以小麦品种扬麦18作为转基因受体材料, 由江苏里下河农业科学研究所程顺和课题组提供。小麦全蚀病病原菌 Ggt引自西北农林科技大学。单子叶高效表达载体质粒pAHC25由本实验室保存。

根据1995年Cammue等^{[ 11]}发表的序列和小麦偏爱的密码子, 由北京奥科生物技术公司合成基因 AcAMP-sn, 并在该基因的5′端和3′端分别添加 SmaI和 SacI限制内切酶的酶切位点, 连接到pMD18-T vector (TaKaRa)上构建中间载体pMD18-AcAMP-sn, 并克隆到大肠杆菌细胞中。

用限制内切酶 Sma I和 SacI (TaKaRa)酶切中间载体质粒pMD18-AcAMP-sn, 回收399 bp目的片段, 同时用 Sma I和 Sac I双酶切单子叶高效组成型表达载体pAHC25, 回收切除 GUS基因的pAHC25载体骨架, 并利用T₄连接酶将回收的 AcAMP-sn基因片段与pAHC25载体片段以3∶1摩尔比连接, 构成表达载体pAHC25::AcAMP-sn (图1), 转化到 E. coli菌株Top10感受态细胞中, 通过菌落PCR筛选阳性克隆并测序, 以确定成功构建的转基因表达载体pAHC25::AcAMP-sn。该载体中目标基因 AcAMP-sn的表达受玉米 Ubiqutin启动子控制, Bar基因的表达由另一个 Ubiqutin启动子控制, 可为后续利用Bialaphos筛选转化再生植株提供抗性筛选标记。

图1

Fig. 1

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	图1 pAHC25::AcAMP-sn表达载体的构建Fig. 1 Structure of plant expression vector pAHC25::AcAMP-sn

利用徐惠君等^{[ 12]}报道的基因枪介导法, 以人工合成的 AcAMP-sn基因转化扬麦18幼胚愈伤组织1600块, 通过筛选、分化、再生、移栽成苗等步骤, 获得转pAHC25::AcAMP-sn基因小麦扬麦18的T₀代植株。从外源 AcAMP-sn基因PCR呈阳性的转基因小麦T₀代植株上收获T₁代种子, 单株播种T₁代转基因植株, 并进行转基因的分子检测和抗病性鉴定; 依此类推。

采用改良酚-氯仿抽提法^{[ 13]}, 从转基因小麦及未转基因扬麦18植株0.1 g幼苗叶片中提取基因组DNA, 作为PCR检测的模板。根据转基因载体pAHC25::AcAMP-sn的序列, 设计转基因检测的特异引物UBI-1910U (5′-GCTCTGCCTTCATACGCTA-3′, 位于 Ubiquitin启动子序列上)和AcAMP-sn-2348L (5′-CAGAATGGACGAACAAAGG-3′, 位于 AcAMP-sn基因读码框上), 以转 AcAMP-sn基因小麦DNA为模板, 对T₀~T₄代转基因植株进行外源目标基因的PCR检测和遗传分析。扩增条件为94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35个循环; 72℃延伸10 min。扩增产物(438 bp)经含2.0% EB的琼脂糖凝胶电泳分析。

用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)提取转 AcAMP- sn基因小麦T₄代植株根部总RNA, 按RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0 (TaKaRa)说明书合成第一链cDNA。利用ABI PRISMR 7300实时荧光定量RT-PCR仪(ABI, 美国), 以第一链cDNA为模板, 小麦 18S rRNA基因特异引物(F: 5′-GTGACGGGTGACGGA GAATT-3′; R: 5′-GACACTAATGCGCCCGGTAT-3′)为内参照, 调整试材cDNA, 使其浓度一致, 然后用 AcAMP-sn基因的特异引物(F: 5′-CTACGGACTCGG AAGGGC-3′; R: 5′-CCACCAGAATGGACGAACA A-3′)进行半定量RT-PCR分析和实时荧光定量RT-PCR (Q-RT-PCR)。扩增条件为94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共32个循环; 最后72℃延伸5 min, 3次独立重复。Q-RT-PCR分析按照SYBR Premix Ex Taq反应系统(TaKaRa), 反应体系为25 μL, 反应条件为94℃预变性2 min; 然后94℃变性15 s, 60℃退火31 s, 41个循环。对每个反应进行3次独立重复实验。用2^-ΔΔCT方法^{[ 14]}计算转基因小麦根部 AcAMP-sn基因的相对表达量(以受体扬麦18为对照)。

参照菌饼法对转基因株系及受体接种小麦全蚀病菌^{[ 15]}, 将接种全蚀病菌的小麦幼苗植于河沙与营养土质量比为1∶2的基质中, 于接种后21 d调查单株的总根长和黑(病)根长。根据Bithell等^{[ 16]}报道的方法, 将全蚀病严重度划分为0~4级, 其黑根面积占总根面积的百分率分别为0、0~10%、10%~30%、30%~60%和60%~100%, 全蚀病病情指数TAI (Take-all index) = (10 × N₁ + 30 × N₂ + 60 × N₃ + 100 × N₄) / (N₁ + N₂ + N₃ + N₄)。式中, N₁~N₄为各病级的病株数。采用SPSS19软件进行方差分析。

以小麦 18S rRNA作为内标基因, 利用 Ggt 18S rRNA基因(GenBank登录号为FJ771002)特异性引物(F: 5′-CGAACTCGGTCGTTTAGAGG-3′; R: 5′-GGT ATGTTCACAGGGGTTGG-3′)^{[ 17]}, 对转基因植株与受体扬18根中 Ggt转录情况(全蚀病菌的相对含量)进行半定量RT-PCR及Q-RT-PCR分析。半定量RT-PCR扩增条件为94℃预变性5 min; 94℃ 30 s, 58℃ 30 s, 72℃ 30 s, 共32个循环; 最后72℃延伸5 min。Q- RT-PCR分析按照SYBR Premix Ex Taq反应系统(TaKaRa), 反应体系为25 μL, 反应条件为94℃预变性2 min; 然后94℃变性15 s, 60℃退火31 s, 41个循环。对每个反应进行3次独立重复实验。以受体扬麦18为对照, 用2^-ΔΔCT方法^{[ 14]}计算转基因小麦根中 Ggt的相对含量。

用限制内切酶 SmaI和 SacI分别酶切载体pAHC25质粒DNA和中间载体pMD18-AcAMP-sn, 并回收目的片段, 用T₄ DNA连接酶连接回收的载体片段(约7818 bp)和 AcAMP-sn基因片段(399 bp),构建单子叶表达载体pAHC25::AcAMP-sn (8217 bp), 其中 AcAMP-sn基因表达受玉米 Ubiquitin启动子控制。由图1和测序分析结果可知, 构建的重组表达载体pAHC25::AcAMP-sn是正确的, 可用于创制转基因小麦新材料。

通过基因枪将pAHC25::AcAMP-sn轰击小麦推广品种扬麦18的1600个幼胚愈伤组织, 经筛选、分化, 获得89株再生植株, 利用转基因特异性引物进行PCR分析, 检测出阳性植株10株, 转化率为0.62%。

利用特异性引物对转 AcAMP-sn基因小麦T₀~T₄代植株的PCR检测表明, 该引物可以从转 AcAMP-sn基因载体质粒和转 AcAMP-sn基因小麦阳性植株中扩增出438 bp的目的片段。在5个株系(A3、A4、A8、A9和A13)的每代材料中均可以检测到转入的 AcAMP-sn基因(图2-a和2-b), 说明转入的 AcAMP-sn基因在这些转基因小麦株系中能稳定遗传; 在测试的5个抗全蚀病的T4代转基因株系117个植株中均能检测到外源 AcAMP-sn基因, 表明在这5个转基因小麦株系中转入的 AcAMP-sn基因已趋于纯合。

图2

Fig. 2

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图2 转 AcAMP-sn基因小麦T3(a)及T4(b)代植株的PCR检测结果M: 100 bp DNA ladder; P: 转基因载体质粒pAHC25::AcAMP-sn; CK: H2O; WT: 未转基因扬麦18; 1~15: 转 AcAMP-sn基因T3代植株; A3、A4、A8、A9、A13: 转 AcAMP-sn基因T4代植株。Fig. 2 PCR analyses on T3 (a) and T4 (b) plants of AcAMP-sn transgenic wheatM: 100 bp DNA ladder; P: AcAMP-sn transformed vector plasmid pAHC25::AcAMP-sn as positive control; CK: H2O; WT: untransformed Yangmai 18; 1-15: AcAMP-sn transgenic T3 plants; A3, A4, A8, A9, and A13: AcAMP-sn transgenic T4 plants.

半定量RT-PCR分析抗病的转基因小麦与未转基因小麦扬麦18根中 AcAMP-sn基因的转录水平表明, 这5个稳定遗传的转基因抗病株系(A3、A4、A8、A9和A13)根中 AcAMP-sn基因的转录水平明显高于受体扬麦18 (图3-a)。进一步利用Q-RT-PCR分析上述5个转基因抗病株系中 AcAMP-sn基因的相对表达量表明, 转基因植株根中 AcAMP-sn基因的相对表达量明显高于未转基因小麦, 但各转基因株系间的表达量有所差异, AcAMP-sn基因在转基因株系A4中的表达量最高、在A9中的表达量最低, 与半定量RT-PCR分析结果基本一致。

图3

Fig. 3

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	图3 转 AcAMP-sn基因小麦中根部 AcAMP-sn基因表达的半定量RT-PCR (a)和Q-RT-PCR (b)分析WT: 未转基因的扬麦18; A3~A13: 转 AcAMP-sn基因株系。 ** 转基因株系与WT有极显著差异( P<0.01)。Fig. 3 Semi-RT-PCR (a) and Q-RT-PCR (b) analysis on AcAMP-sn transcripts in transgenic and wild-type wheat plantsWT: wild-type Yangmai 18; A3-A13: AcAMP-sntransgenic lines. ** Significantly different between AcAMP-sntransgenic line and WT at P<0.01.

对转 AcAMP-sn基因T₄代植株的全蚀病抗性鉴定表明, 接种小麦全蚀病菌21 d后未转基因扬麦18出现典型的全蚀病病症(图4), 病根百分比为59.63%, 全蚀病病情指数为72.73; 而5个转 AcAMP-sn基因小麦株系A3、A4、A9、A13和A8的病根百分比为10.46%~19.61%, 全蚀病病情指数分别为18.75、14.29、27.78、28.00和28.75, 均极显著( P<0.01)低于受体扬麦18 (表1)。进一步利用半定量RT-PCR与Q-RT-PCR分析接种 Ggt 21 d的上述转 AcAMP-sn基因小麦根中全蚀病菌的相对含量, 结果表明这些抗病植株中全蚀菌的生物量显著低于未转基因受体, 且 AcAMP-sn基因表达最强的株系(A4)根中全蚀病菌含量最低(图5-a和5-b)。以上结果说明 AcAMP-sn过表达显著增强了转基因小麦对全蚀病的抗性。

图4

Fig. 4

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	图4 接种小麦全蚀病菌21 d后转 AcAMP-sn基因小麦T4代植株与受体扬麦18植株的全蚀病表型WT: 未转基因的扬麦18; A3、A4、A13: 转 AcAMP-sn基因株系。Fig. 4 Phenotypes of take-all in AcAMP-sn transgenic wheat lines and untransformed Yangmai 18 at 21 days after Ggt inoculationWT: untransformed Yangmai 18; A3, A4, and A13: AcAMP-sntransgenic lines.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 转 AcAMP-sn基因小麦及受体扬麦18的全蚀病鉴定结果 Table 1 Take-all resistance in AcAMP-sn transgenic and control wheat lines 株系 Transgenic line 病根百分比 Disease severity (%) 病情指数 Disease index A3 10.46** 18.75** A4 12.04** 14.29** A8 19.61** 28.75** A9 15.86** 27.78** A13 13.94** 28.00** WT 59.63 72.73 WT: 未转化扬麦18 (受体)。**转基因株系与WT有显著差异( P<0.01)。 WT: untransformed Yangmai 18 (recipient).**Significantly different between AcAMP-sn transgenic wheat line and WT at P< 0.01.

表1 转 AcAMP-sn基因小麦及受体扬麦18的全蚀病鉴定结果 Table 1 Take-all resistance in AcAMP-sn transgenic and control wheat lines

图5

Fig. 5

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图5 接种全蚀病菌21 d后转 AcAMP-sn基因与受体小麦扬麦18中该病菌相对丰度的半定量RT-PCR (a)和Q-RT-PCR (b)分析WT为未转基因的扬麦18; 其他为转 AcAMP-sn基因株系。 ** 转基因株系与WT有极显著差异( P<0.01)。Fig. 5 Relative abundance of Ggt in AcAMP-sn transgenic wheat lines relative to that in untransformed Yangmai 18 via semi RT-PCR (a) and Q-RT-PCR (b) at 21 d after inoculationWT is the untransformed Yangmai 18, and other lines are AcAMP-sntransgenic lines. ** Significantly different between AcAMP-sntransgenic line and WT at P<0.01.