强抗寒性白菜型冬油菜品种陇油7号, 在我国北方寒区越冬率在80%以上; 弱抗寒性品种天油2号, 越冬率40%~80%^[24]。种子由甘肃省油菜工程技术研究中心提供。

采用盆栽试验, 将种子播于营养钵, 置人工气候箱培养。待幼苗长至5~6片真叶时放入温度试验箱, 于25° C (CK)、10° C、2° C和-5° C处理, 72 h后分别取叶片和根, 一部分用液氮迅速冷冻后, 锡纸包裹放入-80° C超低温冰柜用于ATP酶活性测定, 一部分105° C 5 min钝化脂酶, 剪碎混匀, 用于膜脂提取。设3次重复试验。

参照文献[29]方法并改进提取膜脂。称取高温热杀钝化脂酶的混匀样品100 mg, 研磨后移入15 mL离心管, 加5%盐酸甲醇溶液2 mL, 氯仿甲醇溶液(体积比1∶ 1) 3 mL, 100 µ L十九烷酸甲酯内标, 置85° C水浴锅中1 h, 待温度降到室温后在离心管中加入1 mL正己烷, 振荡萃取 2 min, 静置1 h等待分层。取上层清液100 µ L, 用正己烷定容到1 mL, 0.45 µ m滤膜过滤后上机测试。

采用ThermoFisher Trace 1310 ISQ气相色谱质谱联用仪分析脂肪酸成分, 柱温为: 80° C保持1 min, 以10° C min^-1的速率升温至200° C, 继续以5° C min^-1的速率升温至250° C, 最后以2° C min^-1的速率升到270° C, 保持3 min, 进样口温度为290° C, 采取不分流进样, 重复3次。根据样品保留时间定性分析, 确定样品中脂肪酸的种类, 然后按照峰面积归一法计算求得各脂肪酸在总脂肪酸中的相对含量, 并计算不饱和脂肪酸含量/饱和脂肪酸含量(U/S)与膜脂脂肪酸不饱和指数(IUFA)。

U/S=[(16:1)+(18:2)+(18:3)]/[(14:0)+(15:0)+(16:0) +(17:0)+(18:0)]

IUFA=[(16:1)+(18:2)× 2 + (18:3)× 3]× 100%

式中, 小括号中的数值代表不同的脂肪酸种类, 16:1为棕榈油酸, 18:2为亚油酸, 18:3为亚麻酸, 14:0为肉豆蔻酸, 15:0为十五烷酸, 16:0为棕榈酸, 17:0为十七烷酸, 18:0为硬脂酸。

将冷冻样品在预冷的0.05 mol L^-1 Tris-HCl, pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中漂洗, 以滤纸拭干后准确称取0.5 g, 放入5 mL匀浆管, 以1∶ 4 (g mL^-1)加入预冷的匀浆介质PBS冰浴充分研碎, 制成20%的匀浆液, 以13 000× g 4° C冷冻离心15 min, 重复此步骤2次, 取上清液备用。采用南京建成生物研究所生产的ATPase试剂盒按其说明测定ATPase活性。

采用Microsoft Excel 2007处理图形, 用SPSS 19软件统计分析试验数据。

当温度在零度以上时, 2个冬油菜品种均生长正常, 叶片深绿色, 没有受冻害的症状; 但在-5° C处理后, 表现出不同的受害症状, 陇油7号受害较轻, 仅表现出叶色变浅、下部叶片叶尖、叶缘卷曲等较轻微受害症状, 而天油2号出现严重受冻害症状, 叶缘呈水渍状冻斑(图1)。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 不同温度处理后冬油菜幼苗形态的变化Fig. 1 Morphological changes inB. rapa L. seedlings under temperature treatments

不同温度处理下冬油菜叶片和根系膜脂脂肪酸组分相同(表1), 主要有十五烷酸(C15:0)、棕榈酸(16:0)、硬脂酸(18:0)、亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3), 约占总脂肪酸的95%~99%, 还有少量的肉豆蔻酸(C14:0)、十七烷酸(C17:0)和棕榈油酸(C16:1), 占1%~5%。说明十五烷酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸5种脂肪酸在冬油菜膜脂的组成上以及膜对外界温度发生变化时适应性方面比其他脂肪酸发挥着更为重要的作用。其中叶片中不饱和脂肪酸以亚麻酸为主, 约占总脂肪酸含量的14.33%~ 29.64%; 根系不饱和脂肪酸主要为亚油酸, 约占总脂肪酸含量的11.55%~16.20%。叶片和根系饱和脂肪酸均以棕榈酸为主, 约占总脂肪酸含量的36.69%~69.77%。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同温度处理下冬油菜脂肪酸组分及其相对含量 Table 1 Fatty acid components and their relative contents of B. rapaL. under different temperatures (%) 品种 Variety 部位 Position 温度 Temperature (° C) C14:0 C15:0 C16:0 C16:1 C17:0 C18:0 C18:2 C18:3 陇油7号 Longyou 7 叶片 Leaf 25 0.10 21.83 36.69 1.81 0.23 8.52 13.74 17.08 10 0.05 21.24 38.45 1.62 0.18 9.22 12.04 17.20 2 0.14 20.06 39.58 1.29 0.19 9.80 11.32 17.62 -5 0.09 0.03 56.04 3.58 0.07 4.83 5.72 29.64 根 Root 25 0.09 24.03 41.43 0.44 0.16 13.56 13.22 5.26 10 0.10 23.13 42.68 0.50 0.18 11.33 15.31 5.93 2 0.05 21.13 43.25 0.45 0.12 11.93 15.12 7.29 -5 0.18 0.08 65.57 1.51 0.11 9.17 13.17 7.50 天油2号 Tianyou 2 叶片 Leaf 25 0.05 22.44 36.84 1.60 0.17 8.99 14.30 16.74 10 0.06 20.93 40.06 1.39 0.17 9.75 11.79 16.69 2 0.04 20.65 39.92 0.97 0.19 11.04 10.65 17.12 -5 0.08 0.03 57.78 4.36 0.07 7.93 6.46 26.00 根 Root 25 0.12 23.82 40.91 0.36 0.20 12.47 15.03 7.09 10 0.09 23.37 42.06 0.57 0.14 11.79 15.22 6.76 2 0.08 22.69 43.12 0.34 0.18 10.86 16.20 6.57 -5 0.15 0.07 69.77 0.98 0.13 10.59 11.55 6.76

表1 不同温度处理下冬油菜脂肪酸组分及其相对含量 Table 1 Fatty acid components and their relative contents of B. rapaL. under different temperatures (%)

2.3.1 饱和脂肪酸含量的变化 由表2可以看出, 随着处理温度的降低, 2个冬油菜品种根和叶片中十五烷酸含量逐渐降低, 棕榈酸含量逐渐增加, 叶片中硬脂酸含量先上升后下降, 根中硬脂酸呈逐渐降低趋势。同一温度处理下, 根系饱和脂肪酸含量高于叶片。当温度较高时(25° C、10° C) 2个品种根系和叶片中饱和脂肪酸含量相差不大, 但在低温(-5° C)处理下, 天油2号叶片和根系膜脂饱和脂肪酸相对含量均高于陇油7号。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 不同温度下冬油菜叶片和根系饱和脂肪酸含量 Table 2 Contents of saturated fatty acids in leaf and root of B. rapaL. under different temperatures 脂肪酸Fatty acid 部位 Position 品种 Variety 饱和脂肪酸含量 Contents of saturated fatty acids 25° C 10° C 2° C -5° C C15:0 叶片 Leaf 陇油7号Longyou 7 21.83± 0.25 ab 21.24± 0.70 bc 20.06± 0.14 d 0.03± 0 e 天油2号Tianyou 2 22.44± 0.55 a 20.93± 0.80 bcd 20.65± 0.21 cd 0.03± 0.01 e 根系 陇油7号Longyou 7 24.03± 0.02 a 23.13± 0.24 b 21.21± 0.16 d 0.08± 0.00 e Root 天油2号Tianyou 2 23.82± 0.48 a 23.37± 0.16 b 22.69± 0.36 c 0.07± 0.01 e C16:0 叶片 陇油7号Longyou 7 36.69± 0.07 d 38.45± 0.97 cd 39.58± 0.35 c 56.04± 0.23 b Leaf 天油2号Tianyou 2 36.84± 1.77 d 40.06± 0.17 c 39.92± 0.30 c 57.78± 1.68 a 根系 陇油7号Longyou 7 41.43± 0.18 f 42.68± 0.15 d 43.25± 0.05 c 65.57± 0.28 b Root 天油2号Tianyou 2 40.91± 0.12 g 42.06± 0.22 e 43.12± 0.08 c 69.77± 0.15 a C18:0 叶片 陇油7号Longyou 7 8.52± 0.08 d 9.22± 0.06 c 9.80± 0.46 b 4.83± 0.14 f Leaf 天油2号Tianyou 2 8.99± 0.33 c 9.75± 0.11 b 11.04± 0.29 a 7.93± 0.25 e 根系 陇油7号Longyou 7 13.56± 0.55 a 11.33± 0.03 cd 11.93± 0.49 c 9.17± 0.09 f Root 天油2号Tianyou 2 12.47± 0.02 b 11.79± 0.20 b 10.86± 0.23 de 10.59± 0.08 e Different small letters in the table show significant difference at the 0.05 level between the same position of Longyou 7 and Tianyou 2 of same fatty acids under different temperatures. 表中小写字母表示2个品种同一部位的同一种脂肪酸含量在不同温度间的差异显著性(P< 0.05)。

表2 不同温度下冬油菜叶片和根系饱和脂肪酸含量 Table 2 Contents of saturated fatty acids in leaf and root of B. rapaL. under different temperatures

2.3.2 不饱和脂肪酸含量的变化 随着温度降低, 2个冬油菜品种叶片中亚油酸含量逐渐降低(表3), 亚麻酸含量逐渐上升。根系亚油酸含量, 在处理温度大于0° C时逐步增加, 温度低于0° C时显著降低, 天油2号降低幅度大于陇油7号; 降温过程中, 陇油7号根系亚麻酸含量逐渐上升, 天油2号呈逐渐降低趋势。温度小于0° C时, 陇油7号根系不饱和脂肪酸含量显著高于天油2号。

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 不同温度下冬油菜叶片和根系不饱和脂肪酸含量 Table 3 Contents of unsaturated fatty acids in leaf and root ofB. rapaL. under different temperatures 脂肪酸Fatty acid 部位 Position 品种 Variety 不饱和脂肪酸含量 Contents of unsaturated fatty acids 25° C 10° C 2° C -5° C C18:2 叶片 陇油7号Longyou 7 13.74± 0.79 a 12.04± 0.40 b 11.32± 0.02 bc 5.72± 0.14 e Leaf 天油2号Tianyou 2 14.30± 0.64 a 11.79± 0.04 d 10.65± 0.31 c 6.46± 0.17 d 根系 陇油7号Longyou 7 13.22± 0.63 b 15.31± 0.07 a 15.12± 0.09 a 13.17± 1.54 b Root 天油2号Tianyou 2 15.03± 0.02 a 15.22± 0.02 a 16.20± 0.39 a 11.55± 0.41 d C18:3 叶片 陇油7号Longyou 7 17.08± 0.04 c 17.20± 0.38 c 17.62± 0.35 c 29.64± 0.10 a Leaf 天油2号Tianyou 2 16.74± 0.49 c 16.69± 0.17 c 17.12± 0.61 c 26.00± 1.26 b 根系 陇油7号Longyou 7 5.26± 0.06 e 5.93± 0.14 d 7.29± 0.04 ab 7.50± 0.04 a Root 天油2号Tianyou 2 7.09± 0.04 b 6.76± 0.05 c 6.57± 0.12 c 6.76± 0.35 c Different small letters in the table show significant difference at the 0.05 level between the same position of Longyou 7 and Tianyou 2 of same fatty acids under different temperatures. 表中小写字母表示2个品种同一部位的同一种脂肪酸含量在不同温度间的差异显著性(P< 0.05)。

表3 不同温度下冬油菜叶片和根系不饱和脂肪酸含量 Table 3 Contents of unsaturated fatty acids in leaf and root ofB. rapaL. under different temperatures

2.3.3 不同温度环境下冬油菜脂肪酸不饱和程度的变化 由图2可知, 随温度的下降, 2个冬油菜品种叶片中的U/S比值呈先下降后增加的趋势。陇油7号叶片的U/S比值始终高于天油2号; 品种的根系U/S比值表现出较大变化, 随温度的下降, 陇油7号逐渐增加, 而天油2号在温度较高时(25° C、10° C)基本没有变化, 当温度降低到2° C时急剧下降; 降温过程中, 陇油7号根系U/S比值逐渐高于天油2号, 说明在降温过程中, 陇油7号叶片和根系能够通过调整脂肪酸相对含量, 积累相对较多的不饱和脂肪酸适应降温对其造成的伤害, 而天油2号根系在低温条件下不饱和脂肪酸合成受阻。

随着温度的降低, 2个品种IUFA值均呈逐步上升的趋势。温度较高时(25° C、10° C), 2个品种IUFA值间差异不显著; 低温条件下(2° C)时, 两品种间IUFA值差异明显; 胁迫温度小于0° C时, 陇油7号IUFA值显著高于天油2号(图3)。

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 不同温度下冬油菜U/S比值的变化 L7: 陇油7号; T2: 天油2号。L7: Longyou 7; T2: Tianyou 2.Fig. 2 Variation of U/S inB. rapa L. under different temperatures

图3

Fig. 3

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	图3 不同温度下冬油菜IUFA的变化 柱形图上不同字母表示2个品种在处理间存在显著性差异(P< 0.05)。Fig. 3 IUFA variation of B. rapa L. at different temperatures Different letters above the bar mean significant difference between Longyou 7 (L7) and Tianyou 2 (T2) (P< 0.05).

2.4.1 温度对冬油菜Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性的影响

叶片与根中Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性变化不同(图4和图5)。随着温度的降低, 叶片中Ca²⁺/Mg²⁺- ATPase活性由高到低, 而根中则是由低到高。在温度较高时(25° C、10° C), 叶片中的Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性大于根系, 低温时(2° C、-5° C), 根系Ca²⁺/Mg²⁺- ATPase活性大于叶片。品种间叶片与根中Ca²⁺/ Mg²⁺-ATPase活性变化差异较大, 当温度在10° C以上时, 天油2号叶片与根中Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性均高于陇油7号, 温度降至2° C以后, 陇油7号叶片与根中Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性大于天油2号。这是由于温度较高时(即适宜温度时), 天油2号生长发育快, 而当温度降低到非适宜生长时, 天油2号地上部生长受阻, 适应性降低, Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase活性降低。陇油7号则相反, 适宜温度时, 生长发育缓慢, 在温度下降到非适宜条件时, 其地下部生长正常, 适应性强。说明强抗寒的冬油菜在低温抗寒锻炼过程中, 质膜ATP酶获得了耐低温的特性, 以致在零度以下, 能保持更高的活性反应。

图4

Fig. 4

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	图4 不同温度下冬油菜叶片Ca2+/ Mg2+-ATPase活性 柱形图上不同字母表示2个品种在处理间存在显著性差异 (P< 0.05)。Fig. 4 Ca2+/Mg2+-ATPase activity in leaves of B. rapaL. at different temperatures Different letters above the bar mean significant difference between Longyou 7 (L7) and Tianyou 2 (T2) (P< 0.05).

图5

Fig. 5

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	图5 不同温度下冬油菜根系Ca2+/Mg2+-ATPase活性 柱形图上不同字母表示2个品种在处理间存在显著性差异 (P < 0.05)。Fig. 5 Ca2+/Mg2+-ATPase activity in root of B. rapa L. under different temperatures Different letters above the bar mean significant difference between Longyou 7 (L7) and Tianyou 2 (T2) (P< 0.05).

2.4.2 温度对冬油菜K⁺/Na⁺-ATPase活性的影响

陇油7号叶片K⁺/Na⁺-ATPase活性随着温度的降低而减小, 温度为-5° C时, K⁺/Na⁺-ATPase活性比常温(25° C)降低了77.4% (图6); 天油2号叶片K⁺/Na⁺- ATPase活性随着温度降低呈“ 升降升” 的趋势, 在胁迫温度下均高于常温(25° C)。

图6

Fig. 6

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	图6 不同温度下冬油菜叶片K+/Na+-ATPase活性 柱形图上不同字母表示2个品种在处理间存在显著性差异 (P< 0.05)。Fig. 6 K+/Na+-ATPase activity in leaves of B. rapa L. under different temperatures Different letters above the bar mean significant difference between Longyou 7 (L7) and Tianyou 2 (T2) (P< 0.05).

随着温度降低, 陇油7号根系K⁺/Na⁺-ATPase活性逐渐提高(图7), 天油2号根系K⁺/Na⁺-ATPase活性逐渐降低, 当温度降至-5° C时, 2个冬油菜品种根系K⁺/Na⁺-ATPase活性差异显著, 陇油7号为天油2号的4.92倍。

质膜不饱和脂肪酸含量与饱和脂肪酸含量比值与植物抗寒性密切相关^[30]。低温胁迫可使不同植物质膜脂肪酸组成比例改变, 不饱和脂肪酸含量增加^{[31, 32]}。膜脂中不饱和脂肪酸含量的增加能降低膜脂的相变温度, 增加膜脂的流动性, 使膜脂在低温下保持稳定, 以此提高植物的抗寒性^{[33, 34]}。膜脂脂肪酸不饱和指数( IUFA)是细胞膜中不饱和脂肪酸含量的总和, 是衡量膜脂脂肪酸不饱和程度的重要指标之一, 可用来评价植物的抗寒性^{[35, 36]}。本研究在低温条件下(2° C, -5° C), 抗寒性强的陇油7号膜脂不饱和脂肪酸含量/饱和脂肪酸含量比值、IUFA值始终高于抗寒性弱的天油2号, 说明陇油7号在降温过程中能随温度变化对膜脂脂肪酸组分含量进行适应性调整, 低温下脂肪酸去饱和化程度强于天油2号, 能积累较多的不饱和脂肪酸, 增强细胞膜体系的稳定性, 可见, 质膜脂肪酸因品种抗寒性而异。

图7

Fig. 7

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	图7 不同温度下冬油菜根系K+/Na+-ATPase活性 柱形图上不同字母表示2个品种在处理间存在显著性差异 (P< 0.05)。Fig. 7 K+/Na+-ATPase activity in root of B. rapa L. under different temperatures Different letters above the bar mean significant difference between Longyou 7 (L7) and Tianyou 2 (T2) (P< 0.05).

本试验中, 随处理温度的降低, 2个冬油菜品种叶片不饱和脂肪酸含量变化均呈先降低后增加的趋势。在-5° C时不饱和脂肪酸大幅增加, 所增加的不饱和脂肪酸主要是棕榈油酸和亚麻酸; 根中不饱和脂肪酸含量变化趋势因品种不同, 陇油7号逐步增加, 天油2号则逐步降低; 根中不饱和脂肪酸含量变化以亚油酸为主。品种的不饱和脂肪酸含量变化趋势不同。2° C处理时天油2号叶片和根系不饱和脂肪酸含量均明显下降, 而陇油7号则叶片下降、根系显著上升, 说明两个抗寒性不同的品种的根系与叶片的膜脂在低温响应上存在差异, 抗寒性强的品种根系在降温过程中逐步获得了较稳定的膜脂不饱和度水平, 在低温下始终保持膜的流动性, 维持正常的生理功能, 以此抵御低温伤害。

低温胁迫会影响细胞膜系中的功能蛋白如ATP酶活性等^[37], 然后对细胞生理、生化代谢过程造成破坏^[38], ATP酶是膜结合功能性蛋白质, 在细胞中主要执行K、Na、Ca、Mg和H离子的传递功能^{[39, 40]}。简令成等^[41]对小麦幼苗寒害的研究指出, 低温胁迫下, 质膜完整性受到破坏后透性发生变化, K⁺等外渗, 打破了离子平衡, 引起代谢失调。寒冷胁迫能刺激细胞质内Ca²⁺浓度增高^[42], 但胞内Ca²⁺浓度过高或长时间维持高浓度会干扰细胞能量代谢系统和许多生理功能, 导致细胞死亡^[43]。Ca²⁺-ATPase在维持细胞质内Ca²⁺稳态方面起重要作用^[44]; 已有研究表明^{[45, 46]}, 冷害首先是通过影响植物细胞膜的Mg²⁺- ATP 酶活性, 使之降低或完全失活, 从而破坏植物的生活力。在本研究中, 陇油7号叶片Ca²⁺/ Mg²⁺- ATPase和K⁺/Na⁺-ATPase活性均随着胁迫温度的降低而降低, 而其根系Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase和K⁺/Na⁺- ATPase活性均随着胁迫温度的降低而升高; 天油2号叶片Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase和K⁺/Na⁺-ATPase活性均随着胁迫温度的降低呈现波动状态, 其根系Ca²⁺/ Mg²⁺-ATPase和K⁺/Na⁺-ATPase活性均随着胁迫温度的降低而下降; 当温度达到-5° C时, 陇油7号根系ATPase显著高于天油2号。表明在低温胁迫下, 陇油7号能更好地维持根系的ATPase活性, 根系能有效地把低温刺激所产生的过量胞质离子及时地运到胞外, 使胞内离子维持稳态平衡, 保持细胞正常生理代谢, 抵御低温逆境胁迫的能力增强; 天油2号在低温下, 根系ATPase活性显著下降, 致使被升高的胞质无机离子不能及时外运, 造成细胞伤害, 引起代谢失调, 抗低温胁迫的能力降低, 导致抗寒性减弱。

生物膜的流动性和膜结合酶活力都受膜脂成分的影响^[19], 抗寒锻炼能通过改变植物细胞膜的脂肪酸组成来提高植物的抗寒性^{[47, 48]}。本研究中, 低温胁迫对2个冬油菜品种叶片和根系脂肪酸饱和度及ATP酶活性均产生显著影响, 强抗寒性品种陇油7号在零度以下低温胁迫时, 不饱和脂肪酸含量/饱和脂肪酸含量比值、IUFA、Ca²⁺/Mg²⁺-ATPase和K⁺/ Na⁺-ATPase活性均大于抗寒性较弱的天油2号, 说明抗寒性强的冬油菜品种在长期低温适应性生长过程中, 自身产生了适应低温的机制, 当温度降低时, 其膜脂脂肪酸不饱和度增加, 膜脂的流动性增强, 从而有利于膜脂维持稳定的状态; 同时, 脂肪酸组分含量的改变, 致使膜结合酶在低温下的活性增强, 有利于维持细胞质正常的无机离子水平, 避免细胞内无机离子中毒, 保护细胞免受伤害。王育启等^[49]、李素丽等^[50]在水稻、甘蔗的研究中也得到类似研究结果。因此低温下不饱和脂肪酸含量和ATPase活性的提高是北方强抗寒冬油菜品种主要抗寒特征。