为了分析玉米SNAC基因中的遗传变异, 选用玉米育种及生产中常用的16个自交系(表1), 其中含杂种优势亚群PB、LAN (Lancaster)、SPT (唐四平头)、LRC (旅大红骨)血缘自交系各3份, Reid血缘自交系4份。研究材料涵盖了我国玉米种质的五大杂种优势类群, 大多数选自我国广泛种植的杂交种的亲本, 多样性丰富。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 研究用玉米自交系的基本情况 Table 1 Basic information of tested maize inbred lines 自交系 Inbred line 类群a Heterotic group 系谱 Pedigree 耐旱性(SI)b Drought tolerance 齐318 Qi 318 PBc 源自78599杂交系 Derived from hybrid 78599 -2.05 齐319 Qi 319 PB 源自78599杂交系 Derived from hybrid 78599 1.13 X178 PB 源自78599杂交系 Derived from hybrid 78599 1.48 豫12 Yu 12 LAN (Lancaster) Mo17改良系 Improved from Mo17 1.52 吉412 Ji 412 LAN (Lancaster) 源自Mo17 Derived from Mo17 -0.01 Mo17 LAN (Lancaster) C103× 187-2 0.97 CN962 唐四平头 SPT 黄早四改良系 Improved from Huangzaosi -1.51 黄早四 Huangzaosi 唐四平头 SPT 源自唐四平头 Derived from Tangsipingtou 0.35 昌7-2 Chang 7-2 唐四平头 SPT (黄早四× Wei95)× S901 (Huangzaosi× Wei 95)× S901 0.18 铁7922 Tie 7922 Reid 源自3382杂交系 Derived from hybrid 3382 2.26 掖478 Ye 478 Reid U8112× 沈5003 U8112× Shen 5003 0.25 郑58 Zheng 58 Reid 掖478改良系 Improved from Ye 478 -0.52 B73 Reid BSSSC5 0.96 CA339 旅大红骨 LRC Pool 33 优质蛋白玉米 Pool 33 QPM -0.90 丹340 Dan 340 旅大红骨 LRC Baigulv 9× Lemma corn Co60 -0.26 吉81162 Ji 81162 旅大红骨 LRC 525× 掖107 525× Ye 107 -1.82 aThe division of heterotic breeding groups for maize inbred lines is shown by Liu et al.[15] in detail in 2015; bThe assessment of drought tolerance is based on the maize selection index (SI) by Hao et al.[16] in 2011; cPB is described by Zhang S H[17] in 2014. SPT: Tangsipingtou; LRC: Lyuda Red Cob. a玉米自交系杂种优势群的划分详见Liu等[15], 2015; b耐旱性的评估以玉米选择指数(SI)判断为准, 详见Hao等[16], 2011; c详见张世煌[17], 2014。

表1 研究用玉米自交系的基本情况 Table 1 Basic information of tested maize inbred lines

分别挑选各玉米自交系大小一致且饱满的玉米种子20粒, 均匀地摆放于装有栽培土的塑料花盆中, 将土浇灌至湿润但不漏水的状态, 2~3 d浇灌一次, 待幼苗长至三叶期时将幼苗剪到自封袋中放入超低温冰箱保存以备提取DNA使用。采用CTAB小量法^[18]提取16份玉米自交系总DNA。

根据聚类获得的16个玉米SNAC基因编码区及启动子区800 bp核苷酸序列, 使用Primer 5.0软件设计引物, 采用巢式引物扩增序列较长的基因。16个SNAC基因中扩增出12个基因的全长, 引物信息详见表2, 由美吉生物公司完成12个SNAC基因的PCR扩增、产物回收与纯化及样品测序。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 扩增12个SNAC基因序列所用引物信息 Table 2 Basic information of primers for 12 SNAC genes 基因名称a SNAC genea 引物名称b Primerb 引物序列 Primer sequence (5° -3° ) 长度 Primer length (bp) 退火温度 Annealing tempreture (℃) ZmNAC010312 GRMZM2G347043-1F AGCACGATAATGAACCCTC 19 53 GRMZM2G347043-1R TGTACGCTACACCGACACT 19 53 ZmNAC010373 GRMZM2G011598-1F GACTCGTTGGTGGAGGTGG 19 56 GRMZM2G011598-1R AAGTACAAATCCGTCAATCCC 21 56 ZmNAC020303 GRMZM2G162739-1F TGTCGGCTGCGGTTGAGA 18 58 GRMZM2G162739-1R GGCAGAGCACCCAGTCAT 18 58 GRMZM2G162739-2F GGTCAAGACGGAGTGGAT 18 55 GRMZM2G162739-2R TTGCGATGACTAAACGAAG 19 55 ZmNAC030295 GRMZM2G014653-1F AGTTACGGGTGGGTTCAT 18 54 GRMZM2G014653-1R ATTGGTTCACGGCTGCTA 18 54 GRMZM2G014653-2F ACCTCTACAAGTTCGACCCA 20 56 GRMZM2G014653-2R AGTCAACAATGGCGGCTC 18 56 ZmNAC031467 GRMZM2G312201-1F AGCGAGCAAACCATCTAA 18 53 GRMZM2G312201-1R TAAAGGGAACATAGCAACAC 20 53 GRMZM2G312201-2F TGGTCGCAAGGAGTGGTA 18 56 GRMZM2G312201-2R TGGTGGGTGACGGAGTGAGG 20 56 GRMZM2G312201-3F GCCCACTTGTACGATTGA 18 54 GRMZM2G312201-3R ACGCTAACCCTTGCTCTA 18 54 GRMZM2G312201-4F CAGTTGAGGCACTTGAGC 18 55 GRMZM2G312201-4R TCTTCAGCCTGCATTAGC 18 55 ZmNAC040359 GRMZM2G123667-1F AAATTGACGCTTGGGAAGA 19 54 GRMZM2G123667-1R GGAAGAGGCTTGGAGATGA 19 54 GRMZM2G123667-2F CATCTCCAAGCCTCTTCC 18 56 GRMZM2G123667-2R CGAGCACTCCTGGTTTCT 18 56 ZmNAC050302 GRMZM2G336533-1F TGGCTGATGCGGTGTTTG 18 55 GRMZM2G336533-1R GGTCCCTGGGCGTGAAGA 18 55 GRMZM2G336533-2F CACCGCTTCTAGTTCTCG 18 55 GRMZM2G336533-2R CTTCAAACATTGCCATTCG 19 55 ZmNAC070395 GRMZM2G430849-1F ACGATTGTTGATTGCTCCAT 20 56 GRMZM2G430849-1R CGCACGACCCATCTTTATT 19 56 ZmNAC080308 GRMZM2G068973-1F GTGATCGCATTGATACCG 18 54 GRMZM2G068973-1R GTCTGCCACATCTTCGTC 18 54 ZmNAC080398 GRMZM2G109627-1F CCTTCGCTTGAATCTCCC 18 55 GRMZM2G109627-1R GCAGCGGTATTCTTTCCT 18 55 ZmNAC090241 GRMZM2G042494-1F GCTAGTTATTGTTGTCCTCCTG 22 54 GRMZM2G042494-1R AAGTACCACTCCTTGTCCC 19 54 GRMZM2G042494-2F GACTCAGCTCGCATCACA 18 56 GRMZM2G042494-2R ACCTCCTCGAACAAGTGC 18 56 ZmNAC100475 GRMZM2G127379-1F ATGATTCTAAGCCTGGTATGTC 22 58 GRMZM2G127379-1R GACGCCGACGACGATGTT 18 58 GRMZM2G127379-2F AGCCAAGGCATTGTTCGG 18 56 GRMZM2G127379-2F CGTGCATGGGTCGTCATC 18 56 aThe name of maize SNAC transcription factors was described in detail by Li et al.[19]in 2015, with the name of chromosome and the amino acid fragment size each; bThe name of primers is followed the gene name in the NCBI database. a玉米SNAC基因的名称编号详见Li等19], 2015, 以ZmNAC加基因所在染色体再加氨基酸片段大小命名。b玉米SNAC基因引物以基因所在NCBI数据库中的名称为主进行命名。

表2 扩增12个SNAC基因序列所用引物信息 Table 2 Basic information of primers for 12 SNAC genes

通过ClustalW软件比对玉米SNAC基因序列, 应用PLACE软件分析启动子区域抗逆结合元件, 从MaizeGDB中查找相应基因的启动子区序列导入PLACE中根据需要的元件进行筛选, 又将测序后启动子区有变异的进行结合元件分析。采用DNAsp 5.0软件分析基因序列, 应用π 评估SNAC基因编码区及800 bp启动子区段的核苷酸多态性; 利用Tajima’ s D进行中性检验; 应用SAS软件对耐旱选择指数和变异位点进行t检验分析。

前期研究中的聚类分析表明, 其中的26个NAC蛋白分布于SNAC亚族中, 被称为玉米SNAC转录因子, 编码它们的16个基因被称为玉米SNAC基因^[19]。进一步根据序列特征对这26个未知的玉米SNAC转录因子进行族内聚类分析(图1), 研究发现可以将它们分成3组, 第1组含有4个已知NAC转录因子ZmSNAC1、SNAC1、OsNAC4、OsNAC3及13个玉米SNAC转录因子; 第2组含有ANAC055、ANAC019、ANAC072、AtNAC2、ANAC025及8个玉米SNAC转录因子; 第3组包括5个已知的NAC转录因子ATAF2、OsNAC5、ATAF1、OsNAC6、SNAC2及5个玉米SNAC转录因子。其中拟南芥和水稻中的SNAC1、OsNAC4、ANAC055、ANAC019、ANAC072等基因均已报道与耐逆性相关, 可以提高植物的耐旱性^[19]。根据比对结果, 对序列相近的组内玉米SNAC转录因子的研究可以借鉴拟南芥和水稻中已知的NAC转录因子的研究内容。

图1

Fig. 1

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	图1 玉米SNAC家族和已知的拟南芥、水稻SNAC蛋白的聚类分析 图中SNAC转录因子及拟南芥和水稻SNAC蛋白序列见Li等, 2015[19]。Fig. 1 Phylogenetic tree among the SNAC proteins of maize and NAC proteins of Arabidopsisand rice Protein sequences of SNAC TF from maize, Arabidopsisand rice were described by Li et al. in 2015[19].

植物启动子中包含着许多响应非生物胁迫的保守元件, 调控下游功能基因的时空表达。为了阐明SNAC亚族基因启动子区的保守元件可能的调控机制, 对启动子区有变异的4个基因800 bp启动子区进行分析, 鉴定了与逆境相关的顺式作用元件。应用PLACE软件, 鉴定启动子区3种耐逆响应元件, 即干旱/脱水响应元件(DRE)、低温响应元件(LTRE)和脱落酸响应元件(ABRE)^[20], 基于B73序列4个基因启动子的研究结果, 4个SNAC亚族基因中均检测到3种元件。ZmNAC030295基因中含有4个DRE元件、2个LTRE元件和5个ABRE元件, DRE元件主要在300~700 bp间, LTRE元件在400~500 bp间, ABRE元件在400~700 bp间; ZmNAC040359基因含有2个DRE元件、2个LTRE元件和4个ABRE元件, DRE元件主要在600~700 bp间, LTRE元件在50~700 bp间, ABRE元件在500~700 bp间; ZmNAC050302基因含有5个DRE元件、3个LTRE元件和7个ABRE元件, DRE元件主要在200~800 bp间, LTRE元件在200~600 bp间, ABRE元件在400~ 800 bp间; ZmNAC080308基因中含有2个DRE元件、2个LTRE元件和3个ABRE元件, ABRE元件分布在100~200 bp和700~800 bp之间, DRE元件在300~400 bp间, LTRE元件在600~700 bp之间(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 玉米NAC基因启动子区域抗逆相关顺式作用元件的分布Fig. 2 Distribution of stress-related cis-elements in the promoters of NAC genes

对突变后的4个SNAC基因启动子区逆境结合元件分析表明, 4个基因启动子区共48个多态性位点(29个单体型)分别检测到逆境结合元件, 发现3个基因ZmNAC030295、ZmNAC040359和ZmNAC 080308启动子区结合元件在数量上没有任何变化(与B73序列比较), 只有ZmNAC050302基因突变后ABRE元件数量减少2个, 说明SNAC亚族的这些基因启动子变异后对结合元件影响较小。

16个SNAC基因中除了4个基因(ZmNAC050302、ZmNAC060339、ZmNAC070359、ZmNAC070300)由于测序数据质量差被淘汰外, 共分析了12个SNAC基因的遗传变异。在启动子区和编码区总共检测到393个变异位点, 其中检测到SNP 237个, 插入缺失156个, 各个基因在玉米的10条染色体上位置, 变异位点分布在基因上的位置见图3。

图3

Fig. 3

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	图3 玉米SNAC基因的多态性位点Fig. 3 Polymorphic sites of SNAC genes in maize

在这12个基因中, 在启动子区检测到变异的有4个, 分别是ZmNAC030295、ZmNAC040359、ZmNAC050302和ZmNAC080308; 多态性位点超过30个的基因有4个, 分别是ZmNAC031467、ZmNAC080398、ZmNAC080308和ZmNAC100475; 检测到遗传变异以SNP位点为主的基因主要有ZmNAC010312、ZmNAC010373、ZmNAC050302和ZmNAC070395, 仅检测到3个插入缺失; 以插入缺失为主的基因有1个, 是ZmNAC031467, 达到基因总遗传变异的63.3%。

核苷酸多态性指标π 反映了不同材料之间碱基的差异情况, 用于衡量群体中的多态性程度, 是衡量遗传多样性的重要指标, 群体的变异程度越高, 其遗传多态性越丰富^[21]。在本研究中, 检测到ZmNAC080308的核苷酸多态性最高(π = 0.00962)。另外, ZmNAC010312、ZmNAC030295、ZmNAC050302、ZmNAC080398、ZmNAC090241和ZmNAC100475基因π 值较高, 说明这7个基因群体的变异程度较高, 遗传多态性更丰富; ZmNAC010373、ZmNAC020303 (最低π = 0.00051)、ZmNAC031467、ZmNAC040359和ZmNAC070395基因π 值较低, 说明这个基因群体的变异程度较低(表3)。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 核苷酸多样性与中性检测 Table 3 Nucleotide diversity and neutrality test 基因名称 Gene Tajima’ s D 核苷酸多样性(Pi/π ) Nucleotide diversity ZmNAC010312 -1.08744 NS 0.00217 ZmNAC010373 -1.78041 NS 0.00062 ZmNAC020303 -2.21101* * 0.00051 ZmNAC031467 -2.29433* * 0.00068 ZmNAC030295 -0.78442 NS 0.00269 ZmNAC040359 -0.37821 NS 0.00085 ZmNAC050302 2.14811* 0.00206 ZmNAC070395 0.70217 NS 0.00189 ZmNAC080398 0.93093 NS 0.00360 ZmNAC080308 1.54676 NS 0.00962 ZmNAC090241 0.69718 NS 0.00230 ZmNAC100475 -0.90066 NS 0.00201 * * The gene is subjected to negative selection pressure; * The gene is subjected to positive selection pressure; NS means nonsignificance, the gene is not subjected to selection pressure. * * 为基因受负向选择压力; * 为基因受正向选择压力; NS表示不显著, 为基因不受选择压力。

表3 核苷酸多样性与中性检测 Table 3 Nucleotide diversity and neutrality test

Tajima’ s D检验是鉴定目标DNA序列在进化过程中是否遵循中性进化模型。如果是负的显著结果, 那么这个结果可能是负选择造成的, 反之则受到平衡选择^[22]。本研究利用有限的群体针对自然选择是否影响SNAC亚族基因初步分析, 通过使用Tajima’ s D值来检测群体是否符合中性进化模型(表3), 其中大多数SNAC基因差异不显著, 说明这9个基因在群体中未偏离中性进化, 基因突变受自然选择影响较小; ZmNAC020303、ZmNAC031467基因的Tajima’ s D值分别为-2.21101、-2.29433, 达到极显著水平, 说明这2个基因受负向选择压力较大, 突变受自然选择影响较大; 同时ZmNAC050302基因Tajima’ s D为2.14811, 达极显著水平, 说明这个基因受正向选择压力较大, 基因突变受自然选择影响较大。

t检验适用于总体标准差未知且样本容量小于30的小群体范围。本实验利用t检验, 对12个SNAC基因的393个多态性位点与耐旱选择指数(表4)进行差异显著性分析。结果在P-value < 0.01水平上检测到2个突变位点差异显著, 分别是位于第7染色体上的ZmNAC070395基因的553 bp位点和第8染色体上的ZmNAC080398基因的226 bp位点。初步推测这2个基因变异位点可能对耐旱性有着一定的影响, 需要进一步的验证(表4)。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 SNAC基因多态性位点与选择指数差异显著性分析 Table 4 Significant polymorphic variations in SNAC gene associated with drought-tolerance selection index 基因名称 Gene 位点 Site 内含子/外显子 Intron/exon 显著性 P-value ZmNAC070395 553 外显子2 Exon 2 0.0051* * ZmNAC080398 226 内含子1 Intron 1 0.0079* * * * Significant diffence at the 0.01 probability level.

表4 SNAC基因多态性位点与选择指数差异显著性分析 Table 4 Significant polymorphic variations in SNAC gene associated with drought-tolerance selection index

在植物整个生育期中, NAC家族成员的功能具有多样性, 例如调控植物生长进程, 促进顶端分生组织的发育, 侧根形成, 次生细胞壁的合成等^[23]。本研究通过对SNAC家族基因的进一步聚类分析得知, 由于不同物种蛋白质序列相似性较高, 相似的基因可能含有相同的功能性基序, 所以推测它们能与已知基因聚到一起和已知基因具有相似或相同的功能。

玉米中响应逆境的NAC基因有许多已经被证实, ZmNAC55在拟南芥中过表达同样增强了植株的耐逆性; ZmNAC111在拟南芥和玉米中的过表达都证明该基因使植株抗旱性增强; ZmSNAC1在拟南芥中过表达能够响应干旱^[13]。水稻中相关的NAC基因SNAC1^[24]同样能够响应干旱、高盐、冷和ABA; OsNAC4和ZmNAC080308基因的遗传进化距离较近, OsNAC4基因的功能是调控过敏性细胞死亡^{[25, 26]}, 因此ZmNAC080308基因极有可能参与植物响应逆境胁迫和调控植物生长发育中的过敏性细胞死亡; 通过RNA干扰和基因过表达2种手段对OsNAC5响应非生物胁迫研究发现, RNA干扰的植株对干旱、冷和盐胁迫比野生型的抗性降低, 然而OsNAC5在拟南芥和水稻中过表达能够增强对这些非生物胁迫的抗性^[27]; 此外, OsNAC6基因能够被干旱、ABA、冷和盐所诱导^[28]; SNAC2在水稻中受干旱、盐、冷和ABA诱导, 且在转基因植株过表达能够提高植物耐性, 特别是对干旱和ABA胁迫的耐性^[29]; 另外, 在冷胁迫时, 野生型全部死亡, 而转基因植株仍然有50%的存活率。ANAC055、ANAC019、ANAC072 (RD26) 3个拟南芥NAC基因都能被干旱、高盐或低温所诱导^[30]; ATAF1是拟南芥中第一个被发掘的NAC基因, 它被干旱和ABA强烈诱导, 对拟南芥幼苗进行控水试验发现, 正常浇水条件下ATAF1表达量在很低的水平, 干旱胁迫下ATAF1上调表达, 说明隶属于ATAF1一类的SNAC转录因子具有响应逆境胁迫的功能^[31]。

这些胁迫相关的SNAC转录因子有一个共同点, 那就是在起始密码子前1500 bp区域内(通常认为的启动子区域)都包含有许多胁迫相关的顺式作用元件。本研究中对启动子区有变异的4个基因ZmNAC030295、ZmNAC040359、ZmNAC050302、ZmNAC080308的启动子区800 bp所含逆境相关顺式作用元件进行分析, 发现了3种元件: 干旱/脱水响应元件(DRE)、低温响应元件(LTRE)和脱落酸响应元件(ABRE)。并结合拟南芥及水稻的SNAC基因的聚类分析, 能够进一步推断SNAC转录因子的功能与其启动子区域所包含的这些逆境相关顺式作用元件有着紧密联系。顺式作用元件是由大约5~20 bp的核苷酸编码组成的保守基序, 决定了NAC转录本的启动能力^[32]。研究发现, 寒冷与脱水响应元件(C repeat/DRE/CRT)是一种不依赖于ABA的调控元件, 在冷害、高盐胁迫下都能起一定的调控作用。当DRE/CRT结合蛋白DREB1/CBF在拟南芥过表达时, 改变了40多个胁迫诱导基因的表达, 从而对严寒、高盐、干旱的耐受性发生改变^{[33, 34, 35]}。植物激素ABA在植物生长发育各个阶段及响应非生物胁迫中发挥着重要作用^[36]。例如, 亮氨酸拉链蛋白与ABA响应元件结合后, 在依赖ABA的调控系统中成为一种转录激活因子^{[37, 38]}。目前关于SNAC转录因子启动子顺式作用元件的研究已有许多证实。水稻SNAC基因OsNAC5、OsNAC6启动子区都含有ABA响应元件ABRE^[39]; SNAC1和OsNAC3的启动子包含干旱响应元件(DRE)^[40]。SNAC1启动子还包含LTRE、HSE、ABRE等低温、高热和ABA响应元件^[41]。拟南芥SNAC基因ATAF1启动子同样含有非生物胁迫的顺式作用元件ABRE、DRE/CRT^[31]。对拟南芥NAC转录因子ANAC072启动子1000 bp序列研究中发现了DRE元件^[42]。另外, Mao等^[14]在玉米ZmNAC55的启动子区段检测到一些胁迫相关顺式作用元件ABRE、CRT、LTRE、DRE等。而ZmNAC55又与SNAC1和ZmSNAC1具有很近的同源关系。

单核苷酸多态性是目前发现的最丰富和多样的遗传变异, 玉米中单核苷酸变异非常丰富, 研究发现单核苷酸变异与玉米的基因功能息息相关。因此, 发掘并解析玉米SNAC基因中的单核苷酸多态性对遗传研究非常重要, 玉米基因组中许多SNP或In/Del与基因调控和功能息息相关, 尤其是在逆境适应性方面起着决定性作用^[43]。植物基因组序列变异是导致性状发生的关键, 如果发生在编码区, 一个碱基的变化有可能改变一个蛋白质的功能, 如果在植物的调节基因上发生等位变异, 则有可能影响整个基因的表达水平, 并可以导致定量突变。生物体中大多数自然发生的遗传变异是以单个碱基变化或小的插入/缺失表现的, 这种变异即是SNP或In/Del(单核苷酸多态性及插入缺失)。研究发现, 许多SNP或In/Del无论在结构基因还是在调节基因中都是表型变异的驱动者, 并决定了种质差异。

Mao等^[14]对玉米第10染色体上SNAC基因ZmNAC111 (ZmNAC100475) ATG前572 bp处发现了一个82 bp的微型回文结构MITE的插入, 这导致了甲基化的发生, 并抑制ZmNAC111的表达。它们普遍存在于温带玉米种质中, 而热带玉米种质中缺失, 证明与玉米苗期耐旱性有关。Yang等^[44]对大豆成熟果荚的散粒程度的研究中发现了一个NAC基因SHAT1-5能够调控果荚次生细胞壁的木质化纤维覆盖细胞, 这个机制就是由SHAT1-5引起了在第16染色体的一段约116 kb的选择性清除的结果。目前, 从遗传变异角度探索SNAC基因功能的研究较少, 而这几项研究可以作为玉米自然遗传变异的前车之鉴。在我们的研究当中一共检测了12个SNAC基因的遗传变异, 在启动子区域(ATG前800 bp)检测到变异的有4个, 通过测序分析对比发现, 在ZmNAC080308启动子内产生大量的核苷酸多态性, 其中包括SNP和InDel, 虽然结合耐旱选择指数没有发掘出更多的耐旱功能型变异, 但不可否认这些变异极可能会使作物具有响应非生物胁迫的能力, 我们可以进一步研究其结构及对基因功能的影响, 这为玉米SNAC转录因子的遗传变异研究指引了新方向。