黄绿叶突变体ygl6由EMS诱变缙恢10号 (Jinhui 10)所得, 经多代培养已遗传稳定。缙恢10号是西南大学水稻研究所选育的优良籼稻恢复系, 以其作为野生型对照。

由于pCAMBIA1301上的单酶切位点在YGL6基因的基因组DNA序列均存在, 并且扩增片段较长, 则采用重组酶的方法进行。引物6HBF1和6HBR2分别与载体pCAMBIA1301 BamH I和Hind III酶切后的片段有15 bp的重叠; 引物6HBR1和6HBF2有15 bp的重叠用于连接前后2个扩增片段的重叠片段。引物6HBF1、6HBR2、6HBF2、6HBR1的序列分别为5° -cggtacccggggatcAACATGGTCAGGCACA GTGATGAGAT-3° 、5° -AGATAGGAGATGGTAGCAG GAGGCTG-3° 、5° -TACCATCTCCTATCTCTGACTTC AGTAGTGC-3° 和5° -GGCCAGTGCCAAGCTGGTC AAGCTCCCTGGTGAGGCTAT-3° 。载体参照Shi等^[18]的方法构建与转化。

参照Ren等^[19]的方法分析YGL6蛋白的进化。

参照Shi等^[18]的方法进行RNA的提取和纯化、cDNA的合成和qRT-PCR的表达分析。

以野生型、突变体和互补植株为材料, 上午9:00在种植小区中间随机选择长势相对一致的5个单株, 测定叶片中部的光合色素含量。称取0.1 g叶片剪碎装入离心管, 加25 mL丙酮∶ 无水乙醇(1∶ 1, v/v) 混合液封口暗处理24~48 h, 其间经常摇动, 每个样品重复3次。用分光光度计测定470 nm、645 nm和663 nm的光吸收值, 参考Lichtenthaler^[20]的方法计算。

选择载体pTCK303为载体骨架, 其上的Ubiquitin为启动子, BamH I和SacI为双酶切位点。设计引物扩增YGL6基因的整个CDS片段, 前引物ATG前加入来自pTCK303 BamH I酶切后Ubiquitin侧15 bp, 后引物不含终止密码子。再设计1对引物扩增GFP基因的整个CDS片段, 前引物与YGL6的后引物有15 bp的重叠, 后引物加入来自pTCK303 SacI酶切后NOS侧15 bp碱基。引物6OEPF1、6OEPR1、6GFPF1和6GFPR1的序列分别为5° -tacttc tgcaggatcATGGCAGCAACAGCCTCCCT-3° 、5° -tcacc atgacgctgaCGAGCTTCTTGCC-3° 、5° -tcagcgtcatggtga GCAAGGGCGAGGA-3° 和5° -CAAATGTTTGAAC GGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3° 。参照Ren等^[19]转水稻原生质体的亚细胞定位方法。

为了验证通过图位克隆筛选出的候选基因Os12g23180就是YGL6基因^[18], 构建了基因组互补载体, 将野生型中Os12g23180基因组片段包括上游3500 bp、编码框和下游1500 bp序列利用重组酶整合到pCAMBIA1301表达载体中, 然后通过农杆菌介导法遗传转化突变体ygl6。在T₀获得的转基因植株中, 共观察到12株转基因植株的突变体表型得以恢复(图1-A, B)。同时通过提取DNA后测序比对发现, 12株转基因植株在突变位点均出现了双峰, 证实互补载体成功转入突变体, 使其表型得以恢复正常(图1-C)。分析表明恢复表型的转基因植株的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量均达到了野生型的色素含量水平(图1-D)。

图1

Fig. 1

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图1 YGL6基因的互补验证 A: WT、ygl6和转基因互补植株; B: WT、ygl6和转基因互补植株的叶片; C: WT、ygl6和转基因互补植株突变位点的测序结果; D: WT、ygl6和转基因互补植株的色素含量。* 表示在0.05水平上差异显著。Fig. 1 Functional complementation analysis of YGL6 A: phenotypes of WT, ygl6 mutant, and transgenic plant (ygl6/YGL6); B: leaves of WT, ygl6 mutant, and transgenic plant; C: the YGL6 sequencing of WT, ygl6 mutant, and transgenic plant; D: pigment contents of WT, ygl6 mutant, and transgenic plant. * P﹤0.05.

通过比对水稻基因组序列, 在其他位置未发现与YGL6基因高度相似的序列, 表明YGL6基因是单拷贝基因。利用NCBI网站对YGL6蛋白质BLASTp分析表明, YGL6基因编码NAD(P)-结合的Rossmann折叠超家族蛋白质, 属于短链脱氢酶/还原酶家族, 推断为异黄酮还原酶、糖脱水酶和mRNA结合蛋白等。YGL6蛋白质具有多个保守结构域, 如SDR-a1结构域、NAD(P)-结合位点、UDP-葡萄糖-4-异构酶C末端亚基、短链脱氢酶、RNA结合蛋白、NAD依赖的异构酶家族等。

YGL6蛋白在网站gramene (http://www.gramene. org/)预测是一个RNA结合蛋白, 生物信息学分析该蛋白质定位于叶绿体, 系统进化树分析表明其与其他物种的叶绿体茎环结合蛋白聚类在一起。从系统进化中可以看出, 该基因属于高保守低拷贝, 从藻类、苔藓到高等植物均含有此蛋白, 并且藻类、苔藓、单子叶和双子叶植物各自组成一个分支(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 YGL6基因的进化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of the YGL6

通过qRT-PCR检测, YGL6基因在苗期除根外, 心叶、成熟叶和叶鞘中均有表达, 尤以心叶的表达量最高, 达到成熟叶的6倍多(图3-A); 在孕穗期, 仅在叶片和叶鞘中有表达, 在心叶的表达量最高; 在抽穗期的绿色颖壳中也有表达(图3-B)。以上结果表明YGL6基因在整个生育期的绿色部位表达, 尤以心叶的表达量最高。

图3

Fig. 3

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	图3 YGL6基因表达分析 A: 苗期YGL6基因在WT和ygl6的表达分析; B: 孕穗期YGL6基因在WT的表达分析。* 表示在0.05水平上差异显著。Fig. 3 Expression analysis of YGL6 by qRT-PCR A: expression level of YGL6 at seedling stage in WT and the YGL6 mutant; B: expression level of YGL6 at booting stage in WT. * P﹤0.05.

对连续暗培养14 d的水稻幼苗光照处理表明, 随着光照时间的延长, YGL6基因的表达量不断上升(图4-A)。对连续光培养14 d的水稻幼苗进行黑暗处理表明暗培养0.5 h表达量下降, 但随后表达量逐渐上升, 在4 h时达到最大表达量, 随后逐渐下降, 在24 h时降到最低表达量(图4-B)。以上结果表明YGL6基因的表达受光照的诱导。

图4

Fig. 4

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	图4 光照对YGL6基因表达的分析 A: 连续黑暗培养后在不同光照时间YGL6基因的表达; B: 连续光照培养后在不同黑暗时间YGL6基因的表达。Fig. 4 qRT-PCR analysis of the expression level of YGL6 A: expression level of YGL6 in wild-type plants at different hours transferred to continuous light from continuous darkness; B: expression level of YGL6 in wild-type plants at different hours transferred to continuous darkness from continuous light.

亚细胞定位分析网站(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)预测YGL6蛋白定位于叶绿体, 为了验证YGL6蛋白是否定位于叶绿体, 构建了35S-YGL6ORF-GFP和35S-GFP融合瞬时表达载体。将瞬时表达载体转化水稻原生质体, 用绿色荧光蛋白GFP做指示。结果表明, 在转35S-GFP原生质体, 除液泡外绿色荧光信号在整个细胞中均能观察到(图5-A~D); 而在转35S-YGL6ORF-GFP的原生质体中, GFP的绿色荧光信号(图5-E)和叶绿体自发的红色荧光信号(图5-F)重叠为黄色(图5-H), 说明YGL6蛋白定位在叶绿体。

图5

Fig. 5

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	图5 YGL6蛋白的亚细胞定位 A~D: 阴性对照(35S-GFP); E~H: YGL6蛋白定位(35S-YGL6ORF-GFP)。Fig. 5 Subcellular location of YGL6 protein using rice protoplasts A-D: negative control (35S-GFP); E-H: subcellular location of YGL6 protein (35S-YGL6ORF-GFP).