2010年和2011年籼稻( O. sativaL. subsp. indica)品种9311和粳稻( O. sativaL. subsp. japonica)品种日本晴(Nipponbare), 以及以日本晴为受体、9311为供体构建的38个经重测序的染色体片段代换系群体^{[ 9]}于扬州大学文汇路校区内试验基地(简称为“校内”)和扬州市郊杭集镇的试验基地(简称为“杭集”)种植, 每个环境设置3个重复。每个系种植4~6行, 每行10个单株, 株行距分别为13 cm和17 cm。均按常规水肥管理。38个染色体片段代换系中的代换片段分布于水稻的12条染色体上, 覆盖了水稻全基因组的87.46%^{[ 9]}。染色体代换系群体抽穗期持续时间约为8 d, 灌浆成熟期间的条件较为一致, 抽穗后22~25 d成熟收获。为减少生育期差异对稻米品质的影响, 本研究剔除了个别生育期滞后的家系。

收获亲本及水稻染色体代换系植株上成熟种子, 采用Little等^{[ 10]}方法测定每粒精米的碱消值(ASV), 按1~7级记分。每个株系测定3个单株, 每个单株均测定18粒, 以其平均数代表亲本或代换系各株系的GT表型值。按农业部标准米质测定方法NY147- 88测定稻米中的直链淀粉含量和胶稠度。

GT数据由统计软件SPSS16.0分析完成。采用Eshed等^{[ 11]}的方法稍作修改检测QTL。以受体亲本日本晴为对照, 参照张昌泉等^{[ 8]}方法检测代换系与对照亲本间的差异显著性。通过 t测验比较每个CSSL与日本晴GT之间的差异, 以 α= 0.05为阈值, 即 P≤0.05, 则认为染色体置换片段上存在控制GT的QTL; 当 P> 0.05时则不存在控制GT的QTL。参考Eshed等^{[ 11]}的方法估算各个QTL的加性效应值及加性效应贡献率。加性效应值=(染色体片段代换系的碱消值-日本晴碱消值)/2; 加性效应贡献率 = (染色体片段代换系加性效应值/日本晴碱消值) × 100%。

QTL代换作图参照何风华等^{[ 12]}的方法并作适当修改。即2个或2个以上的染色体代换系在相互重叠的置换区段上均检测到控制GT的QTL, 而且遗传效应一致, 则认为QTL位于置换片段的重叠片段上; 如果在某一个CSSL的置换片段上检测到控制GT的QTL, 但在含有其置换片段某相应重叠区段的另一个或多个CSSL中未检测出, 则认为QTL位于非重叠的区段上。

待测样品的精米用三倍体积NaOH溶液(pH8.0~8.5)浸泡过夜后, 去除浮渣。随后用组织匀浆机(IKA-T RCT-Basic, Germany)以17 500转 min^-1匀浆3 min, 匀浆液中按每克精米添加50 mg的碱性蛋白酶, 42℃磁力搅拌24 h, 将消化过的匀浆液过200目筛后弃掉残渣, 滤液经3600 × g离心20 min, 弃上清液, 用去离子水悬浮沉淀后3600 × g离心20 min。重复上述清洗过程5次以去掉淀粉中残留的离子。后用90%无水乙醇洗2次, 于真空干燥器中干燥, 过100目筛提纯出天然的淀粉, 随后用塑料袋密封放置于4℃冰箱备用。参照Zhu等^{[ 13]}的方法将提纯的淀粉去分支, 利用异淀粉酶(EC3.2.1.68, Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc, Okayama, Japan)处理提纯亲本及代换系成熟种子收获的淀粉, 获得去分支的淀粉。利用凝胶色谱仪(PL-GPC 220, Polymer Laboratories Varian, Inc. Amherst, MA)分析去分支的淀粉分子量分布。

双亲及染色体片段代换系群体的平均碱消值见表1。 t测验表明受体亲本日本晴和供体亲本9311的碱消值在2年2个地点均存在显著差异( P≤0.05), 且较稳定。双亲及染色体群体在2年2点的碱消值频率分布图见图1, 由图1可知, 染色体片段代换系间GT的变异范围较广, 且呈连续分布, 这也表明GT性状受多基因控制。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 双亲及染色体片段代换系群体的碱消值 Table 1 Profiling of the alkali spreading value among CSSLs and their two parents 年份 Year 地点 Site 日本晴Nipponbare 9311 CSSL群体CSSL population Mean± SD Mean± SD 范围 Range 均值Mean 变异系数 CV 2010 校内Campus 4.25±0.11* 3.25±0.08 2.17-4.92 3.22 1.32 杭集Hangji 4.42±0.12* 3.17±0.23 2.17-5.67 3.92 0.18 2011 校内Campus 4.75±0.11* 3.17±0.23 2.00-5.00 3.57 0.12 杭集Hangji 4.25±0.07* 3.09±0.12 2.00-5.50 4.00 1.72 * Significant at the 0.05 probability level as determined by t-test. *表示 t测验在0.05水平差异显著。

表1 双亲及染色体片段代换系群体的碱消值 Table 1 Profiling of the alkali spreading value among CSSLs and their two parents

图1

Fig. 1

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	图1 双亲及染色体片段代换系在不同环境中的碱消值频率分布E1: 校内(2010); E2: 杭集(2010); E3: 校内(2011); E4: 杭集(2011)。Fig. 1 Histogram of alkali spreading value of CSSLs and their two parents in different environmentsE1: Campus (2010); E2: Hangji (2010); E3: Campus (2011); E4: Hangji (2011).

为排除环境的影响, 本实验对2年各2个环境的碱消值进行了分析, 以同一年份2个地点都能检出的极显著差异位点作为一个稳定QTL, 共检测到4个QTL, 分别是 qGT2-1、 qGT7-1、 qGT8-1、 qGT12-1 (表2)。其中 qGT2-1和 qGT8-1分别只在2010年和2011年检测到, 在年份间的稳定性较差, 而 qGT7-1和 qGT12-1在2年2地均检测到, 遗传效应的趋势也一致, 是很稳定的2个QTL。在2010年, qGT7-1和 qGT12-1在校内环境下对GT的加性效应值分别为-0.92和-1.00, 相应的加性效应贡献率分别为21.53%和23.53%; 2个QTL的加性效应值之和超出了亲本间的差异, 其原因可能存在着一定的上位性。在杭集试验点2个QTL对GT的加性效应值分别为-0.50和-0.50, 相应的加性效应贡献率分别为11.31%和11.31%。2011年, qGT7-1和 qGT12-1在校内环境下对GT的加性效应值分别为-0.71和-1.38, 相应的加性效应贡献率分别为14.84%和28.95%; 在杭集试验点2个QTL对GT的加性效应值分别为-0.79和-1.13, 相应的加性效应贡献率分别为18.59%和26.47%。 qGT12-1对水稻GT的加性效应贡献率最大, 含有 qGT12-1置换片段的代换系N53所对应的GT为高或中GT。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 利用染色体片段代换系对水稻糊化温度QTL分析 Table 2 Analysis of QTL for gelatinization temperature in rice CSSL 年份 Year QTL 染色体 Chr. 区间 Interval (bp) 大小 Size (Mb) 代换系 CSSL 校内Campus 杭集Hangji A A% A A% 2010 qGT2-1 2 1-1100365 1.10 N9 -0.96 22.47 -0.50 11.31 qGT7-1 7 3661546-17110937 13.44 N30 -0.92 21.53 -0.50 11.31 qGT12-1 12 16710520-27757321 11.04 N53 -1.00 23.53 -0.50 11.31 2011 qGT7-1 7 3661546-17110937 13.44 N30 -0.71 14.84 -0.79 18.59 qGT8-1 8 2392408-8676424 6.28 N49 -1.38 28.95 -0.97 22.71 qGT12-1 12 16710520-27757321 11.04 N53 -1.38 28.95 -1.13 26.47 A represents additive effect, and A% represents additive gene effect contribution. A表示加性效应, A%表示加性效应贡献率。

表2 利用染色体片段代换系对水稻糊化温度QTL分析 Table 2 Analysis of QTL for gelatinization temperature in rice CSSL

本研究所用的38个染色体片段代换系均已全基因组重测序分析, 基因型图谱已发表^{[ 9]}。通过染色体代换片段的重叠分析, 可进一步缩小QTL的定位区间。部分家系的ASV见表3。在代换系N9中检测到 qGT2-1, 初步将其定位在第2染色体上, 约1.10 Mb (图2-A); 在代换系N30中检测到 qGT7-1, 考虑N26和N27重叠部分, 将其定位在第7染色体上, 约13.44 Mb (图2-B, F); 在代换系N49中检测到 qGT8-1, 考虑N46重叠部分, 将其定位在第8染色体上, 约6.28 Mb (图2-G)。在代换系N53中检测到 qGT12-1, 定位在第12染色体中, 约11.04 Mb (图2-D, H)。

家系N53携带来自第4、第8和第12染色体上的3个染色体片段, 其中第8和第12染色体上的2个代换片段正好是 qGT8-1和 qGT12-1所在位置。按上述分析, 本研究定位到的 qGT12-1在2年均稳定存在, 而2011年只检测到 qGT8-1。为进一步分析这2个QTL的效应及其真实性, 分别进行代换作图(图2), 并列出了相关代换系在2年4个环境下的碱消值(表3)。在2010年, N53家系稻米碱消值与受体亲本有极显著差异, 而含有第8染色体相同代换片段的N49家系稻米碱消值与受体亲本无显著差异, 因此认为N53家系中造成GT差异的原因是由于第12染色体上代换片段引起的。在2011年, N53和N49家系稻米碱消值都显著区别于受体亲本, 可以推测53家系中GT的差异可能是2个QTL qGT8-1和 qGT12-1共同作用的结果。

图2

Fig. 2

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	图2 控制稻米糊化温度的QTL代换作图基因型数据基于全基因组重测序, 黑色表示来自9311片段, 灰色表示日本晴背景。右边为CSSL的名称, 带*表示该CSSL稻米GT与受体亲本日本晴相比有显著差异。Fig. 2 Physical mapping of the QTLs for gelatinization temperature with developed CSSLsGenotypes of the CSSLs were constructed based on the whole-genome re-sequencing data. Black color indicates the substituted segments from 9311, are denoted by gray bars from Nipponbare.

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 几个家系碱消值的测定值 Table 3 Profiling of the alkali spreading value among several CSSLs (mean± SD) 年份 Year 地点 Site 日本晴 Nipponbare N9 N26 N30 N27 N53 N49 N46 2010 校内Campus 4.25±0.11 2.33±0.27* 4.38±0.12 2.41±0.17* 4.17±0.17 2.25±0.18* 4.35±0.06 3.17±0.13 杭集Hangji 4.42±0.12 3.42±0.15* 4.74±0.20 3.42±0.06* 4.92±0.09 3.42±0.09* 5.00±0.01 5.00±0 2011 校内Campus 4.75±0.11 3.00±0 4.77±0.17 3.33±0.09* 3.08±0.08 1.99±0.11* 1.99±0.12* 3.00±0 杭集Hangji 4.25±0.07 5.67±0.17 4.31±0.09 2.67±0.11* 5.00±0 2.00±0.07* 2.31±0.10* 2.50±0.17 * Significant at the 0.05 probability level as determined by t-test. *表示 t测验在0.05水平差异显著。

表3 几个家系碱消值的测定值 Table 3 Profiling of the alkali spreading value among several CSSLs (mean± SD)

稻米理化品质是一个综合性状, 各性状间存在复杂的关系。同时对2年各2个环境直链淀粉含量的分析(表4)发现, 控制GT的 qGT2-1和 qGT8-1对AC也有一定的影响, 说明这2个区段存在同时影响GT和AC的QTL, 这些区段所含的QTL可能具有多效性。

为了探究造成GT差异的可能原因, 对受体亲本日本晴、供体亲本9311及与受体亲本碱消值差异最大的代换系N53株系成熟种子的淀粉分子结构进行了分析。利用凝胶渗透色谱仪(GPC)分析了样品提纯淀粉的分子量分布情况, 结果见图3。被酶解的淀粉经GPC分离, 出现了3个明显的峰, 左边2个峰F2和F1分别是被酶解的支链淀粉的一级支链峰和二级支链峰, 其中一级支链峰(F2)表示淀粉的长B链, 而二级支链峰(F1)表示短分支的A链和B1链; 右边第3个峰是未被酶解的直链淀粉。日本晴和9311在二级支链峰差异比较小, 而含 qGT8-1和 qGT12-1代换系N53的支链含量远远小于日本晴, 说明N53相对于日本晴而言, 含有较少的A链和短B链。长链B的组成在3个材料稻米淀粉间也存在差异, 代换系N53的长链B含量远远大于受体亲本日本晴。从图中可见, 代换系N53和日本晴在直链淀粉所对应的峰面积上并没有显著的差异。

表4

Table 4

表4(Table 4)

表4 部分家系及受体亲本胶稠度(GC)、直链淀粉含量(AC)的测定值 Table 4 Gel consistency (GC) and amylase content (AC) in partial substitution lines and recipient parent (mean± SD) 年份 Year 地点 Site N9 N49 日本晴Nipponbare GC AC GC AC GC AC 2010 校内Campus 65.33±1.24 16.36±0.07* 66.67±2.08 16.01±0.07* 66.67±2.08 14.49±0.11 杭集Hangji 67.00±2.14 16.56±0.09* 68.00±1.15 16.23±0.13* 68.00±1.15 14.67±0.16 2011 校内Campus 65.50±2.12 14.81±0.42 71.50±2.12 15.08±0.21 71.50±2.12 14.43±0.27 杭集Hangji 65.50±0.71 13.70±0.18 74.00±1.41 14.23±0.34 74.00±1.41 14.70±0.10 * Significant at the 0.05 probability level as determined by t-test. *表示 t测验在0.05 水平差异显著。

表4 部分家系及受体亲本胶稠度(GC)、直链淀粉含量(AC)的测定值 Table 4 Gel consistency (GC) and amylase content (AC) in partial substitution lines and recipient parent (mean± SD)

图3

Fig. 3

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	图3 受体亲本日本晴(Nip, 黑色)、供体亲本9311 (蓝色)和代换系N53 (红色)稻米淀粉经异淀粉酶去分支后的链长分布lg Mw:分子量的对数; dWt/dlg Mw: 分子量的微分分布。Fig. 3 Chain distributions of isoamylase-debranched starches from Nipponbare (Nip, black), 9311 (blue), and N53 (red) by Gel permeation chromatogramslg Mw: The molecular weight of logarithmic; dWt/dlg Mw: molecular weight distribution of calculus.