样品为温室中生长至60 d的津田芜菁(Brassica rapaL. cv. Tsuda)膨大根部的白色根皮(不见光)、红色根皮(自然光下)、叶片, 以及长至5个月的津田芜菁花瓣和花蕾(0.8 cm), 另取60 d的津田芜菁白色根皮用UV-A光(352 nm, 15 W m^-2)处理1、3、6和24 h。将样品放在液氮中速冻后于-80℃超低温冰箱贮存待用。将UV-A光照处理的根皮(1 cm× 1 cm)置色素提取液(含1%盐酸的甲醇溶液)中, 4℃放置24 h^[9]。测定样品在530 nm的光吸收。以OD值表示花色素苷的含量, 重复测定3次, 生物学重复3次。

以芜菁根白色根皮、UV-A处理过的白色根皮, 红色根皮、叶片、花瓣和花蕾为试验材料, 采用CTAB法提取各组织总RNA, 检测RNA质量和浓度后, 取红色根皮1 µ g的总RNA用于cDNA第1链的合成。

参照TaKaRa公司的RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3.0试剂盒说明书合成cDNA第1链。依据GenBank中亲缘关系相近的物种拟南芥AtRUB1基因的核苷酸序列, 应用PrimerPremier 5.0设计引物BrRUB1-F: 5′ -GAGAATTTAAGCAAGAAAAG-3′ ; BrRUB1-R: 5′ -ACAGCAAAGCATCAGACC-3′ , 由华大生物公司合成。以cDNA第一链为模板。PCR条件为94℃ 3 min 预变性, 94℃ 30 s, 52℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个扩增循环, 最后72℃延伸10 min。PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶检测、回收目的条带, 与pGEM-T Vector (Promega)链接, 16℃过夜, 连接产物转化到大肠杆菌TOP10, 在X-gal/IPTG琼脂糖平板上挑选阳性克隆, 并进行PCR和酶切鉴定, 采用Amersham phamacia Biotech Inc.提供的MegaBACE 500毛细管自动测序仪测序。测序引物分别为pGEM-T载体引物T7和SP6, 完成测序。

在已获得ORF序列的基础上利用cDNA末端快速扩增(RACE)法克隆3'-DNA序列^[10], 以红色根皮1 μ g总RNA为模板, 以oligo(dT)₁₇接头引物5′ -GACTCGAGTGCACATCG(T)₁₇-3′ 及反转录酶III (Invitrogen)合成第一链cDNA。参考已获得的ORF序列设计的5′ 引物BrRUB1-F: 5′ -ATTGATCGCA TCAAGGAGCG-3′ 和接头引物5′ -GACTCGAGTGC ACATCG-3′ 进行PCR扩增。扩增条件为94℃预变性5 min, 随后30个循环, 每循环94℃变性30 s、54℃退火扩增30 s、72℃延伸90 s, 完成最后一个循环后, 72℃延伸10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶检测, 回收纯化、克隆、质粒提取、测序同cDNA克隆。

根据获得的基因序列设计拼接引物BrRUB1- cDNA-F: 5′ -GAGAATTTAAGCAAGAAAAG-3′ 和接头引物克隆该基因全长cDNA。PCR产物的回收纯化、克隆、质粒提取、测序同cDNA克隆。

BrRUB1基因序列同源性比对由NCBI的nucleotide BlastN程序进行(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/)。BrRUB1保守性功能域分析由NCBI的protein BlastP程序进行(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/)。核定位信号分析由SignalP4.1程序预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。进化树的构建由MEGA5程序完成。

取津田芜菁新鲜的嫩叶, 用CTAB法提取基因组DNA。根据所得的BrRUB1全长cDNA序列, 分2段设计特异性引物BrRUB1-D1-F: 5′ -ATGCAGAT CTTCGTCAAAACCCTGAC-3′ 、BrRUB1-D1-R: 5′ -T CCCCACCAAAACCAGAAGAGATC-3′ , 用LA Taq DNA聚合酶(TaKaRa)进行PCR扩增。反应条件为94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸2 min, 35个循环后, 72℃延伸7 min。PCR产物经回收, 插入peasy-T1载体, 转化到大肠杆菌Top10中, 选择阳性克隆测序。

用高保真酶和加有酶切位点的引物对测序验证过的含有目的基因的质粒DNA进行扩增, 凝胶电泳回收目的基因片段。用Sal I和Spe I双酶切PCR产物和pA7-GFP vector, 经回收、连接、转化、提取质粒DNA鉴定。利用真空渗透的方法将构建好的重组质粒(瞬时表达载体)转入洋葱表皮细胞, 取1.5 cm× 1.5 cm该洋葱表皮, 在培养基上面铺一层滤纸, 培养洋葱表皮细胞时, 培养16 h, 用Zeiss 510 nete激光共聚焦扫描显微镜观察。以激发波长为488 nm和505~550 nm扫描图像, 使用Zeiss LSM软件将其抓获, 并使用Adobe Photoshop软件处理系统, Mountain View, CA^[11]。

用7500 Real time PCR System (Applied Biosystems, 美国)检测BrRUB1基因在芜菁膨大根的白色根皮、红色根皮、叶片、花瓣、花蕾以及UV-A处理不同时间芜菁根白皮中的表达。所用BrRUB1引物为BrRUB1-F: 5′ -ATTATCCCTTCAAGCCACC-3′ ; BrRUB1-R: 5′ -AACGAGCAGATCGACAGC-3′ 。内标BrActin引物为BrActin-F: 5′ -GCTCAGTCCAAGAG AGGTATTC-3′ ; BrActin-R: 5′ -GCTCGTTGTAGAAA GTGTGATC-3′ 。所选用的试剂为ABI公司的High- Capacity cDNA Reverse Transcription Kits及Power SYBR Green PCR Master Mix。20 µ L反应体系中包括10 µ L Power SYBR Green PCR Master Mix, 8.4 µ L cDNA(稀释后), 正向引物和反向引物各0.8 µ L (10 µ mol L^-1)。采用的Real-time PCR程序为95℃ 30 s预变性, 40个扩增循环(95℃ 10 s, 60℃ 34 s), 从60℃加热到90℃的熔解过程。以BrActin的转录表达水平为内参, 目的基因相对转录表达水平为2^{-Δ Ct}, Δ C_t=C_t (目的基因) - C_t (Actin)。每个样品设3个试验重复, 生物学重复3次。

克隆到的BrRUB1基因的cDNA全长为650 bp, ORF区为471 bp, 编码156个氨基酸, 基因组全长945 bp, 含有3个外显子和2个内含子, 内含子为174 bp (intron1)和121 bp (intron2) (图1)。蛋白质基本性质分析工具(ProtParam)分析显示, BrRUBI蛋白质的分子量为17.413 kD; 等电点(pI)为5.77, 其中带负电荷的氨基酸残基为25个, 带正电荷的氨基酸残基有23个, 分子式为C₇₇₁H₁₂₈₃N₂₁₁O₂₄₀S₂, 原子总数是2507; 不稳定系数为38.15, 属于稳定蛋白; 代表亲水性的GRAVY值约为-0.383; 表明BrRUBI为亲水性蛋白; 蛋白质结构域的预测显示, BrRUB1具有UBQ-E2泛素结合酶位点, 与泛素、NEDD8高度相似, 属UBQ超家族。

图1

Fig. 1

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	图1 津田芜菁BrRUB1基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列(框内为内含子)Fig. 1 cDNA and deduced protein sequence of BrRUB1 from Tsuda (introns are boxed)

从NCBI数据可搜索拟南芥、玉山筷子芥和小麦等9个物种的10个RUB基因, 氨基酸序列同源性分析表明, BrRUB1与这10个RUB的同源性都很高, 达到90%以上。其中BrRUB1与同为双子叶、十字花科植物拟南芥的At RUB1(NP_564379.2)同源性最高达96%, 与玉山筷子芥的Al RUB1 (XP_002891151.1)同源性为95%, 与拟南芥的At RUB2(NP_565812.1)同源性为94%, 它们4个RUB1在进化上属于同一个进化分支。BrRUB1与其他科植物的RUB1同源性也很高, 与野生稻(XP_006660632.1)、谷子(XP_ 004965723.1)、大豆(NP_001276242.1)、番茄(XP_ 004248366.1)的同源性都为95%, 与小麦(EMS64626.1)、玉米(NP_001148606.1)的同源性都为94%, 这6个物种的RUB1则属于另一个进化分支(图2)。

图2

Fig. 2

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	图2 BrRUB1进化树分析用1000个重复进行BootStrap检验, 可信度超过25%的在接点部位标出。Fig. 2 BrRUB1 phylogenetic treeThe numbers next to the nods indicate bootstrap values of more than 25% support from 1000 replicates.

对BrRUB1氨基酸序列进行核定位信号预测, 结果显示该蛋白不具有核定位信号。我们构建了BrRUB1-GFP瞬时表达载体(图3), 将其转入洋葱表皮细胞中, 并获得了瞬间表达。利用激光共聚焦显微镜检测表明, 绿色荧光集中分布在细胞核中, 说明BrRUB1蛋白定位于细胞核(图4)。

图3

Fig. 3

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	图3 pBrRUB1-GFP表达载体示意图Fig. 3 Schematic diagram of pBrRUB1-GFP construct

图4

Fig. 4

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	图4 BrRUB1的亚细胞定位GFP和BrRUB1-GFP在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位。标尺为100 μ m。Fig. 4 Subcellular localization of BrRUB1Subcellular localization of GFP and BrRUB1-GFP in onion epidermal cells. Bar=100 μ m.

2.3.1 津田芜菁BrRUB1基因组织特异性表达

提取芜菁不同组织来源的总RNA, 以芜菁的Actin基因作为内参照, 对BrRUB1基因qRT-PCR分析。显示(图5), 津田芜菁BrRUB1在花蕾中表达量最高, 在花瓣中次之。在有花青素合成的红色根皮中有少量表达, 在叶和白色根皮中表达量最低。说明BrRUB1基因在芜菁中的表达有较高的组织表达特异性。

图5

Fig. 5

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	图5 qRT-PCR分析芜菁不同组织中BrRUB1基因的表达Fig. 5 Expression of BrRUB1 gene in various Tsuda tissues by qRT-PCR

2.3.2 UV-A光诱芜菁根皮中花青素含量检测

温室中长至60 d的津田芜菁, 取白色根皮进行UV-A光照诱导花青素合成, 分别取照射0、1、3、6和24 h后的样品检测。在UV-A光照诱导1 h后花青素含量未见明显升高, 3 h后有微量花青素开始合成, 并且在6 h和24 h后花青含量持续增高(图6)。

图6

Fig. 6

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	图6 UV-A光照诱导芜菁白色根皮花青素合成含量.Fig. 6 Content of anthocyanin in white root epidermis of Tsuda induced by UVA

2.3.3 UV-A光诱导BrRUB1在津田芜菁白根皮中的表达 津田芜菁根皮花青素合成受UV-A光的诱导(图6)。我们提取UV-A处理1、3、6和24 h后的津田芜菁肉质根皮总RNA, 以芜菁的Actin基因作为内参照, 对Br RUB1基因qRT-PCR分析显示(图7)白皮中BrRUB1的表达受UV-A光诱导, 长于1 h的使BrRUB1表达量增加, 处理6 h后表达量最高, 而处理24 h后BrRUB1的表达量较处理6 h明显下降。表明UV-A诱导BrRUB1的表达与UV-A光诱导花青素合成含量相一致, 花青素合成和BrRUB基因的表达趋势相比存在滞后, 这可能与启动花青素合成相关基因表达需要一定时间有关。

图7

Fig. 7

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	图7 qRT-PCR分析UV-A光照诱导芜菁白根皮BrRUB1基因表达Fig. 7 Expression of BrRUB1 gene induced by UV-A in white root epidermis by qRT-PCR assay