RNA干扰(RNA interference, RNAi)是动物、植物以及微生物中普遍存在的一种遗传现象, 具有保守的作用机制和生物学功能^{[1, 2]}。RNAi技术率先在植物病毒、线虫等病虫害控制中取得良好进展^{[3, 4, 5]}, 随后拓展至植物真菌病害防控领域。Nowara等^[6]发现植物表达靶向大麦白粉病菌葡聚糖转移酶(GTF1/GTF2)效应子(Avra10)的RNA干扰分子, 引起侵染大麦的白粉病菌吸器减少、菌丝生长受到抑制, 从而提高了大麦的白粉病抗性, 据此首次提出了寄主诱导的基因沉默(host-induced gene silencing, HIGS)的概念。Tinoco等^[7]在烟草中表达靶向GUS基因RNA干扰分子, 接种携带GUS基因的串珠镰刀菌, 发现侵染烟草的镰刀菌中的GUS基因表达量显著降低, 表明寄主表达的RNA干扰分子, 可以进入寄生在植物组织中的真菌细胞, 干扰真菌基因的表达。

HIGS技术是病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术的发展^[3]。HIGS通常以病原菌生长发育、致病过程中的关键基因为靶点, 在寄主植物中表达与靶基因序列互补的RNA干扰分子, 经植物细胞Dicer核酸酶加工形成19~25 nt的小RNA分子(small interfering RNA, siRNA), 病原菌在侵染植物过程中摄入这些siRNA, 从而干扰真菌靶基因的翻译和转录, 影响真菌生长发育, 延缓病菌扩展, 降低病害损失, 使植物呈现抗病表型。HIGS中植物细胞表达形成的siRNA亦可作为引物, 在RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRP)作用下, 以靶基因的mRNA为模板, 合成新的双链RNA (double-strand RNA, dsRNA), 经Dicer酶加工, 再形成新的siRNA, 供真菌细胞摄取。如此反复循环, 使寄主细胞中的小RNA分子得以不断扩增, 从而增强RNAi效应^{[8, 9, 10, 11]}, 赋予植物持久抗病性。

HIGS作为一种新型植物真菌病害防控技术, 已被用于不同植物与病原真菌的互作及重要作物抗真菌病害的研究中, 取得了一些重要研究进展(表1), 展示出良好的发展应用前景。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 HIGS技术在植物抗真菌病害领域的研究进展 Table 1 Recent advances in host plant-induced gene silencin(HIGS) for plant improvement against fungal diseases

表1 HIGS技术在植物抗真菌病害领域的研究进展 Table 1 Recent advances in host plant-induced gene silencin(HIGS) for plant improvement against fungal diseases

在专性寄生真菌中, Nowara等^[6]首次将HIGS技术应用于大麦抗白粉病研究。随后, Pliego等^[12]在大麦中利用HIGS单细胞分析(single-cell assay)技术, 筛选出8个干扰大麦白粉病菌(B. graminis f. sp. hordei)侵染的效应子。Zhang等^[13]利用大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)介导的VIGS瞬间表达体系, 干扰小麦条锈病菌(Puccinia striiformisf. sp. tritici)钙依赖磷酸酶(Calcineurin)亚基PsCNA1和PsCNB1基因的表达, 可减少病菌产孢量, 延缓菌丝扩展; Panwar等^{[14, 15]}针对小麦叶锈病菌(P. triticina)促分裂素原活化蛋白激酶(PtMAPK1)、亲环蛋白(PtCYC1)、钙依赖磷酸酶B基因(PtCNB), 分别利用农杆菌介导法和BSMV-VIGS两种瞬时表达体系, 在小麦叶片中瞬时表达它们的RNAi构建体, 可显著抑制病原菌生长。

在非专性寄生真菌中, Koch等^[16]针对禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)麦角固醇合成相关的甾醇-14α -去甲基化酶基因(CYP51), 在拟南芥和大麦中表达了一个CYP51-A、CYP51-B和CYP51-C基因串联片段的RNAi构建体, 禾谷镰刀菌接种鉴定结果表明转基因植物的抗性显著提高; Ghag等^[17]以尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporumf. sp.cubense)的Velvet基因和转录因子Ftf1基因为靶点, 在香蕉中分别表达它们的RNAi构建体, 转基因植株抗香蕉萎蔫病能力显著优于未转化的对照。我们以小麦赤霉病菌(F. graminearum)几丁质合酶(chitin synthase, Chs)基因3b为靶点, 将这个基因3个片段的RNAi构建体, 共转化小麦品种扬麦15, 在苗期和花期接种赤霉病菌的鉴定结果表明, 转基因株系既抗苗腐和穗腐, 也抗赤霉菌毒素^[18]。最近, Chen等^[19]在小麦中分别表达靶向黄色镰刀菌(F. culmorum)葡聚糖合酶基因、MAP激酶、几丁质合酶5基因的RNAi构建体, 也提高了转基因小麦的赤霉病抗性。Wang等^[20]以灰霉病菌(Botrytis cinerea)和黄萎病菌(Verticillium dahliae)的Dicer同源蛋白(Dicer-like protein, DCL)基因为靶点, 在拟南芥中共表达BcDCL1/2和VdDCL1/2的RNAi构建体, 获得的转基因植株兼抗这两种病原真菌。

在卵菌中, 不同基因的HIGS表型出现变异。Zhang等^[21]在拟南芥中分别表达绿色荧光蛋白基因GFP和寄生疫霉(Phytophthora parasitica)基因PnPMA1的RNAi构建体, 在植物体内可检测到GFP和PnPMA1约21 nt的小RNA分子, 接种携带GFP编码基因的寄生疫霉后, 未能降低GFP和内源PnPMA1的表达量, 也未发生明显的表型变化。作者分析认为, 这可能是寄生疫霉在侵染植物过程中, 缺乏有效摄入dsRNA/siRNA的作用机制。但是, Govindarajulu等^[22]的研究表明, 以莴苣盘梗霉(Bremia lactucae)的未知功能基因HAM34和纤维素合成酶基因CES1为靶点, 经农杆菌介导法将HAM34-RNAi和CES1-RNAi构建体导入到莴苣中, 获得的转基因植株的抗霜霉病水平显著提高。这些结果似乎说明, 不同类型的卵菌与不同的寄主植物互作时, 可能具有不同的小RNA分子交换或扩增机制。实际上, 目前关于病原菌如何从植物细胞中摄取dsRNA或siRNA分子, 这方面的机制尚不清楚, 还有待进一步明确。

长期以来, 学术界一直在寻找高效、特异的植物病原菌控制靶点, HIGS技术的发展为开发和利用源于病原菌的抗病资源提供了一个有效途径, 特别是对于抗病资源匮乏的作物抗病改良具有重要意义。一般认为, HIGS靶基因主要包括控制病原菌生长发育、产孢繁殖、侵染或致病的关键或必需功能基因。此外, 在真菌中, 越来越多的非编码RNA (non-coding RNA, ncRNA)的发现, 可被视为一种新的遗传资源。这类RNA不行使编码蛋白质的功能, 却是维持真菌基本生存和调节基因表达必不可少的分子。以病原菌特异ncRNA为靶点, 如利用target mimics技术^{[24, 25, 26]}, 干扰其正常的功能, 导致其功能紊乱, 这将进一步拓宽源于病原菌的抗病资源开发渠道, 为抗病育种提供更多选择, 培育广谱、持久的植物抗病品种。

近年研究表明, 灰霉病菌(B. cinerea)和黄萎病菌(V. dahliae)在侵染植物过程中, 向寄主细胞中分泌一些效应子, 除了传统认为的效应蛋白外, 还发现一类小RNA分子, 这类小RNA分子由Dicer同源蛋白DCL1和DCL2加工而成, 它们在植物抗病免疫防卫反应中具有重要作用^{[20, 27]}。利用HIGS技术, 在植物体内表达DCL1/2-RNAi构建体, 可以显著提高寄主的抗病能力。此外, 在植物体表施用人工合成的DCL1/2-dsRNA或siRNA分子, 同样也起到很好的病害防治效果^{[20, 27]}。Koch等^[28]的研究也表明, 在大麦叶片表面喷施CYP3-dsRNA (CYP51-A、CYP51-B和CYP51-C基因片段串联dsRNA)分子, 接种后禾谷镰刀菌生长受到严重抑制。据Zhang等^[29]新近报道, 植物自身也可以分泌一些microRNA分子, 这些microRNA分子被病原菌摄取, 可以靶向干扰病原菌致病过程中一些关键基因的表达, 从而抵御病原菌侵染和扩展。这些研究结果揭示了小RNA分子能够在某些病原真菌与寄主植物之间双向迁移, 为基于RNA干扰分子新型杀菌剂的研发及应用提供了依据。

随着现代生物技术的发展, 以及植物与病原菌互作分子机制的深入研究, HIGS技术在发掘与利用新型抗病资源方面显示出了巨大的应用潜力。由于具有基于核苷酸序列的靶向特异性, 这项技术也为培育稳定、环境安全的转基因作物提供了一种新思路, 在作物抗病遗传改良中具有重要意义。