将玉米B73自交系种子置蒸馏水浸湿的纱布上, 于28℃暗培养2 d后, 种植于盛有搅拌均匀的花土和蛭石的小花盆中, 在28℃、12 h/12 h光周期条件下培养。参考Ying等^{[ 11]}的ABA、NaCl和干旱处理方法并加以改进: 取三叶一心期的幼苗, 将根部浸没在100 μmol L^-1 ABA和150 mmol L^-1 NaCl溶液中, 并以溶剂浸根为对照, 分别于处理0、2、6和12 h后取样; 另从土中取出同时期幼苗, 在室温下自然干燥, 分别于植株失水量达到鲜重的20%、40%和60%时取样, 并取土壤中正常生长的植株叶片为对照。将各组样品立即用液氮冷冻并于-70℃保存。

用总RNA提取试剂盒(TRIzol Reagent, TaKaRa)提取样品总RNA, 并用DNase I (TaKaRa)纯化。按照SuperScript III反转录酶(Invitrogen)说明书合成第一链cDNA, 作为基因扩增及荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR, qRT-PCR)的模板。

以正常条件下生长的三叶一心期B73自交系玉米幼苗的cDNA为材料, 用基因特异性引物ZmbZIP81-F和ZmbZIP81-R (表1)和高保真的Phusion High-Fidelity DNA聚合酶(NEB)进行基因扩增, 反应程序为98℃预变性30 s, 之后进入循环程序98℃ 10 s, 62℃ 20 s, 72℃ 45 s, 退火温度每隔一个循环降低1℃, 至49℃, 最后72℃延伸10 min的Touchdown程序。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测, 并回收目的条带。产物连接Gateway载体pENTR/ D-TOPO (Invitrogen), 转化大肠杆菌感受态TOP10, 经菌液PCR筛选阳性克隆, 测序验证。测序正确的中间载体通过LR反应(LR克隆酶, Invitrogen)将扩增片段连入植物表达载体pLeela (Invitrogen), 测序验证。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 所用引物 Table 1 Primers used in this study 引物 Primer 引物序列 Sequence information (5°-3°) 用途 Function ZmbZIP81-F CACCGACTGTCTGAAGTTTTGCCC 基因克隆 ZmbZIP81-R CACGCACAATCACCTAAATGTTTTC Gene cloning qRT-ZmbZIP81-F CTAGGGACAGGAAACAGGCC 荧光定量PCR, 反转录PCR qRT-ZmbZIP81-R TACCATTCCATGGAGTTGTTTC Real-time PCR, RT-PCR qRT-β-tubulin-F GCTATCCTGTGATCTGCCCTGA 玉米内参照基因 qRT-β-tubulin-R CGCCAAACTTAATAACCCAGTA Reference gene as control in maize RT-actin7-F CCGGTATTGTGCTCGATTCTG 拟南芥内参照基因 RT-actin7-R TTCCCGTTCTGCGGTAGTGG Reference gene as control in Arabidopsis

表1 所用引物 Table 1 Primers used in this study

利用ZmGDB (http://www.plantgdb.org/ZmGDB/)数据库搜索 ZmbZIP81基因及其所编码的蛋白序列, 并通过PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在线服务器查找并分析其启动子区ABA与胁迫相关信号响应元件。利用TAIR (http://www.arabidopsis.org/)数据库查找拟南芥中A亚族bZIP转录因子蛋白序列。使用ClustalX 2.0对ZmbZIP81和拟南芥A亚族bZIP蛋白进行多重序列比对^{[ 13]}, 用GeneDoc对比对结果进行保守序列分析, 用MEGA5构建由Bootstrap检测(1000次抽样)的系统发育树^{[ 14]}。利用MEME (http://meme.nbcr.net/meme/cgi-bin/meme.cgi)在线服务器分析保守结构域^{[ 15]}。

以ABA、NaCl和干旱处理条件下的三叶一心期B73自交系玉米幼苗和对照组的cDNA为材料, 采用Toyobo公司SYBR Green Master Mix进行qRT-PCR扩增, 反应体系含cDNA 1 μL、2×SYBR Green Master Mix 7.5 μL、引物(10 pmol μL^-1)各0.3 μL、ddH₂O 5.9 μL。以玉米 β-tubulin为内参, 以qRT- ZmbZIP81-F和qRT-ZmbZIP81-R, qRT-β-tubulin-F和qRT-β-tubulin-R (表1)为引物, 用Eppendorf公司Realplex PCR仪实时定量检测基因表达。反应程序为94℃预变性30 s, 之后94℃ 5 s, 55℃ 30 s, 72℃ 20 s, 共40个循环。采用2^-ΔΔCt法分析基因相对表达量^{[ 16]}。

将植物表达载体转化农杆菌菌株GV3101 (pMP90RK), 得到的阳性菌克隆经PCR验证后采用浸花法侵染野生型拟南芥(Col)植株, 收获成熟T₀代种子。T₀代种子经消毒后, 点播在MS选择培养基(含100 μg mL^-1草甘膦)上筛选抗性植株, 种植收种。在相同选择培养基上筛选T₁代种子抗性与非抗性植株符合3∶1分离比例的单株, 经一代种植后选择在相同选择培养基上不发生分离的T₂代抗性株系种子进行进一步分析。

为分析转基因株系中 ZmbZIP81的表达量, 将各转基因株系与野生型种子播于MS培养基上, 4℃春化3 d后, 在22℃、16 h/8 h光周期条件下培养10 d, 取整株幼苗如前述方法提取总RNA, 并合成第一链cDNA, 进行RT-PCR扩增, 反应体系为cDNA 1 μL、2× Taq Mix 5 μL、引物 (10 pmol μL^-1) 各0.5 μL、ddH₂O 3 μL。以拟南芥 Actin7为内参, 用引物qRT-ZmbZIP81-F和qRT-ZmbZIP81-R、RT-actin7-F和RT-actin7-R (表1)分别扩增 ZmbZIP81基因序列和内参序列, 反应程序为94℃预变性30 s, 之后94℃ 10 s, 55℃ 30 s, 72℃ 20 s, 共25个循环。对PCR产物进行切胶回收与测序验证。

参考Ying等^{[ 11]}的ABA和NaCl处理方法并加以改进。将T₂代转 ZmbZIP81基因的拟南芥与野生型种子以70%酒精30 s、7% NaClO 15 min消毒后分别播于含5 μmol L^-1 ABA及200 mmol L^-1 NaCl的MS培养基上, 以未加ABA和NaCl的MS培养基为对照, 4℃春化3 d后, 在22℃、16 h/8 h光周期条件下培养并于每24 h统计萌发率, 总共统计7 d。另将转基因拟南芥与野生型种子经同样方法消毒后播于MS培养基上, 4℃春化3 d后, 在22℃、16 h/8 h光周期条件下培养3 d, 选取长势相同的幼苗分别移至含有50 μmol L^-1 ABA及150 mmol L^-1 NaCl的MS培养基上, 以未加ABA和NaCl的MS培养基为对照, 生长一段时间后观察转基因植株和野生型植株的表型差异。

ZmbZIP81基因位于玉米第6染色体, 编码区全长2492 bp, 具有4段外显子区和3段内含子区, 编码254个氨基酸(图1-A)。除亮氨酸拉链结构域外, ZmbZIP81蛋白还包含2个保守域Motif 1和Motif 2 (图1-B), 它们是一些蛋白激酶的结合位点。2个保守域中各自包含钙依赖的蛋白激酶(CDPK)等的结合位点R-X-X-S/T, 以及酪蛋白激酶II (CK II)的结合位点S/T-X-X-E/D。此外, 对 ZmbZIP81基因的启动子区分析发现2个分别位于-751 bp和-460 bp的ABRE元件、1个位于-1051 bp的干旱胁迫信号响应的DRE元件和1个位于-133 bp的MYB类转录因子特异性识别的CCAAT-box元件(图1-A), 表明该基因的表达可能受ABA与胁迫信号的调控。将ZmbZIP81的氨基酸序列与拟南芥中A亚族bZIPs进行多重序列比对(图2), 发现它们具有高度保守的序列和结构域。系统发育分析表明, ZmbZIP81与拟南芥中GBF4和bZIP13亲缘关系最近(图3), 且序列相似性最高, 均为42%, 而与ZmABI5和ZmbZIP72亲缘关系相对较远(未列出)。GBF4是一种能与基因启动子区G-box结合的转录因子^{[ 4]}, 但其具体功能还未见报道。

图1

Fig. 1

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	图1 ZmbZIP81基因(A)与编码蛋白(B)结构示意图Fig. 1 Gene structure of ZmbZIP81 (A) and conserved domains of the protein encoded (B)

图2

Fig. 2

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	图2 ZmbZIP81和拟南芥A亚族bZIP转录因子的多重序列比对Fig. 2 Alignment of ZmbZIP81 and A subfamily bZIP transcription factors in Arabidopsis

图3

Fig. 3

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	图3 ZmbZIP81和拟南芥A亚族bZIP转录因子的系统发育树Fig. 3 Phylogenetic tree of ZmbZIP81 and A subfamily bZIPs in Arabidopsis

以三叶一心期玉米幼苗为材料, 分析 ZmbZIP81基因对ABA、NaCl和干旱处理的应答表明, 上述处理均可诱导 ZmbZIP81的表达, 并且随处理时间的延长和程度的加重表达量逐渐升高(图4)。经ABA和NaCl分别处理12 h和6 h后, ZmbZIP81基因表达开始明显上调, 且两种胁迫处理12 h后, ZmbZIP81表达量达到对照组的近2倍(图4-A, B)。ABA处理2 h时表达量虽有下降, 经分析与对照组无显著性差异。干旱处理下, 当叶片失水率达到20%和40%时, ZmbZIP81表达量上调约1.5倍; 而失水率达到60%时, 表达量可达初始水平的3.65倍(图4-C)。说明 ZmbZIP 81基因的表达受ABA、NaCl和干旱胁迫的诱导。

图4

Fig. 4

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图4 ZmbZIP81基因在ABA、NaCl和干旱处理条件下的表达A: ABA处理(100 μmol L-1); B: NaCl处理(150 mmol L-1); C: 干旱处理。各处理条件下, ZmbZIP81基因的相对表达量是对照的倍数。Fig. 4 Expression of ZmbZIP81 in maize under ABA, salt, and drought treatmentsA: Treatment of MS+ABA (100 μmol L-1); B: Treatment of MS+NaCl (150 mmol L-1); C: Drought treatment. The relative expression level of ZmbZIP81 under each treatment represents fold change towards the control.

为进一步研究ZmbZIP81转录因子的功能, 构建了 35SS::ZmbZIP81的植物表达载体, 其结构如图5-A所示, 并采用农杆菌介导法转化拟南芥, 经抗生素筛选与基因组PCR验证获得了纯合单拷贝T₂代过表达拟南芥株系OE-5、OE-9和OE-11。半定量RT-PCR验证结果如图5-B所示, 在3个过表达株系中检测到特异目的条带, 而在野生型拟南芥中未检测到。所用引物的特异性已通过对PCR产物的切胶回收与测序进行验证。以上结果表明 ZmbZIP81确已转化成功并获得稳定遗传的株系。

图5

Fig. 5

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图5 ZmbZIP81过表达载体示意图(A)和 35SS::ZmbZIP81转基因株系的RT-PCR结果(B) p35SS: ZmbZIP81基因启动子; pA35S: ZmbZIP81基因终止子; Pat: 草甘膦抗性基因; Nos-p: 草甘膦抗性基因启动子; Nos-T: 草甘膦抗性基因终止子; attB1和attB2: LR反应重组位点; LB: 载体左边界; RB: 载体右边界。Fig. 5 Structure of ZmbZIP81-overexpressed vector (A) and analysis of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines (B) p35SS: promoter of ZmbZIP81; pA35S: terminator of ZmbZIP81; Pat: glyphosate resistance gene; Nos-p: promoter of glyphosate resistance gene; Nos-T: terminator of glyphosate resistance gene; attB1 and attB2: LR recombination sites; LB: left border; RB: right border.

在B73自交系中, ZmbZIP81基因表达显示出受ABA诱导上调的特性(图4)。为验证ZmbZIP81的功能是否与ABA敏感性存在关联, 分析了过表达 ZmbZIP81的拟南芥株系的ABA敏感性。如图6-A, B所示, 在5 μmol L^-1 ABA处理下, 3个过表达株系种子萌发率均显著高于野生型, 如OE-5、OE-9和OE-11转基因株系在第7天的萌发率分别为56.5%、36.6%和56.9%, 而野生型只有14.0%; 在对照组培养基上生长的3个转基因株系与野生型种子萌发率基本一致, 表明过表达株系种子萌发对ABA的敏感性降低。另外, 当3 d苗龄的拟南芥幼苗移至含有50 μmol L^-1 ABA的MS培养基上25 d后, 野生型拟南芥黄化较明显, 且部分植株已死亡, 其平均根长为2.8 cm, 存活率为61.9%; 而3个转基因株系叶片相对大而绿, 几乎全部存活, 平均根长分别为2.9、3.9和4.5 cm, 分析表明OE-9和OE-11两株系根显著长于野生型, 3个株系的存活率分别为95.2%、100%和100%, 同期的对照组幼苗长势始终一致(图7-A, B)。以上结果说明, 在种子萌发期与幼苗期, 与野生型相比, ZmbZIP81过表达拟南芥的ABA敏感性降低。因此推测ZmbZIP81可能作为ABA信号途径的负调控因子参与植物抗逆调控网络。

图6

Fig. 6

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	图6 ABA和NaCl处理条件下 35SS::ZmbZIP81转基因拟南芥种子萌发率统计A: MS培养基; B: ABA处理 (5 μmol L-1); C: NaCl处理 (200 mmol L-1)。Fig. 6 Germination assays of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines of Arabidopsis under ABA and salt treatmentsA: MS medium; B: MS+ABA (5 μmol L-1); C: MS+NaCl (200 mmol L-1).

图7

Fig. 7

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	图7 ABA和NaCl处理条件下 35SS::ZmbZIP81转基因拟南芥幼苗期生长表型A: MS培养基; B: ABA处理 (50 μmol L-1); C: NaCl处理 (150 mmol L-1)。Fig. 7 Photographs of 35SS::ZmbZIP81 transgenic lines in seedling stage under ABA and salt treatmentsA: MS medium; B: MS+ABA (50 μmol L-1); C: MS+NaCl (150 mmol L-1).

植物的抗逆性与ABA信号途径密切相关。在逆境胁迫下, 植物体可以通过改变内源ABA水平调控逆境胁迫相关基因的表达, 从而提高对逆境胁迫的适应性。种子萌发期耐盐性分析表明, 在含有200 mmol L^-1 NaCl的MS培养基上, 各植物株系的萌发率在第7天均可达到100%, 但过表达株系种子萌发明显快于野生型, 如第4天OE-5、OE-9和OE-11三个株系萌发率分别为68.4%、84.9%和75.0%, 而野生型只有54.2%, 经检测差异达到显著水平; 在只含有MS的对照组培养基上生长的3个转基因株系与野生型种子萌发率基本一致, 第2天即可达近100% (图6-A, C)。而对过表达株系的幼苗期抗盐胁迫能力检测表明, 在150 mmol L^-1 NaCl处理30 d后, 各转基因株系拟南芥幼苗长势与野生型无明显差异, 抗盐性基本一致(图7-A, C)。以上结果说明, 与野生型相比, ZmbZIP81过表达拟南芥对盐胁迫的抗性有一定程度的提高, 而这种抗性的提高只体现在种子萌发期, 不体现于幼苗期。因此推测 ZmbZIP81基因可能并不参与植物幼苗期的盐胁迫反应, 而只在种子萌发期发挥抗盐作用。我们还同时采用40% PEG-8000模拟的渗透胁迫分析了转基因拟南芥萌发期与幼苗期的抗旱性, 结果显示, 渗透胁迫下, 转基因拟南芥与野生型在种子萌发期以及幼苗期的长势基本一致(未列出), 表明 ZmbZIP81基因在植物抗旱性方面可能无明显作用。