以中国农业科学院作物科学研究所培育的中品03-5373和中黄13分别为母本和父本杂交, 2007年构建获得含有254个单株的F₂群体, 以株行混收法繁殖F_3-4, 单粒传法繁殖F₅-F₁₀, 建立F_5:10重组自交系群体^[17]。中品03-5373的来源可追踪到10个亲本, 包括Peking、灰皮支黑豆、PI437654、Hartwig、Forrest、Lee、晋1265、Hill、Dyer和Bragg, 系谱关系如图1^[16]。

图1

Fig. 1

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	图1 中品03-5373的系谱各品种对3号小种的抗性标于品种名称的下方。Fig. 1 Pedigree chart of Zhongpin 03-5373The resistances to SCN race 3 in each variety are labeled under the variety name.

2011年5月上旬在黑龙江哈尔滨试验基地鉴定重组自交系群体的亲本和254个F_5:10家系对大豆胞囊线虫3号生理小种的抗性。试验采用完全随机区组设计, 单行区, 3次重复, 行长2.0 m, 行距0.5 m, 株距0.1 m。每40行设置2个亲本作为对照, 出苗后28~35 d从每株行随机挖取10株, 统计每株胞囊数。大田管理同一般大田。同时病土盆栽鉴定1次, 病土取自田间自然病圃, 将病土充分混合后装入直径为15 cm的花盆, 每盆留苗5株, 每品种播3盆。出苗后28~35 d扣盆调查每株根系胞囊数。根据每株平均胞囊数计算胞囊指数[female index (FI), FI=100× 群体株行胞囊平均数/感病亲本(中黄13)株行平均数]^[18]划分品种的抗性等级, FI=0的为免疫(immune, I); 0< FI≤ 10的为高抗(high resistant, HR); 10< FI≤ 30的为中抗(medium resistant, MR); 30< FI≤ 60的为中感(medium susceptible, MS); FI≥ 60的为高感(high susceptible, HS)^[19]。2013年重复鉴定2011年鉴定的病株系。

1.3.1 DNA提取 利用快速提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取254个重组自交系及其亲本和中品03-5373系谱材料嫩叶的基因组DNA^[17]。

1.3.2 重组自交系的分子标记鉴定 采用167个SSR^[20]、4个EST-SSR^[17]、24个InDel^[17]和311个SNP^[17]等共506分子标记鉴定RIL群体的基因型^[16]。

1.3.3 SNP标记鉴定 选择定位区间侧翼SNP标记, 参照Illumina公司GoldGate assay方法对11份系谱材料进行鉴定^[21]。

1.4.1 表型分析 利用SAS软件Proc Mixed Asycov分析大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的广义遗传力H² [h²=100%× 遗传方差(V_g)/表型方差(V_p)]; 用SAS软件Statistics分析表型方差等基本统计量。

1.4.2 QTL定位 利用QTL IciMapping V3.2^[22]构建连锁图, 利用Grouping命令, 将LOD值设为3.0, 默认最大遗传距离超过50 cM后进行重新分组, 使用Ordering算法对连锁群上的分子标记排序, 通过Rippling命令中的SALOD重新梳理连锁群上标记的遗传距离及相对应的位置, 最后利用Kosambi函数将计算的重组率同遗传距离转换, 参考大豆公共图谱整合的染色体标记^[23], 通过MapChart2.2软件^[24]绘制遗传连锁图。

利用完备区间作图方法^[22]对数据进行加性及上位性QTL的检测, 使步长按照1 cM运行, 并且将LOD临界值设为2.5, 即当实际求得的LOD值大于2.5时, 就认为该区段存在1个QTL。假设在不同环境中同时存在相同性状的QTL, 则认为这是“ 一致性QTL” ; 为了确保QTL所在区间的准确性, 一般将不同环境下均能检测到的相邻区间内的QTL, 选取其能覆盖所有QTL的最大区间; 按照性状名称+染色体命名QTL。

1.4.3 区间SNP位点遗传分析 通过系谱追踪方法分析定位区间侧翼SNP标记与3号小种抗性的关联情况^[25]。

田间病圃和温室的3号生理小种病土鉴定结果表明, 中品03-5373和中黄13分别表现免疫和高感。对重组自交系群体进行大田鉴定和温室鉴定, 重复间差异不显著, 而家系间差异极显著(P< 0.01)(表1)。254个家系的胞囊指数变异范围为0.144~291.800, 平均值为93.94, 介于2个亲本之间但趋于感病(图2)。抗、感家系数量比为6.97, 呈现偏分离。抗大豆胞囊线虫3号生理小种的广义遗传力较高, 为55.8%。

图2

Fig. 2

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	图2 中品03-5373和中黄13衍生的RIL家系对大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的分布Fig. 2 Distribution for resistance to SCN3 in RIL population derived from the cross of Zhongpin 03-5373 and Zhonghuang 13

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 4个重复的胞囊指数统计量分析 Table 1 Statistic analysis of the femal index for four repetitions 重复名称 Code of repetition 胞囊指数 Femal index 峰值 Kurtosis 偏斜度 Skewness 重复间方差的P值 P-value for the variance of repetitions 平均值 Average 变异范围 Range of variation DT1 93.9 2-406 1.69 1.15 0.06 DT 2 99.3 2-287 3.21 1.31 DT 3 81.4 3-629 10.67 2.34 WS 4 91.8 1-456 2.19 1.20 DT: identification in the field; WS: identification in the green house. DT: 大田鉴定; WS: 温室鉴定。

表1 4个重复的胞囊指数统计量分析 Table 1 Statistic analysis of the femal index for four repetitions

在11份中品03-5373系谱材料中, 有9份表现免疫和高抗, 除Dyer为高抗外, 其他皆为免疫, 包括3个主要抗源Peking, PI437654和灰皮支黑豆。其余3份皆表现高感(表2和图1)。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 ZP03-5373祖先亲本对SCN 3号生理小种的抗性鉴定 Table 2 Resistance identification of ZP03-5373 ancestors to SCN3 系谱材料 Ancestor material Peking Hill Lee Dyer Bragg Forrest PI437654 Hartwig 灰皮支黑豆 Huipizhiheidou 晋1265 Jin 1265 中品03-5373 Zhongpin 03-5373 胞囊个数 Number of cyst 0 49.6 52.1 1.9 45 0 0 0 0 0 0 胞囊指数 FI (%) 0 95.2 100 3.6 86.4 0 0 0 0 0 0 抗病等级 Grade I HS HS HR HS I I I I I I I: immune; HR: high resistant; HS: high susceptible. I: 免疫; HR: 高抗; HS: 高感。

表2 ZP03-5373祖先亲本对SCN 3号生理小种的抗性鉴定 Table 2 Resistance identification of ZP03-5373 ancestors to SCN3

根据2011和2012年大豆胞囊线虫3号小种抗性鉴定结果, 采用ICIM方法共检测到3个QTL (SCN3-7、SCN3-11、SCN3-18), 分别位于Gm07、Gm11和Gm18 (表3和图3), 其中SCN3-7位于Gm07, 侧翼标记为Map-1385和Map-1395, 二者间的遗传距离为9.44 cM, 物理距离为2.23 Mb, 对表型的贡献率为6.6%, 为微效QTL; SCN3-11位于Gm11, 侧翼标记为Map-2068和Map-2071, 二者间的遗传距离为6.31 cM, 物理距离为587 kb, 对表型贡献率为5.2%, 为微效QTL; SCN3-7和SCN3- 11QTL区间未见报道, 可能为新基因; SCN3-18位于Gm18, 侧翼标记为Map-3448和Map-3450, 二者间的遗传距离为0.6 cM, 物理距离为232 kb, 可解释的表型变异为28.9%, 为主效QTL, 该位点与标记satt309紧密连锁, 距离两侧标记的遗传距离分别为1.22 cM和1.82 cM, 覆盖已报道的rhg1-b区间^[27]。上位性分析发现SCN3-7位点与SCN3-18位点存在显著的上位性互作, 上位性效应为0.17, 表明在分子育种中利用SCN3-18 (rhg1-b)时要考虑其互作位点SCN3-7的作用。

图3

Fig. 3

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	图3 以中品03-5373和中黄13衍生的重组自交系定位大豆胞囊线虫3号生理小种抗性的QTLFig. 3 QTLs resistant to SCN3 identified in RIL population from the cross between ZP03-5373 and ZH13

表3

Table 3

表3(Table 3)

表3 运用ICIM方法检测到的与大豆抗大豆胞囊线虫相关的加性QTL Table 3 QTLs associated with the resistance to SCN 3 of soybean identified using ICIM in soybean 位点 Locus 连锁群 Linkage group 染色体 Chr. 标记/标记区间 Marker interval 物理位置 Physical position (bp) LOD值 LOD value 贡献率 PVE (%) 加性效应 Additive effect SCN3-7 M 7 Map-1385-Map-1395 38 093 920-40 320 836 3.4 6.6 0.13 SCN3-11 B1 11 Map-2068-Map-2071 36 848 383-37 434 951 2.9 5.2 0.11 SCN3-18 G 18 Map-3448-Map-3450 1 205 657-1 438 075 19.9 28.9 0.29

表3 运用ICIM方法检测到的与大豆抗大豆胞囊线虫相关的加性QTL Table 3 QTLs associated with the resistance to SCN 3 of soybean identified using ICIM in soybean

2个控制3号小种抗性的QTL (SCN3-7和SCN3-11)有4个侧翼标记(Map-1385和Map-1395; Map-2068和Map-2071)。在中品03-5373 (ZP03-5373) 的系谱群体中对这些标记追踪, 系谱材料中抗病亲本皆携带SCN3-7侧翼SNP位点(Map-1385)的抗病基因型C/C和SCN3-11侧翼SNP位点(Map-2071)的抗病基因型A/A和A/G, 而感病亲本皆携带Map-1385的感病等位变异A/A和G/G, 进一步证明该位点与大豆胞囊线虫3号抗性相关(图4)。

图4

Fig. 4

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	图4 QTL区间侧翼SNP位点抗病基因型在系谱材料中的传递路线Fig. 4 Transmit route of franked SNP makers of QTL in ZP03-5373 ancestors materials