沧6005为半冬性小麦品种, 晚熟, 耐热性较强, 由河北省沧州市农业科学院提供。精选的种子经表面消毒, 再用自来水反复冲洗, 浸泡吸胀12 h后, 播至Hoagland营养液中, 置25° C培养箱中培养。待二叶一心时进行不同处理, 取样进行表达分析。另于2015年10月上旬播种于河北省农林科学院大河试验站, 常规种植, 不同生育期取样并于液氮中速冻, 用于组织器官表达分析。

参照李慧聪等^[23]描述的方法进行热胁迫处理, 方法略有改进。将小麦幼苗培养在Hoagland营养液中, 将生长一致的幼苗分为7组进行不同处理, 以25° C正常生长的幼苗作对照。第1组热胁迫处理, 营养液于37° C培养箱预热, 第2组在培养液中加入水杨酸(0.8 mmol L^-1), 第3组在培养液中加入H₂O₂ (10 mmol L^-1), 处理时间为0.5、1、1.5、2和4 h; 第4组先用0.8 mmol L^-1水杨酸预处理1.5 h, 再移至与第2组成分相同培养液中, 37° C热处理1.5 h; 第5组先用10 mmol L^-1 H₂O₂预处理1.5 h, 然后移入与第3组成分相同营养液中, 37° C热处理1.5 h; 第6组经150 µ mol L^-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L^-1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)预处理2 h; 第7组经150 µ mol L^-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L^-1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)预处理2 h后, 于37° C培养箱中热激处理1 h; 第8组经150 µ mol L^-1二苯基碘(diphenylene iodonium, DPI)和20 mmol L^-1二甲基硫脲(dimethylthiourea, DMTU)预处理2 h后, 用0.8 mmol L^-1水杨酸处理1.5 h。DPI为H₂O₂合成抑制剂, DMTU为羟自由基清除剂。所有处理均取第2展开叶, 液氮速冻, 用于RNA提取。

采用RNArose Reagent Systems试剂盒(上海华舜生物工程公司)提取总RNA, 经DNase I (TaKaRa)处理除去残留的基因组DNA, 然后取1 μ g RNA, 用SuperScript IV First-Strand Synthesis System反转录试剂盒(Invitrogen)合成cDNA第一链。设计特异引物(F: 5′ -ATCGGGAAGCTACTACGGGGTTC-3′ ; R: 5′ -GCTTCTACAACATCGTCCAC-3′ ), 利用高保真酶Pyrobest (TaKaRa)进行PCR扩增。PCR体系25 µ L, 含10× Pyrobest buffer 2.5 µ L、dNTP mixture (2.5 mmol L^-1) 2 µ L、1st strand cDNA 2 µ L、20 µ mol L^-1 forward primer 0.25 µ L、20 µ mol L^-1 reverse primer 0.25 µ L、pyrobest DNA polymerase 0.25 µ L和ddH₂O 17.75 µ L。反应程序为98° C 10 s, 55° C 15 s, 72° C 2 min, 30个循环。将扩增产物连接T载体(pEasy-Blunt Simple Cloning Kit, TransGen Biotech)后, 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

依据Xue等^[5]对小麦Hsfs的分析结果, 设计TaHsfB2d的特异引物(F: 5′ -CGTCTCCATCGGGCT GAA-3′ ; R: 5° -CGTCGCCGTCTTCTTCCTC-3′ ), 内参基因为TaRP15 (F: 5° -GCACACGTGCTTTGCAGA TAAG-3° ; R: 5° -GCCCTCAAGCTCAACCATAACT- 3° )。PCR体系20 µ L, 含SYBR Premix Ex Taq II 10 µ L、10 µ mol L^-1 Forward primer 0.8 µ L、10 µ mol L^-1 Reverse primer 0.8 µ L、1st strand cDNA 1 µ L和ddH₂O 7.4 µ L。反应在7500 Real-time PCR System (Applied Biosystems, USA)上进行PCR, 反应程序为预变性95° C 10 min; 变性 95° C 5 s; 退火/延伸60° C 1 min, 45个循环。反应结束后, 采用2^{-Δ Δ Ct}法分析数据。每组实验设3个生物学样本, 每个生物学样本设3次技术重复。数据为3个生物学重复平均值± 标准误, 组织表达试验以幼根表达量为1, 其余设置0 min的表达量为1。

带有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pJIT163-hGFP (由中国科学院遗传与发育生物学研究所范仁春博士提供)通过35S启动子驱动目的基因和GFP基因的融合表达^[24], 显示目的蛋白的亚细胞定位。通过设计特异引物(F: 5′ -GAGAACACGGGGG ACTCTAGAATGTCGGCCGAGCAT-3′ ; R: 5′ -GCCC TTGCTCACCATGGATCCCCTCGAGTTGGATCT-3′ ), 扩增TaHsfB2d编码区, 产物经限制性内切酶Hind III和BamH I消化后, 连接到表达载体pJIT163- hGFP上。参照李慧聪等^[25]描述的方法进行金粉包埋和基因枪转化。经瞬时表达处理的洋葱表皮细胞于22° C暗培养16 h, 然后放入浓度为10 µ g mL^-1的4’ , 6-二脒基-2-苯基吲哚(4’ , 6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)染色液中染色3~5 min, 用生理盐水冲洗干净, 于激光共聚焦显微镜(Zeiss META510)下观察荧光。

酵母表达载体pYES2 (Invitrogen, 美国)用于酿酒酵母中目的蛋白的表达, 其特点在于GAL1启动子能够在酿酒酵母中被半乳糖高水平诱导从而驱动目的蛋白表达, 同时能够被葡萄糖抑制表达, 可利用URA3基因筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子。结合ClonExpress II重组反应系统(诺唯赞生物科技有限公司)设计扩增TaHsfB2d特异引物(F: 5° -GGGAATATTAAGCTTGGTACCATGGCGGCCG

AGCATGGC-3° ; R: 5° -TGATGGATATCTGCAGAATT CTCAACCTCGAGTTGGATCT-3° ), 利用高保真PCR聚合酶扩增, 获得TaHsfB2d的PCR产物。利用限制性内切酶Kpn I和EcoR I (NEB公司)对载体pYES2进行酶切, 电泳后回收得到线性化载体。将PCR产物与线性化载体按1∶ 2的摩尔比混合, 利用ClonExpress II快速克隆技术进行重组反应。于冰水浴中配制如下反应体系, 即4 µ L 5× ClonExpress II buffer, 50~200 ng线性化载体, 20~200 ng插入片段扩增产物, 2 µ L Exnase II, 加无菌水至总体积2 µ L。混匀各组分后, 于37° C反应30 min, 之后立即置冰浴中冷却5 min, 然后利用热激法将反应产物直接转化大肠杆菌TOP10感受态细胞, 37° C倒置培养过夜。用无菌的牙签将单个菌落挑至100 µ L新鲜的LB培养基中, 混匀, 取2 µ L作为模板进行PCR扩增, 根据电泳条带大小选择正确的克隆进行序列测定。

参照Gietz等^[26]的方法, 将测序正确的重组载体转化酵母INVSc1感受态细胞, 然后将细胞均匀涂抹在SC-Glu-Ura^-筛选平板上, 30° C培养2~3 d。采用菌落PCR方法鉴定阳性克隆。

分别以重组载体pYES2-TaHsfB2d和空载体pYES2转化酵母细胞INVSc1, 筛选阳性酵母克隆。分别挑选2个菌系的阳性克隆, 在SC-Glu-Ura^-液体培养基振荡(250 r min^-1)培养过夜, 检测OD₆₀₀值。用SC-Glu-Ura^-液体培养基将酵母菌液稀释到OD₆₀₀值为0.2, 重新振荡(200 r min^-1)培养2~3 h, OD₆₀₀值达到0.4~0.8之间即酵母指数生长期, 离心收集菌体, 无菌水洗涤两遍, 除去培养基, 然后梯度稀释到0.1、0.05和0.01共3个OD值, 分成2组, 一组作为对照, 另一组于50° C水浴中热激处理15 min。吸取8 μ L, 分别点在加入半乳糖的SC-Gal-Ura^-固体培养基上, 30° C生长2~3 d, 观察并拍照。另外, 将指数生长期的酵母细胞稀释到SC-Gal-Ura^-液体培养基中, 分成2组, 一组作为对照, 另一组于50° C水浴中热激处理45 min, 振荡(200 r min^-1)培养24 h, 期间每间隔3 h测定一次OD₆₀₀值, 计算生长速率。采用Microsoft Excel软件分析数据, 计算标准误差。采用SPSS 19.0统计方法分析差异显著性。

将二叶一心小麦幼苗于37° C热胁迫处理1.5 h, 提取叶片总RNA, 以此为模板, 利用特异性引物, 扩增获得TaHsfB2d基因的cDNA序列(图1), 序列全长1191 bp, 编码396个氨基酸残基。通过结构分析发现, TaHsfB2d蛋白序列包含DNA结合结构域(DNA binding domain, DBD, NCBI网站分析, 下画线部分)和核定位信号序列KRAR (nuclear localization signal, NLS, NucPred软件分析)序列。蛋白相似性分析表明, TaHsfB2d蛋白与大麦未知蛋白(序列号为BAJ85352.1)、大麦HvHsfB2c (序列号为AEB 26596.1)和二穗短柄草BdHsfB2c (序列号为XP_ 003578478.1)的相似性分别为92%、85%和80% (图2)。

图1

Fig. 1

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	图1 小麦TaHsfB2d的核苷酸和氨基酸序列 下画线表示Hsf家族保守的DNA结合结构域; 灰色区域显示核定位信号序列(NLS)。Fig. 1 Nucleotide and amino acid sequences of TaHsfB2dfrom wheat The conserved DNA binding domain of Hsf family is underlined, and the nuclear localization signal (NLS, KRAR) is in grey background.

qRT-PCR分析发现, 在检测的小麦幼苗期根、茎和叶片, 开花期根、茎、叶片、雌雄蕊和萼片, 以及生育后期幼嫩和成熟种子中, TaHsfB2d均有不同程度表达, 与幼嫩根系中表达相比, 成熟根系中表达量最高, 为幼根的33倍; 幼茎和萼片中次之, 数值约达到18倍和15倍; 接近于幼嫩根系, 幼叶和雌蕊中TaHsfB2d的表达量较低(图3)。

分别提取不同逆境胁迫下小麦幼苗叶片的总RNA, 定量分析TaHsfB2d表达量的变化表明, 37° C热处理(图4-A)、0.8 mmol L^-1水杨酸(图4-B)和10 mmol L^-1 H₂O₂(图4-C)单独处理均能不同程度上调TaHsfB2d表达, 处理1.5 h时达到峰值, 最大表达量分别为正常对照的34、8和61倍, 热胁迫和H₂O₂处理诱导作用强于水杨酸处理, 处理4 h时, TaHsfB2d仍能保持较高的表达水平。

用水杨酸和H₂O₂预处理1.5 h后再于37° C热激(图4-D)发现, 热激能显著增强SA和H₂O₂对TaHsfB2d表达的诱导作用, 表达量约分别达到单独SA和H₂O₂处理时的19.5倍和3.0倍, 该数值显著高于单独热胁迫处理。

图2

Fig. 2

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	图2 小麦TaHsfB2d编码蛋白与其他蛋白的相似性比较 NCBI同类蛋白包括大麦未知蛋白Hv predicted protein (BAJ85352.1)、大麦HvHsfB2c (AEB26596.1)和二穗短柄草BdHsfB2c (XP_003578478.1)。Fig. 2 Alignment of the putative amino acid encoded byTaHsfB2d and proteins from other species Proteins for alignment in NCBI were Hv predicted protein (BAJ85352.1), HvHsfB2c (AEB26596.1), and BdHsfB2c (XP_003578478.1).

用150 µ mol L^-1H₂O₂合成抑制剂DPI和20 mmol L^-1羟自由基清除剂DMTU联合处理2 h (图4-E), TaHsfB2d表达与正常对照差异不明显, 二者预处理后再热激1 h时, TaHsfB2d的表达显著低于单独热处理, 热激上调TaHsfB2d表达被显著抑制; 如果预处理后再用SA处理1.5 h, TaHsfB2d上调表达完全被抑制。

构建瞬时表达载体pJIT163-TaHsfB2d-hGFP并转化洋葱内表皮, 通过融合基因表达显示目的蛋白的亚细胞定位。利用激光共聚焦显微镜观察荧光发现, 正常条件下, 观察到GFP绿色荧光只分布在细胞核, 且与核特异染料DAPI荧光完全重合(图5), 表明TaHsfB2d蛋白定位于细胞核。

图3

Fig. 3

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	图3 TaHsfB2d在小麦不同组织器官中的定量表达 数据为3个生物学重复平均值± 标准误。Fig. 3 Relative expression levels of TaHsfB2d in different tissues and organs of wheat Each bar value represents ± SD of triplicate experiments.

图4

Fig. 4

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图4 37° C热胁迫, 0.8 mmol L-1 SA和10 mmol L-1 H2O2分别处理和联合处理对小麦叶片TaHsfB2d表达量的影响 A: 单独37° C热处理; B: 单独0.8 mmol L-1SA处理; C: 单独10 mmol L-1H2O2处理; D: SA和H2O2分别预处理1.5 h后再于37° C热激处理; E: H2O2合成抑制剂DPI和清除剂DMTU预处理2 h后, 再分别于37° C热激1 h和SA处理1.5 h。数据为3个生物学重复平均值± 标准差。Fig. 4 Changes of TaHsfB2drelative expression levels in leaves of wheat seedlings subjected to heat stress at 37° C, 0.8 mmol L-1 SA and 10 mmol L-1 H2O2 respectively and combined treatments for appropriate times A: HS at 37° C; B: 0.8 mmol L-1 SA treatment; C: 10 mmol L-1 H2O2 treatment; D: HS at 37° C after pretreatment with SA and H2O2 for 1.5 h, respectively; E: Treatments under 37 ° C heat shock for 1 h and 0.8 mmol L-1 SA for 1.5 h, respectively, after pretreated with DPI and DMTU for 2 h. Each bar value represents mean± SD of triplicate experiments.

图5

Fig. 5

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图5 小麦TaHsfB2d蛋白在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位 A: 明视野下35S:TaHsfB2d-hGFP荧光; B: 35S:TaHsfB2d-hGFP绿色荧光; C: 35S:TaHsfB2d-hGFP的DAPI红色荧光; D: 叠加图像。Fig. 5 Subcellular localization of TaHsfB2d in onion epidermis cells under normal conditions A: epidermal cells of onion expressing 35S:TaHsfB2d-hGFP under white light; B: epidermal cells of onion expressing 35S: TaHsfB2d-hGFP under green channel florescence; C: epidermal cells of onion expressing 35S: TaHsfB2d-hGFP under DAPI red florescence; D: merge of DAPI and green channel florescence.

将小麦TaHsfB2d在酵母中转化并进行热激处理, 在正常生长条件下, 在半乳糖诱导培养基上, 转TaHsfB2d与转空载体pYES2的酵母细胞的长势和大小无明显差异(图6-A); 经50° C热激处理45 min后,转TaHsfB2d基因酵母细胞和转空载体对照细胞的生长速度均受到抑制, 但是转TaHsfB2d基因酵母细胞的生长受抑制程度明显小于转空载体对照细胞, 细胞数目明显多于对照, 细胞大小没有明显差异(图6-B)。从酵母细胞生长曲线也可看出, 正常培养条件下转pYES2和pYES2-TaHsfB2d酵母细胞生长较快, 生长速度没有明显差异(图6-C); 50° C热激处理后细胞生长速度均降低, 但处理15 h后转pYES2- TaHsfB2d酵母细胞生长速率明显高于转空载体对照细胞(图6-D), 表明TaHsfB2d能在酵母细胞中被诱导表达, 且能显著提高酵母细胞的耐热性。