared that no competing interests exist.

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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