引用本文
吴秋红, 陈永兴, 李丹, 王振忠, 张艳, 袁成国, 王西成, 赵虹, 曹廷杰, 刘志勇. 利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因. 作物学报, 2018, 44(1): 1-14
WU Qiu-Hong, CHEN Yong-Xing, LI Dan, WANG Zhen-Zhong, ZHANG Yan, YUAN Cheng-Guo, WANG Xi-Cheng, ZHAO Hong, CAO Ting-Jie, LIU Zhi-Yong. Large Scale Detection of Powdery Mildew Resistance Genes in Wheat via SNP and Bulked Segregate Analysis. ACTA AGRONOMICA SINICA, 2018, 44(1): 1-14  
DOI:10.3724/SP.J.1006.2018.00001
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利用SNP芯片和BSA分析规模化定位小麦抗白粉病基因
吴秋红1, 陈永兴1, 李丹2, 王振忠3, 张艳2, 袁成国4, 王西成5, 赵虹5, 曹廷杰5,*, 刘志勇1,*
1中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101
2中国农业大学, 北京 100193
3中国农村技术开发中心, 北京 100045
4河北省高邑县原种场, 河北高邑 051330
5河南省农业科学院小麦研究所, 河南郑州 450002
* 通信作者(Corresponding authors): 刘志勇, Email: zhiyongliu@cau.edu.cn; 曹廷杰, Email: caotingjie893@163.com

第一作者联系方式: E-mail: qhwu@genetics.ac.cn

收稿日期:2017-01-14 接受日期:2017-09-10 网络出版日期:2017-10-27
基金:本研究由国家重点研发计划项目(2017YFD0101004)资助
摘要

规模化定位小麦品种携带的抗白粉病基因对于抗病性种质创新和新品种选育具有重要的意义。本研究采用Illumina Infinium iSelect 90k SNP芯片结合集群分离分析法(bulked segregate analysis, BSA)对36个河南省小麦新品系携带的抗白粉病基因进行了定位。SNP芯片检测表明, 在24个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到一个明显富集的SNP峰, 表明其可能携带单一主效抗白粉病基因; 在其他12个小麦品系构建的抗、感池DNA间可检测到多个SNP峰, 推测其可能含多个抗白粉病基因。有26个小麦品系在2AL染色体上检测到的SNP数目最多, 推测其携带位于2AL染色体上的 Pm4b抗白粉病基因。开发出与2AL染色体上抗白粉病基因紧密连锁的分子标记 Xwggc116, 可用于这些小麦品系中抗白粉病基因的分子检测。研究结果表明, 高通量SNP分析技术平台可以用来规模化定位小麦品种中的抗白粉病基因。明确了河南省抗白粉病小麦品系中携带 Pm2、 Pm4b、Pm21和新1BL/1RS易位等有限的抗白粉病基因, 抗病基因资源非常狭窄, 亟需引进新的多样化抗病基因资源, 拓宽遗传基础, 培育抗病小麦新品种。

关键词: 小麦品系; 抗白粉病基因; BSA; SNP
Large Scale Detection of Powdery Mildew Resistance Genes in Wheat via SNP and Bulked Segregate Analysis
WU Qiu-Hong1, CHEN Yong-Xing1, LI Dan2, WANG Zhen-Zhong3, ZHANG Yan2, YUAN Cheng-Guo4, WANG Xi-Cheng5, ZHAO Hong5, CAO Ting-Jie5,*, LIU Zhi-Yong1,*
1 Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Science, Beijing 100101, China
2China Agricultural University, Beijing 100193, China
3China’s Rural Technology Development Center, Beijing 100045, China;
4Gaoyi Seeds Farm, Gaoyi 051330, Hebei, China
5Wheat Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, Henan, China
Fund:This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101004)
Abstract

Large-scale detection of powdery mildew resistance genes is necessary for wheat germplasm innovation and breeding, especially via marker assisted selection. Illumina 90k iSelect SNP chip and Bulked Segregate Analysis (BSA) were applied to identify powdery mildew resistance gene in 36 wheat varieties (lines) from Henan province. SNP genotyping between 36 resistant bulks and 36 susceptible bulks revealed that single polymorphic SNP peaks were identified between 24 of the 36 bulk pairs, indicating single powdery mildew resistance gene may present in the 24 varieties (lines). Multiple polymorphic SNP peaks were found between other 12 resistant and susceptible bulks, indicating more than one powdery mildew resistance gene might be in these varieties (lines). Among the 36 bulk pairs, 26 showed the largest number of SNP enriched on chromosome 2AL, indicating the powdery mildew resistance genes, most likely on Pm4locus, were in these 26 varieties (lines). A new marker Xwggc116 was developed and proved to be effective for detecting the powdery mildew resistance gene on 2AL. Overall, the combination of BSA and high-throughput SNP genotyping platform is highly effective for large scale powdery mildew resistance gene detection in wheat germplasm. There are a limited number of powdery mildew resistance genes ( Pm2, Pm4, Pm21, and new 1BL/1RS translocation) in wheat varieties (lines) of Henan province, indicating very narrow genetic diversity of the powdery mildew resistance genes in wheat breeding program. Exploring and utilization of new diversified disease resistance genes are urgent for breeding new varieties with disease resistance.

Keyword: wheat varieties; powdery mildew resistance gene; BSA; SNP

由布氏白粉菌(Blumeria graminis f. sp. tritici)引起的小麦白粉病是一种世界性真菌性病害, 其流行对小麦安全生产构成极大威胁。国内外学者针对小麦抗病资源鉴定和抗病基因挖掘开展了大量研究。目前, 小麦中已经定位了60多个抗白粉病基因(https://shigen.nig.ac.jp/wheat/komugi/genes/symbolClassList.jsp), 分布于50多个位点上(Pm1~Pm58), 其中Pm1、Pm3、Pm4和Pm5等位点具有多个等位基因[3]。普通小麦抗病品种由于综合农艺性状较好, 其抗病基因更容易在育种和生产中得到应用[1, 2]。因此, 发掘和利用育成小麦品种(系)中的抗白粉病基因, 对于实现抗病基因多样化和培育具有持久抗性的小麦品种具有重要意义。

单核苷酸多态性(SNP), 是继限制性片段长度多态性(RFLP)和简单重复序列(SSR)之后的第3代分子标记[4]。SNP标记在基因组中数量多、分布广且可高通量检测, 使其在质量和数量性状位点(QTL)定位和全基因组关联分析(GWAS)中具有广阔的应用潜力。小麦SNP标记开发虽然起步较晚, 但近年来随着小麦表达序列标签(EST)和高通量基因组测序研究工作的开展, SNP开发和利用进展迅速, 基于Illumina技术平台的9k和90k高通量SNP芯片已应用于小麦遗传连锁图谱的构建、群体结构和连锁不平衡分析, 以及基因定位等诸多领域[5, 6]。国内还开发了Wheat660 SNP芯片, 可以对全基因组的大量位点进行遗传变异检测。用这些SNP芯片结合传统的集群分离分析(BSA)可以快速检测2个不同表现型构建的混合池间的遗传差异, 发现与目标性状关联度高的SNP变异及其所在的染色体区段。

河南省是我国小麦主产区, 每年有200多个新育成的小麦品系参加河南省预备试验和区域试验, 这些新品系遗传背景多样, 产量性状和综合农艺性状优良, 为发掘抗病新基因提供了丰富的资源。利用小麦白粉病菌菌系E09和E20接种2009— 2013年度参加河南省区域试验的小麦新品系, 鉴定出了一批抗白粉病的小麦品系[7]。本研究拟对鉴定出的36个小麦新品系进行抗性遗传分析, 探索利用BSA和高密度SNP标记结合规模化定位其抗白粉病基因, 并开发与之紧密连锁的分子标记, 为这些抗白粉病基因的利用奠定基础。

1 材料与方法
1.1 小麦品种、对照材料和白粉病菌系

供试的36份抗白粉病品系选自2009— 2013年度参加河南省预备试验和区域试验的小麦新品系[7], 分别由小麦品系参试单位提供, 以周麦31或石4185为感病亲本, 分别与36个抗病品系组配杂交组合, 获得F2代分离群体。繁菌感病对照品种为薛早。小麦白粉病菌系E09由中国农业科学院植物保护研究所周益林研究员惠赠, 表现为对Pm1、Pm3b、Pm3c、Pm3e、Pm5a、Pm17和Pm19等有毒性, 而对Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm5e、Pm12、Pm16、Pm21、Pm30等无毒性。分子标记检测对照品种为Khapli (Pm4a阳性对照)、VPM1 (Pm4b阳性对照)、洛夫林10 (Pm8阳性对照)、6VS/6VL易位系R149 (Pm21阳性对照)和中国春。

1.2 苗期白粉病抗性鉴定

利用白粉病菌系E09对36个杂交组合的F2代分离群体、抗感亲本、以及部分已知Pm基因的阳性对照品种农大399 (Pm2)、Khapli (Pm4a)、VPM1 (Pm4b)、洛夫林10 (Pm8)、6VS/6VL易位系R149 (Pm21)和中国春进行苗期抗白粉病鉴定, 将分离群体种子按组合分别播于直径10 cm鉴定盆, 每盆10粒, 并种植2粒感病对照薛早。每个组合鉴定的单株数从52至147不等。待出苗后一叶一心期将繁菌盆置鉴定盆四周, 通过自然传播和人工拂弹接种。接种后15 d, 待感病对照薛早充分发病时进行抗病性鉴定, 5 d后复查。参照吴全安[8]的寄主侵染型, 分为6种反应型(IT), 依次是0型(免疫)、0; 型(过敏性坏死)、1型(高抗)、2型(中抗)、3型(中感)和4型(高感), 其中0~2级划分为抗病, 3~4级划分为感病。分离群体抗感比例用χ 2测验进行适合性检测。

1.3 抗感池构建及基因组DNA提取

根据36个组合F2分离群体苗期抗病性鉴定结果, 从每个组合中随机选取10株抗病单株(IT 0或IT 0; )和10株感病单株(IT 4), 分别取等量叶片混合形成36个抗病池和36个感病池。使用天根DP305-3植物基因组DNA提取试剂盒提取各组合抗感池DNA, 用于SNP检测。

参照Saghai-Maroof等[9]的CTAB法, 分别提取36个抗白粉病品系、感病亲本品种、开04077/石4185和中育9398/石4185两个杂交组合F2分离群体10个抗病单株和10个感病单株的DNA, 用于验证抗白粉病基因Pm4a、Pm4b, Pm8和Pm21已报道的分子标记(表1)和新开发的分子标记。

表1 用于抗白粉病基因检测的分子标记 Table 1 Molecular markers for powdery mildew resistance genes detection
1.4 SNP标记检测及数据处理

利用Illumina 90k iSelect SNP芯片对36个杂交组合的抗、感池DNA样品进行全基因组扫描, 委托美国加州大学戴维斯分校基因组中心采用Genome Studio Polyploid Clustering Module v1.0进行样本的原始SNP分型[6]。利用Microsoft Excel 2007软件处理SNP分型数据, 根据SNP位点定位信息寻找抗、感池间SNP富集的染色体区段。

1.5 引物开发和分子标记验证

利用检测到的2AL染色体SNP标记序列, 在国际小麦基因组测序组织(IWGSC, http://www.wheat-genome.org/)网站搜索比对位于2AL染色体上的同源Contig序列, 通过BatchPrimer3 v1.0 (http://batchprimer3.bioinformatics.ucdavis.edu/)网站设计SSR引物, 开发与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记。

利用ABI 9700型GeneAmp扩增仪进行PCR。反应体系为10 µ L, 含10× buffer l µ L、MgCl2 (15 mmol L-1) l µ L、dNTP Mixture (10 mmol L-1) 0.2 µ L、引物(2 µ mol L-1) l µ L、TaqDNA聚合酶(5 U µ L-1) 0.1 µ L、基因组DNA (20 ng µ L-1) 2 µ L、去离子水4.7 µ L。扩增程序为94º C预变性5 min; 94º C变性45 s, 50~60º C (依引物而定)退火45 s, 72º C延伸1.2 min, 35个循环; 最后72º C后延伸10 min, 将PCR产物保存在4º C。用1%琼脂糖凝胶电泳检测P1/P2和AF1/AF4引物组合扩增产物, 用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Xgwm356、Xcau127和新开发标记Xwggc116的扩增产物。

2 结果与分析
2.1 抗白粉病小麦品系抗性遗传分析

36个抗白粉病供试品系对白粉病菌系E09的苗期反应型均为免疫(IT 0)或过敏性坏死(IT 0; ), 而感病亲本周麦31和石4185的苗期反应型均为高感(IT 4), 36个杂交组合F2代分离群体苗期对E09的抗感分离比例见表2。天民008/周麦31、华慧06-1/石4185等16个组合F2代分离群体的抗:感比例符合3∶ 1的分离比例, 表明这16个小麦新品系对E09菌系的抗性可能为显性单基因控制。新麦04077/石4185、郑育麦518/石4185两个组合的F2代分离群体的抗∶ 感比例为1∶ 3, 表明新麦04077和郑育麦518对E09菌系的抗性可能为隐性单基因控制。山农6020/石4185等其他18个组合F2代分离群体的抗感分离比例偏离孟德尔单基因分离比例, 推测这些品系对E09菌系的抗性可能受多个抗白粉病基因控制, 拟或是由于鉴定的群体较小, 抗感比例呈现偏分离所致。

2.2 SNP分子标记检测结果

2.2.1 抗、感池间呈现单一SNP富集的小麦品系抗白粉病基因定位 SNP芯片检测结果表明, 能在29个小麦品系构建的抗、感池间检测到2AL染色体上SNP富集, 其数目从35个(中麦61)到281个(山农6020)不等; 在24个小麦品系构建的抗、感池间检测到单一染色体臂SNP富集, 其中开04131、天宝2016、乐麦598、金麦23等20个小麦品系在2AL染色体上存在显著SNP富集(表2和图1), 推测这20个品系含有位于2AL染色体的Pm4位点抗白粉病基因, 这些具有单一染色体臂SNP显著富集的小麦品系F2代分离群体部分符合3∶ 1的显性单基因分离模式, 如04131、天宝2016、乐麦598等10个品系, 部分偏离3∶ 1的显性单基因分离模式, 如许科3210、亿麦7号、科元5号等10个品系, 可能与其F2分离群体较小或存在偏分离有关。

表2 36个小麦品种（系）F2分离群体对白粉病菌系E09的反应型和抗白粉病基因定位结果 Table 2 Reactions of 36 F2 segregating populations to Bgt isolate E09 and locations of the powdery mildew resistance genes

续表2

续表2

图1 不同小麦品系抗白粉病基因相关SNP的染色体分布
A: 开04131和天宝2016; B: 国麦301; C: 新麦04077和郑育麦518; D: 向阳3号; E: 濮科麦9号。
A: Kai 04131 and Tianbao 2016; B: Guomai 301; C: Xinmai 4077 and Zhengyumai 518; D: Xiangyang 3; E: Pukemai 9.Fig. 1 Chromosomal distributions of SNP associated with powdery mildew resistance genes in different wheat varieties

分别在国麦301、新麦04077、郑育麦518和向阳3号的6AL、2DL、1BL和3BS染色体上存在显著富集的SNP (表2和图1)。目前定位到6A染色体上的抗白粉病的基因有Pm21(6VS/6AL), 推测国麦301含有抗白粉病基因Pm21。新麦04077和郑育麦518符合1∶ 3的隐性单基因分离模式, SNP峰值分别集中于2DL和1BL染色体臂上, 向阳3号SNP峰值集中于3BS染色体臂, 这3个品系可能含有新的抗白粉病基因。

2.2.2 抗、感池间呈现多个SNP富集的小麦品系抗白粉病基因定位 在12个小麦品系抗、感池DNA间检测到多条染色体上富集的SNP。例如FS286, 在1BL上检测到SNP最多, 其次是2DL; 山农6020和许麦1号在2AL和3BS上均存在SNP富集; 兰考186和偃丰21除在2AL上检测到SNP富集外, 在3AL (兰考186)和2BL (偃丰23)上也存在SNP富集; 濮科麦9号、温麦988和洛麦05158除在2AL和1BL上检测到SNP富集外, 在5BL (濮科麦9号, 图1)、2BL (温麦988)和5AL (洛麦05158)上也存在SNP富集。在中麦61的2AL、1BL、3BS和5DS染色体上检测到SNP富集, 在华慧06-1的2AL、2BL、2DL、6AL染色体上检测到SNP富集, 天民008和宛麦999除1BL、2BL、7BL染色体上存在多态性SNP峰值外, 在3BS (天民008)和5BL (宛麦999)上也存在SNP富集。这些检测到抗感池间多个染色体SNP富集的小麦品系中, 大部分品系的F2分离群体偏离单基因遗传模式, 如FS286和兰考186等, 暗示其可能含有2个及以上的抗白粉病基因; 但部分品系的F2分离群体符合单基因遗传模式, 如濮科麦9号、中麦61、天民008和宛麦999, 遗传分析与SNP检测不一致的原因还无法确定, 需要进一步深入研究。

2.3 抗白粉病基因Pm4a、Pm4b、Pm8和Pm21的分子标记检测

利用已报道与抗白粉病基因Pm4a、Pm4b、Pm8和Pm21紧密连锁的分子标记对36个抗白粉病小麦品系进行检测, 以验证这些品系中含有的抗白粉病基因和SNP定位的可靠性。利用与Pm4a紧密连锁的分子标记Xgwm356对36个品系的检测结果表明,除阳性对照Khapli (Pm4a)扩增出Pm4a的特异条带外, 供试的36个品系均未能够扩增出Pm4a的特异条带(图未列出), 说明这些品系可能不含有Pm4a基因。利用与Pm4b连锁的分子标记P1/P2对36个品系进行检测, 结果都能扩增出Pm4b的特异性条带(图2), 说明Pm4b的载体品种(VPM及其后裔品系)曾经在河南省小麦育种中广泛使用。由于SNP检测结果表明多个品系可能含有位于2AL的抗白粉病基因和其他染色体上的抗白粉病基因, Xgwm356和P1/P2这2个分子标记显然不能有效地用于检测这36个小麦品系中的Pm4a或Pm4b基因, 这首先是由于Xgwm356和P1/P2这2个分子标记都不是与目的基因共分离的功能标记, 其次是河南省这些小麦新品系经历了多次的杂交和育种选择过程, 尽管Pm4b载体品种遗传背景在这些品系中得以保留, 但部分品系中可能已经不含有Pm4b基因, 还需要开发新的分子标记用于这些品系中抗白粉病基因的追踪和检测。

图2 抗白粉病基因Pm4b分子标记P1/P2在36个小麦品系上的扩增结果
M: 1 kb DNA ladder marker; C1: Khapli (Pm4a); C2: Vpm1 (Pm4b); C3: 石4185; 1: 天民008; 2: 宛麦999; 3: 国麦301; 4: 乐麦598; 5: 中麦61; 6: 新麦04077; 7: 濮科麦9号; 8: 金麦23; 9: 丰德存麦10号; 10: 陕农33; 11: 金麦18; 12: 偃科04-15; 13: 中育9398; 14: 天宝2016; 15: 正农616; 16: 开04131; 17: 华慧06-1; 18: 郑育麦518; 19: 许科3210; 20: 山农6020; 21: 亿麦7号; 22: 科元5号; 23: 天禾10号; 24: 温麦988; 25: 春丰0017; 26: 中植0316; 27: 许麦1号; 28: 向阳3号; 29: 洛麦05158; 30: 丰舞988; 31: 偃丰23; 32: FS286; 33: 金麦20; 34: 兰考186; 35: 理生828; 36: 天禾7号。Fig. 2 PCR amplification pattern of markerP1/P2 linked to powdery mildew gene Pm4b in 36 wheat lines
M: 1 kb DNA ladder marker; C1: Khapli (Pm4a); C2: Vpm1 (Pm4b); C3: Shi 4185; 1: Tianmin 008; 2: Wanmai 999; 3: Guomai 301; 4: Lemai 598; 5: Zhongmai 61; 6: Xinmai 04077; 7: Pukemai 9; 8: Jinmai 23; 9: Fengdecunmai 10; 10: Shaannong 33; 11: Jinmai 18; 12: Yanke 04-15; 13: Zhongyu 9398; 14: Tianbao 2016; 15: Zhegnnong 616; 16: Kai 04131; 17: Huahui 06-1; 18: Zhengyumai 518; 19: Xuke 3210; 20: Shannong 6020; 21: Yimai 7; 22: Keyuan 5; 23: Tianhe 10; 24: Wenmai 988; 25: Chunfeng 0017; 26: Zhongzhi 0316; 27: Xumai 1; 28: Xiangyang 3; 29: Luomai 05158; 30: Fengwu 98; 31:Yanfeng 23; 32: FS 286; 33: Jinmai 20; 34: Lankao 186; 35: Lisheng 828; 36: Tianhe 7.

利用1RS特异分子标记AF1/AF4对36个小麦品系进行检测表明, 天民008、中麦61、濮科麦9号、金麦23、丰德存麦10号等21个抗病品系均扩增出了1条1.5 kb的特异DNA片段(图3), 表明这些品系中含有1BL/1RS易位染色体。综合抗病性遗传分析和SNP检测结果, 可发现金麦23、丰德存麦10号、偃科04-15、天宝2016等14个品系虽然检测到含有1BL/1RS, 但在1BL染色体臂上未能检测到SNP富集, 推测其携带的1BL/1RS是已经丧失对白粉病菌系E09抗性的Pm8基因; 而天民008、中麦61、濮科麦9号、郑育麦518、温麦988、洛麦05158和FS286这7个品系含有1BL/1RS, 但在1BL染色体臂上存在SNP富集, 推测其可能含有不同于原Pm8的新1BL/1RS染色体易位。而宛麦999虽然在1BL上有SNP富集, 但不含1BL/1RS, 可能含有其他未知抗白粉病基因。

图3 1RS染色体特异SCAR标记AF1/AF4在36个小麦品系上的扩增结果
M: D2000 DNA marker; 1: 洛夫林10号 (Pm8); 2: 中国春; 3: 天民008; 4: 宛麦999; 5: 国麦301; 6: 乐麦598; 7: 中麦61; 8: 新麦04077; 9: 濮科麦9号; 10: 金麦23; 11: 丰德存麦10号; 12: 陕农33; 13: 金麦18; 14: 偃科04-15; 15: 中育9398; 16: 天宝2016; 17: 正农616; 18: 开04131; 19: 华慧06-1; 20: 郑育麦518; 21: 许科3210; 22: 山农6020; 23: 亿麦7号; 24: 科元5号; 25: 天禾10号; 26: 温麦988; 27: 春丰0017; 28: 中植0316; 29: 许麦1号; 30: 向阳3号; 31: 洛麦05158; 32: 丰舞988; 33: 偃丰23; 34: FS286; 35: 金麦20; 36: 兰考186; 37: 理生828; 38: 天禾7号。Fig. 3 PCR amplification pattern of 1RS specific SCAR markerAF1/AF4 in 36 wheat lines
M: D2000 marker; 1: Lovrin 10 (Pm8); 2: Chinese Spring; 3: Tianmin 008; 4: Wanmai 999; 5: Guomai 301; 6: Lemai 598; 7: Zhongmai 61;
8: Xinmai 04077; 9: Pukemai 9; 10: Jinmai 23; 11: Fengdecunmai 10; 12: Shaannong 33; 13: Jinmai 18; 14: Yanke 04-15; 15: Zhongyu 9398;
16: Tianbao 2016; 17: Zhegnnong 616; 18: Kai 04131; 19: Huahui 06-1; 20: Zhengyumai 518; 21: Xuke 3210; 22: Shannong 6020; 23: Yimai
7; 24: Keyuan 5; 25: Tianhe 10; 26: Wenmai 988; 27: Chunfeng 0017; 28: Zhongzhi 0316; 29: Xumai 1; 30: Xiangyang 3; 31: Luomai 05158; 32: Fengwu 98; 33: Yanfeng 23; 34: FS286; 35: Jinmai 20; 36: Lankao 186; 37: Lisheng 828; 38: Tianhe 7.

利用与Pm21基因连锁的EST-SSR标记Xcau127[13] 检测36个小麦品系, 除R149(6VS/6AL)和国麦301中扩增出6VS的特异DNA条带外(图4), 在中国春和其他35个品系中均未扩增出该特异条带, 表明小麦新品种国麦301携带Pm21基因, 与90k SNP芯片检测结果相一致。

图4 Pm21分子标记Xcau127在36个小麦品系上的检测结果
M: D2000 DNA marker; 1: R149 (6VS/6VL); 2: 中国春; 3: 天民008; 4: 宛麦999; 5: 国麦301; 6: 乐麦598; 7: 中麦61; 8: 新麦04077; 9: 濮科麦9号; 10: 金麦23; 11: 丰德存麦10号; 12: 陕农33; 13: 金麦18; 14: 偃科04-15; 15: 中育9398; 16: 天宝2016; 17: 正农616; 18: 开04131; 19: 华慧06-1; 20: 郑育麦518; 21: 许科3210; 22: 山农6020; 23: 亿麦7号; 24: 科元5号; 25: 天禾10号; 26: 温麦988; 27: 春丰0017; 28: 中植0316; 29: 许麦1号; 30: 向阳3号; 31: 洛麦05158; 32: 丰舞988; 33: 偃丰23; 34: FS286; 35: 金麦20; 36: 兰考186; 37: 理生828; 38: 天禾7号。Fig. 4 PCR amplification pattern of marker Xcau127 in detecting of Pm21in 36 wheat lines
M: D2000 marker; 1: R149 (6VS/6VL); 2: Chinese Spring; 3: Tianmin 008; 4: Wanmai 999; 5: Guomai 301; 6: Lemai 598; 7: Zhongmai 61;
8: Xinmai 04077; 9: Pukemai 9; 10: Jinmai 23; 11: Fengdecunmai 10; 12: Shaannong 33; 13: Jinmai 18; 14: Yanke 04-15; 15: Zhongyu 9398;
16: Tianbao 2016; 17: Zhegnnong 616; 18: Kai 04131; 19: Huahui 06-1; 20: Zhengyumai 518; 21: Xuke 3210; 22: Shannong 6020; 23: Yimai
7; 24: Keyuan 5; 25: Tianhe 10; 26: Wenmai 988; 27: Chunfeng 0017; 28: Zhongzhi 0316; 29: Xumai 1; 30: Xiangyang 3; 31: Luomai 05158; 32: Fengwu 98; 33: Yanfeng 23; 34: FS286; 35: Jinmai 20; 36: Lankao 186; 37: Lisheng 828; 38: Tianhe 7.

2.4 2AL染色体抗白粉病基因分子标记开发

由于多个抗白粉病品系在2AL染色体上存在显著的SNP富集, 而用于检测Pm4a和Pm4b基因的分子标记Xgwm356和P1/P2又不能有效地用于这些品系中抗白粉病基因的检测, 非常有必要开发一个新的能有效检测这些抗白粉病小麦品系中位于2AL染色体上抗白粉病基因的分子标记。根据90k SNP芯片检测结果, 选用抗感池间2AL染色体上富集的SNP比对IWGSC网站发布的小麦contig序列, 开发了一个与2AL染色体上抗白粉病基因连锁的显性分子标记Xwggc116 (表1), 用开04131/石4185和中育9398/石4185两个F2群体的DNA样品(分别包括抗感亲本、10个抗病和10个感病单株), 证实了标记Xwggc116在2个群体的抗病单株与抗病亲本上都可扩增出350 bp DNA条带, 而在感病单株与感病亲本中均未能扩增出该特异DNA条带(图5)。同时利用该标记对36个小麦品系检测发现, 除国麦301和中麦61之外, 均能扩增出350 bp的特异条带(图6)。

图5 标记Xwggc116在开04131/石4185和中育9398/石4185的F2群体上的扩增结果
A: M: 100 bp DNA marker; 1: 开04131; 2: 石4185; 3~12: 抗病单株; 13~22: 感病单株。Fig. 5 Amplification pattern of Xwggc116on Kai 04131/Shi 4185 and Zhongyu 9398/Shi 4185 F2 segregation population
B: M: 100 bp DNA marker; 1: 中育9398; 2: 石4185; 3~12: 抗病单株; 13~22: 感病单株。
A: M: 100 bp DNA marker; 1: Kai 04131; 2: Shi 4185; 3-12: resistant plants; 13-22: susceptible plants.
B: M: 100 bp DNA marker; 1: Zhongyu 9398; 2: Shi 4185; 3-12: resistant plants; 13-22: susceptible plants.

图6 标记Xwggc116在36个小麦抗病品系上的扩增结果
M: 100 bp DNA marker; 1: Khapli (Pm4a); 2: VPM1 (Pm4b); 3: 石4185; 4: 天民008; 5: 宛麦999; 6: 国麦301; 7: 乐麦598; 8: 中麦61; 9: 新麦04077; 10: 濮科麦9号; 11: 金麦23; 12: 丰德存麦10号; 13: 陕农33; 14: 金麦18; 15: 偃科04-15; 16: 中育9398; 17: 天宝2016; 18: 正农616; 19: 开04131; 20: 华慧06-1; 21: 郑育麦518; 22: 许科3210; 23: 山农6020; 24: 亿麦7号; 25: 科元5号; 26: 天禾10号; 27: 温麦988; 28: 春丰0017; 29: 中植0316; 30: 许麦1号; 31: 向阳3号; 32: 洛麦05158; 33: 丰舞988; 34: 偃丰23;
35: FS286; 36: 金麦20; 37: 兰考186; 38: 理生828; 39: 天禾7号。Fig. 6 PCR amplification pattern of markerXwggc116in 36 wheat lines
M: 100 bp DNA marker; 1: Khapli (Pm4a); 2: VPM1 (Pm4b); 3: Shi 4185; 4: Tianmin 008; 5: Wanmai 999; 6: Guomai 301; 7: Lemai 598;
8: Zhongmai 61; 9: Xinmai 04077; 10: Pukemai 9; 11: Jinmai 23; 12: Fengdecunmai 10; 13: Shaannong 33; 14: Jinmai 18; 15: Yanke 04-15;
16: Zhongyu 9398; 17: Tianbao 2016; 18: Zhegnnong 616; 19: Kai 04131; 20: Huahui 06-1; 21: Zhengyumai 518; 22: Xuke 3210; 23: Shannong 6020; 24: Yimai 7; 25: Keyuan 5; 26: Tianhe 10; 27: Wenmai 988; 28: Chunfeng 0017; 29: Zhongzhi 0316; 30: Xumai 1; 31: Xiangyang
3; 32: Luomai 05158; 33: Fengwu 98; 34: Yanfeng 23; 35: FS286; 36: Jinmai 20; 37: Lankao 186; 38: Lisheng 828; 39: Tianhe 7.

3 讨论
3.1 规模化定位小麦抗病基因方法

普通小麦中蕴含着丰富的抗白粉病资源, 发掘和利用这些资源中的抗病基因具有重要意义。BSA分析法首次由Michelmore等[14]提出并成功地在莴苣中筛选出与目的抗病基因连锁的分子标记以来, 在植物基因定位上得到广泛的应用。与BSA相结合用于基因定位的分子标记有多种(如RAPD、AFLP、SSR等), 虽然常用的SSR标记具有可靠性高、稳定性强、重复性好等优点, 但具体对某一个品种的目标基因进行标记定位依然费工费时, 在构建分离群体的基础上往往需要筛选大量的引物, 通常也只能对少数几个材料操作, 一个研究生或工作人员一般同期只可对2~3个材料或基因定位, 难以同时对大量的材料或目标基因进行规模化定位筛选。此外,利用BSA筛选引物时经常利用与已知目的基因连锁的分子标记进行检测, 但有时会因不同杂交组合遗传背景差异而导致某个已知的分子标记在另一个遗传群体中检测不到多态性。SNP标记作为第3代分子标记具有数量多、密度高、遗传稳定性高和易于实现自动化检测等诸多优点, 目前正迅速取代RFLP和SSR等传统标记, 广泛应用于动植物遗传连锁图谱构建、基因定位和生物多样性等研究领域[15]。以前并未见基于BSA和SNP芯片进行规模化小麦基因定位的报道, 本研究明确了抗白粉病品系中位于2AL (可能是Pm4b位点)染色体上的、新的1BL/1RS, 以及Pm21等抗白粉病基因, 表明SNP标记结合BSA法可以规模化有效检测小麦品系中的抗白粉病基因。

由于时间所限, 本研究用于BSA分析的DNA样品取自F2代分离群体, 这些单株的抗病性没有进行F3代家系的鉴定, 抗病分离群体的分离比率也可能存在一定的误差, 但BSA和SNP分析的结果可以快速确定某品系可能含有的抗白粉病基因及其所在的染色体区段, 为后续的进一步分析提供了重要的信息。这是一种基于BSA的SNP标记规模化定位抗白粉病基因和快速鉴定抗白粉病小麦品系中携带的未知抗白粉病基因的方法, 具有遗传多态性高, 技术简单、快速, 易于实现规模化和自动化分析, 并可以在筛选出富集SNP的基础上开发与目标基因位点连锁的特异性PCR标记, 用于这些品系分子标记辅助选择育种。同时, 该策略还可应用于其他的质量性状, 甚至数量性状主效QTL快速定位, 在小麦分子标记定位方面具有广泛的应用潜力。

3.2 36个小麦新品系的抗白粉病基因

自Sears和Briggl [16]将抗白粉病基因 Pm1定位在7AL染色体上以来, 迄今已在小麦基因组50多个位点上(Pm1~Pm58)发掘出正式命名的60多个主效抗白粉病基因[3], 但这些抗病基因主要来源于小麦的近缘种属, 绝大多数抗白粉病基因由于与不良性状紧密连锁, 未能在育种中得到广泛利用。本研究结果表明, 近年河南省新育成的小麦品系中抗白粉病品系较少, 且抗病基因遗传多样性较低。在检测的36个品系中, 18个品系的F2代抗病性呈单基因遗传模式, 只含有1个抗白粉病基因, 抗性非常脆弱; 含有多个抗白粉病基因的品系较少。这36个小麦新品系中含有的抗白粉病基因主要有以下几种类型。首先是位于小麦1BL/1RS染色体上的Pm8基因及部分新的1BL/1RS染色体易位。较早引入我国的1BL/IRS易位系以洛夫林10号和高加索等为代表, 携带抗白粉病基因Pm8[17]。20世纪90年代在我国北部冬麦区和黄淮冬麦区育成的携带1BL/1RS易位的小麦品种, 曾在我国小麦生产上发挥了重要的作用[18]。尽管该类来源1BL/IRS上携带的Pm8基因早已丧失白粉病抗性, 但大量含有该1BL/1RS染色体易位的品种仍然在生产和育种中使用[19]。本研究表明, 有21个小麦品系含有1BL/1RS易位, 占检测品系的58.3%, 说明1BL/1RS易位在河南省小麦育成新品系中存在的比例仍较高。同时通过SNP标记检测发现, 这21个携带1BL/1RS易位的品系中, 有7个品系在1BL染色体上检测到抗、感池间富集的SNP, 推测其可能携带不同于原有Pm8基因的新1BL/1RS染色体易位, 但还需要进一步研究确认; 而其他14个品系在1BL染色体上未检测到抗、感池间富集的SNP, 可能含有已经丧失抗性的Pm8基因。同时还发现宛麦999在1BL染色体上存在抗、感池间富集的SNP, 但未能检测到1BL/1RS染色体易位的存在, 推测宛麦999可能含有新的抗白粉病基因。其次是位于2AL染色体上的抗白粉病基因。目前定位到的有Pm4a[20]、Pm4b[20]、Pm4c[21]、Pm4d[22]、PmPS5A[23]、PmX[24]、PmLk906[25]、PmHNK54[26]等, 均位于2AL染色体臂末端区域。其中, Pm4a和Pm4b基因应用于抗病育种始于20世纪90年代, 在我国的多个麦区有广泛的应用。虽然Pm4a和Pm4b在部分麦区抗性已经减弱或失去抗性[27, 28], 但目前Pm4a和Pm4b对白粉病菌E09小种仍然具有抗性, 在一些地区可作为有效的抗白粉病基因在育种上利用[29, 30]。曹廷杰等[7]利用与Pm4a紧密连锁的分子标记Xgwm356对河南省近年来新育成的908个小麦新品系检测, 仅2个品系含有Pm4a。本研究基于BSA法利用高密度SNP标记对36个小麦品系进行检测, 均能在2AL染色体臂上检测到SNP, 在29个品系2AL染色体上可检测到抗、感池间SNP的富集, 其中20个品系只在2AL染色体上存在SNP富集, 且这些富集的SNP在整合SNP和SSR的遗传图谱上位于与Pm4a和Pm4b相同的染色体区段。系谱分析表明, Pm4a和Pm4b基因资源曾经在河南省小麦育种中有较为广泛的利用, 而其他位于2AL染色体上的抗白粉病基因利用的频率较低。利用与Pm4a和Pm4b紧密连锁的分子标记Xgwm356和P1/P2对36个小麦品系检测, 均未扩增出含Pm4a的特异性条带, 但全部扩增出Pm4b的特异条带。推测本研究中这些抗品系位于2AL染色体上的抗白粉病基因很可能是位于Pm4位点上的等位基因Pm4b。

利用本研究中新开发的与2AL染色体上抗白粉病基因连锁的分子标记Xwggc116在开04131/石4185和中育9398/石4185两个F2分离群体上证实了2AL染色体上抗白粉病基因的存在和该标记的有效性。利用该标记对36个品系检测, 发现除国麦301和中麦61外, 均能扩增出特异目标条带, 说明国麦301和中麦61不含有Pm4b基因。相较于检测Pm4b的分子标记P1/P2, Xwggc116可更有效地在河南小麦品系遗传背景下检测抗白粉病基因Pm4b。但由于本研究检测的品系还较少, 该标记的应用潜力还需要在更多品系中验证。

来源于小麦-簇毛麦6AL/6VS染色体易位的抗白粉病基因Pm21是目前抗性强和抗谱广的抗白粉病基因之一[31, 32], 在全国多个育种单位得到应用, 并在河北、河南和西南麦区有部分携带该基因的品种开始审定推广[30, 33, 34]。曹廷杰等[7]利用与Pm21紧密连锁的分子标记Xcau127对河南省908个小麦新品系检测发现, 仅国麦301和石郑816两个小麦品系含有Pm21。本研究的BSA和SNP分析在国麦301的F2分离群体抗、感池间检测到6AL染色体上富集的SNP, 进一步用分子标记Xcau127检测, 证实国麦301中含有抗白粉病基因Pm21。Pm21基因白粉病抗性突出, 携带该基因的国麦301和石郑816的育成表明其综合农艺性状和产量水平已经达到了黄淮麦区主流品种的水平, 预期会大量用于配制新的杂交组合, 不远的未来将有更多携带Pm21基因的品种通过审定并推广应用。

此外, 本研究还发现部分品系在2BL、2DL、3AL、3BS、5BL、7BL染色体上存在抗、感池差异富集的SNP, 推测其可能含有未知的抗病基因, 需开展进一步遗传分析和分子标记验证, 以明确这些品系所携带的抗白粉病基因。

上述研究结果表明, 河南省近年育成的小麦品系中抗白粉病基因以新的1BL/1RS易位或位于2AL染色体上的Pm4b为主, 部分品系含有其他抗白粉病基因, 抗病基因资源比较狭窄。针对目前小麦白粉病原菌毒性变异和病原菌群体对Pm4a或Pm4b基因毒性频率上升的趋势, 亟需在小麦育种中加快利用仍然有效的抗白粉病基因, 并引进新的多样化抗性基因资源, 拓宽抗白粉病基因的遗传基础, 为在我国小麦主产区有效控制小麦白粉病的发生与流行奠定基础。

4 结论

明确了36个河南省小麦新品系抗白粉病的遗传规律, 并利用BSA策略结合高密度SNP标记规模化对其携带的抗白粉病基因进行了定位, 开发了可有效检测2AL染色体上抗白粉病基因Pm4b的新的分子标记Xwggc116, 为小麦抗白粉病基因资源有效利用和分子标记辅助选择奠定了基础。

作者已声明无竞争性利益关系。The authors have declared that no competing interests exist.

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