以拟南芥AVP1为诱饵, 采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库, 获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明, AVP1和AtRAB存在互作; 双分子荧光互补实验(BiFC)证明, AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、
H+-pyrophosphatase (H+-PPase) is an important proton transporter in plants. It cooperates with H+-ATPase and transport protons in vacuole or extracellular area to maintain a constant H+ gradient, which enables the transport of ions and other components (e.g. amino acids, carbohydrates). In the current research, AVP1 was applied to membrane proteins-based yeast two-hybrid system, and a small GTP-binding protein AtRAB was identified by screening the
氢离子焦磷酸化酶(H+-pyrophosphatase, H+- PPase)是一类不同于H+-ATPase的质子泵[ 1], 也是一种以焦磷酸(pyrophosphate, PPi)为底物的水解酶。焦磷酸化酶 (PPase)一般可以分为可溶性和不溶性两类, 前者主要存在于细胞质及胞液中, 后者主要结合在膜上(H+-PPase), 能够将焦磷酸(PPi)水解为2个Pi并生成能量。H+-PPase存在于植物、少数藻类及光合细菌[ 2]的液泡膜或细胞膜上[ 3, 4, 5, 6, 7], 能够与H+跨膜运输相耦联, 和H+-ATPase协同将胞质中的H+泵入液泡中[ 8], 使液泡和细胞质之间维持一定的H+梯度, 为离子和其他溶质(氨基酸、糖类等)的次级转运提供动力[ 9, 10]。有研究表明, 过表达H+-PPase基因能够提高拟南芥的耐盐性和抗旱性[ 11, 12, 13], 同时可以提高番茄、棉花、苹果等作物耐盐性及抗旱性[ 14, 15, 16, 17, 18]。 H+-PPase基因还能够提高水稻的抗寒性[ 19], 对黄瓜、烟草、小麦的重金属胁迫(如镉和铜)抗性也有重要作用[ 20, 21, 22]。另外, Li等[ 23]还发现 H+-PPase基因参与控制生长素的运输, 影响生长素相关的各种发育过程。 H+-PPase基因还参与苹果酸、可溶性糖的积累[ 24], 养分的有效存储需要有活性的H+-Ppase[ 25]。通过过表达 H+-PPase能够增强单子叶植物和双子叶植物对磷元素的吸收[ 26]。以上报道证明 H+-PPase基因广泛参与植物生长发育、抗逆反应、营养物质吸收、重金属耐性等各方面的过程。在作物抗逆、营养高效利用等遗传改良方面具有重要的应用价值。然而, 目前关于 H+-PPase基因的研究大都集中在基因功能以及生理机制研究方面, 调控机制鲜见报道。因此, 筛选与H+-PPase互作的蛋白并研究其功能对于揭示H+-PPase的作用机制具有重要的理论意义与实际意义。
本研究采用拟南芥氢离子焦磷酸化酶AVP1为诱饵筛选拟南芥cDNA文库, 筛选到一个AVP1互作蛋白小GTP结合蛋白AtRAB。通过比较 AVP1和 AtRAB拟南芥突变体在高盐、低磷、低钾胁迫条件下的表型, 分析 AtRAB对离子吸收的调控, 其结果有助于明确正向调控的抗逆反应及探索调控机制。
1.1.1 研究材料 拟南芥野生型(Columbia)由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种课题组提供, 拟南芥H+-焦磷酸化酶基因 AVP1突变体 avp1和小GTP结合蛋白 AtRAB突变体 rab购于 Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC)。
1.1.2 载体和菌株 克隆载体pZero Back/blunt Vector、大肠杆菌感受态TOP10购于天根生化科技(北京)有限公司。筛库所用表达载体pBT3N、pBT3STE、pPR3N和质粒pOst1-Nubl、pTSU2-APP、pNubG-Fe65及酵母菌株NMY51购于Dualsystems Biotech公司。拟南芥均一化cDNA文库由本实验室采集拟南芥整株包括根、茎、叶、花、果荚等所有组织经各种处理及提取RNA后构建。GFP载体、YFPN、YFPC载体由本实验室保存。
1.1.3 试剂 DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase, RT-PCR所用反转录试剂盒购于TaKaRa公司。基因克隆所用反转录试剂盒购于Invitrogen。限制性内切酶、T4连接酶购于Promega。DNA、RNA提取, 质粒提取, 琼脂糖凝胶DNA回收, 荧光定量试剂盒, DNA MarkerIII、D2000等采用天根生化科技(北京)有限公司或QIAGEN的相应产品。纤维素酶和果胶酶采用日本Yakult的产品。其他试剂购于Sigma、Amresco、Fermentas、BD、OXOID等公司, 分析纯试剂为国产。引物合成及DNA测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司承担。
膜蛋白酵母双杂交系统是由经典的酵母双杂交改进而来, 主要用于膜蛋白及胞质蛋白的筛选[ 27]。从拟南芥cDNA中扩增得到拟南芥H+-焦磷酸化酶基因 AVP1(At1g15690)的全长CDS序列, 并连接到pBT3STE载体上作为筛选cDNA文库的诱饵载体, 验证载体的自激活活性后进行筛库。筛库步骤及各种试剂的配制按照Dualsystems Biotech公司的Membrane系统进行(http://www.dualsystems.com/, P01201-P01229/P01301-P01329/P01401-P01429)。以筛库诱饵载体pBT3STE-AVP1转化NMY51酵母感受态细胞, 将拟南芥cDNA文库质粒转入, 将转化产物均匀涂布于SD/-Leu-Trp-His-Ade营养缺陷型培养基(四缺)平板上, 3 d后挑取单克隆摇菌后再重新点于外加X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上, 通过观察克隆显蓝情况判断报告基因 LacZ的表达情况。选取显蓝克隆(3个报告基因 His+、Ade+和 LacZ+都表达)进行酵母质粒提取, 将质粒重新转入大肠杆菌TOP10感受态中, 重新提取质粒后再转入酵母, 再点于外加X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上, 选取显蓝克隆测序。将所有测序结果用NCBI进行Blast比对。
以Blast序列比对得到一个与AVP1互作的蛋白AtRAB (小GTP结合蛋白, AT5G47200)。克隆 AtRAB全长CDS序列后将其连接到捕获载体pPR3N上, 将捕获载体pPR3N-RAB转化入含有诱饵载体pBT3STE-AVP1的NMY51酵母感受态细胞, 均匀涂布于SD/-Leu-Trp和SD/-Leu-Trp-His-Ade缺陷型培养基平板上, 30℃培养3~4 d。挑取单克隆用相应的SD/-Leu-Trp或SD/-Leu-Trp-His-Ade液体培养基摇菌至OD值 0.6~0.8之间。吸取1 μL菌液点于外加40 mmol L-1 X-α-gal的四缺筛选性培养基平板上, 30℃培养3~4 d, 通过观察是否显蓝来判断报告基因 LacZ+的表达与否。同时做好相应的阴性和阳性对照组。
将AVP1及AtRAB全长CDS序列(去除终止密码子)分别构建到GFP载体上融合表达, 构建成35S::AVP1-GFP和35S::AtRAB-GFP载体用与亚细胞定位观察。再将AVP1全长CDS序列构建到YFPN载体上融合表达, 将AtRAB全长CDS序列构建到YFPC载体上融合表达, 构建成35S::AVP1-YFPN和35S::AtRAB-YFPC载体用于体内双分子荧光互补(BiFC)表达载体。用原生质体转化法将对照质粒35S::GFP、35S::AVP1-GFP、35S::AtRAB-GFP分别转化拟南芥叶肉细胞原生质体; 将35S::AVP1-YFPN和35S::AtRAB-YFPC共同转化拟南芥叶肉细胞原生质体。黑暗条件下25℃培养18 h以上后用Zeiss LSM700激光共聚焦显微镜观察载体表达情况。
参照Gantlet (http://www.gantlet.org/)上的方法清洗、春化及种植拟南芥种子。得到小苗后取单株拟南芥叶片, 按照植物基因组DNA提取试剂盒的操作说明(天根)提取单株拟南芥叶片DNA。用T-DNA插入突变的检测方法[ 28]对突变体进行纯合鉴定, 通过http://signal.salk.edu/tdnaprimers.2.html设计T-DNA插入突变检测引物(表1)。
以RT-PCR分析得到的纯合突变体及WT的叶片, 按照RNAprep pure植物总RNA提取试剂盒的操作说明(天根, 北京)提取RNA, 按照PrimeScript RT Reagent Kit (Perfect real-time, TaKaRa)的操作说明进行反转录, 合成cDNA第一链, 将反转录后的模板稀释后用作荧光实时定量的模板。
采用SuperReal荧光定量预混试剂(SYBR Green, 天根)进行实时荧光定量PCR, 整个体系的配制应在避光条件下操作。于ABI7500荧光定量PCR仪上进行PCR。Real-time PCR采用三步法PCR扩增反应, PCR的预变性条件设定为95℃, 15 min。PCR采用95℃变性10 s, 60℃退火20 s, 72℃延伸32 s, 在72℃时采集荧光信号。采用RT-PCR方法检测 AtRAB和 AVP1在WT和突变体中的表达情况。
将WT、 rab和 avp1的纯合突变体种子消毒和春化处理后, 置培养室培养4~7 d, 在拟南芥长到2片子叶时分别移苗进行NaCl处理, 处理浓度为0 (MS)、50、100、150和200 mmol L-1。分别选取长势均匀一致的小苗转移到含有NaCl的培养基方皿(一次性使用)上, 4株苗为一组, 左边4株WT, 右边4株 avp1或 rab, 竖立, 倾斜3°培养7 d左右, 观察小苗生长状况, 并用WinRHIZO Pro 2012扫根软件配合EPSON Flatbed Scanner EPSON Expression 10000XL扫描仪扫描测量根长、侧根数及根分蘖数。
用1.6的方法对WT、 rab和 avp1的纯合突变体进行低磷和低钾处理。低磷培养基中磷的浓度梯度设为0、10、20、50和100 μmol L-1, MS作对照。低磷培养基配制时参照MS培养基的配方, 通过控制KH2PO4的量来控制低钾培养基中磷的浓度, 其他4种大量元素盐的量同MS。用KH2PO4设置低磷浓度梯度时减少的K+量用KCl来替代, 确保低磷培养基中磷元素以外其他元素都与MS中相同。低钾培养基同样使K+终浓度为这5个浓度梯度, 同时MS对作照。配制低钾培养基时也参照MS培养基的配方, 将大量元素中的KNO3去除, 通过控制KH2PO4的量来控制低钾培养基中K+的终浓度, 此时减少的PO43-的量用(NH4)2HPO4替代, KNO3中缺失NO3-的量用NH4NO3替代, 同时减去添加(NH4)2HPO4时多加入的NH4-的量, 确保低钾培养基中K元素以外其他元素都与MS中相同。
低磷、低钾培养方法同NaCl处理, 观察小苗生长状况, 并用WinRHIZO Pro 2012扫根软件配合扫描仪扫描测量根长、根表面积、侧根数及根分蘖数。
利用膜蛋白酵母双杂交系统筛选均一化拟南芥cDNA文库, 获得一个AVP1的互作蛋白, 经测序和NCBI Blast序列比对, 发现这是一个小GTP结合蛋白 AtRAB。将 AVP1和 AtRAB全长CDS序列克隆到酵母双杂交载体上进行互作验证, 将pPR3N-RAB (带有 AtRAB基因)转化含有诱饵载体pBT3STE- AVP1 (带有 AVP1基因)的NMY51酵母, 分别培养于双缺培养基(SD/-Leu-Trp)和四缺筛选培养基(SD/- Leu-Trp-His-Ade), 经过培养转化pPR3N-RAB和pBT3STE-AVP1的酵母可以在外加X-α-gal的四缺陷型上生长并显蓝, 除阳性对照外其他阴性对照组均不能生长(图1)。这说明AtRAB和AVP1蛋白可以在酵母中互作。
将分别转化有35S::GFP、35S::AVP1-GFP、35S:: AtRAB-GFP的拟南芥原生质体以及共转化有35S:: VP1-YFPN和35S::AtRAB-YFPC的原生质体置激光共聚焦显微镜下观察。发现, 转化有对照质粒35S:: GFP的充斥整个细胞(图2-A), 而AtRAB-GFP定位在细胞膜和细胞核中(图2-B), AVP1-GFP只定位在细胞膜上(图2-C)。而对于共转化有35S::AVP1-YFPN和35S::AtRAB-YFPC的原生质体细胞则能在其细胞膜和细胞核上观察到黄色荧光(图2-D), 这说明AVP1和AtRAB能在细胞膜和细胞核上发生互作。
通过查询拟南芥基因表达数据库AtGenExpress Visualization Tool (http://jsp.weigelworld.org/expviz/)分析 AVP1和 AtRAB在胁迫条件下的表达情况。结果发现在渗透处理条件下, AVP1在地上部分的表达逐渐下降, AtRAB的表达则上升明显, 而在根中这2个基因的表达量变化趋势不大, AtRAB略有上升。在盐处理条件下 AVP1在地上部分的表达量在1 h时开始下降, 在3 h时最低, 3 h后重新上升, 在根中的表达量则略有下降; 而 AtRAB在地上部分的表达量下降到3 h后有所上升, 在根中的表达量逐渐下降到6 h时达最低, 其后上升。在干旱胁迫下这2个基因在根中和地上部分的表达量均较稳定, 受干旱诱导表达变化不大(图3)。
取拟南芥突变体的单株叶片, 提取DNA用作PCR检测模板, 用检测T-DNA插入突变的方法鉴定拟南芥纯合突变体(图4)。通过RT-PCR检测获得 rab纯合突变体四株, avp1纯合突变体2株。对所得纯合突变体进行RT-PCR分析显示, 纯合突变体中 AtRAB和 AVP1的表达受到抑制, 基因功能缺失(图5)。
在MS培养基中添加NaCl后, 随着添加浓度的加大, 拟南芥WT和突变体 rab、 avp1都逐渐变小, 而突变体 rab和 avp1的生长特别是根部的生长相对于WT受到更明显的抑制, 突变体 rab与 avp1的表型相似(图6)。根系的扫描结果显示, 在200 mmol L-1NaCl处理条件下, 2个突变体在根长与侧根数方面低于WT, 证明这2个突变体对高盐胁迫的敏感性趋势相似, 但 rab对盐的敏感性相对更强一些。突变体相对于WT敏感性明显增强, 证明这2个基因都是正向参与植物的耐盐反应(图7)。
随着磷浓度的降低, WT和突变体 rab、 avp1的长势也都逐渐减弱, 突变体 rab和 avp1根部的生长相对于WT受到更多的抑制, rab和WT的差异, 达到极显著水平, 而 avp1比WT长势稍差, 差异没有达到显著水平, rab和 avp1的表型相似(图8)。对根系的扫描显示, 在20 μmol L-1、10 μmol L-1和无磷胁迫处理条件下, 2个突变体在根长、侧根数和根分蘖数等方面都低于WT。 avp1的根表面积虽略大于WT, 但差异不显著, 属正常误差范围。证明这2个突变体对低磷胁迫的敏感性相似, 突变体相对于WT敏感性增强, 证明这2个基因都是正向参与植物的耐低磷胁迫的响应(图9)。而随着 K浓度的逐渐降低, WT和突变体 rab、 avp1的长势同样变弱, 但WT的根系没有像低磷处理那样明显缩短, 突变体 rab和 avp1的根系随着钾浓度的降低变化不大, 维持在相似水平(图10)。根系扫描的结果显示, 在100、50和20 μmol L-1低钾处理条件下, 突变体在根长、根表面积、侧根数和根分蘖数等方面都低于WT (图11), 证明这2个基因都正向调控植物耐低钾胁迫的反应。
在真核生物中, 小GTP结合蛋白能够调节多种生理过程, 包括细胞信号转导、细胞增殖、细胞骨
架组织以及细胞内膜运输等[ 29, 30, 31, 32]。小GTP结合蛋白可以进一步分为Ras、Rab、Rho、Arf和Ran 5种, 其中Ras类主要调节细胞的增殖, Rho类主要参与控制细胞骨架的形成, Arf类主要参与膜上各种物质的运输, Ran类主要参与蛋白的运输和RNA的转录[ 33]。本研究证明与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB属于Rab类(图1和图2), Rab类小GTP结合蛋白是细胞内膜运输的重要调节者, 可以调节胞吞、胞吐以及细胞内膜的循环利用[ 34]。有报道指出, AtRAB能被超氧自由基阴离子和水杨酸等诱导表达, 且在其转基因植物的液泡和芽中积累大量的Na+, 并能提高转基因植物对盐和渗透胁迫的抗性, 减少盐胁迫下活性氧的积累[ 35]。本研究发现 AtRAB不仅参与植物的耐盐反应, 而且参与植物在低磷、低钾胁迫条件下的反应, 正向调控植物对高盐、低磷和低钾等胁迫的耐性(图6~图11)。
文献报道, H+-PPase可以参与很多生理进程, 它所形成的H+梯度可以被液泡膜上的Na+/K+反向装运蛋白利用, 将Na+泵入液泡, 降低Na+在细胞质中的浓度, 这种离子区域化机制既能维持细胞渗透势, 又能维持细胞离子平衡, 避免一些无机离子(如Na+和C1-等)对细胞代谢的毒害从而提高植物的耐盐性[ 36]。Yang等[ 26]还发现, 过表达H+-PPase能够增强单子叶植物和双子叶植物对磷元素的吸收, 其作用原理是H+-PPase能够使液泡内pH降低, 造成液泡的酸化, 促进生长素IAA的分布, 进而促进植物根系的发育[ 23], 同时促进离子的吸收和转运[ 36, 37]。本研究也证明 AVP1具正向调控植物的耐盐性及耐低磷胁迫和耐低钾胁迫的能力。我们推测 AVP1基因的这些功能都与其可以酸化植物根部细胞的机制相关。
小GTP结合蛋白能够被GTP的结合所激活, 被随后的GTP水解为GDP所抑制, 扮演分子开关的角色[ 38, 39], 在处于活性状态时, Rab类小GTP结合蛋白能够和下游很多执行不同功能的蛋白互作, 控制这些蛋白的活性[ 33]。本研究中亚细胞定位分析证明AVP1和AtRAB都能在细胞膜上表达(图2-B, C), 这与文献报道的VP1的亚细胞定位结果一致[ 4, 5, 6], 双分子荧光互补实验(BiFC)证明AVP1和AtRAB能在细胞核和细胞膜上互作(图2-D)。另外, 本研究观察到AVP1只定位于细胞膜, 与文献报道一致, 但双分子荧光互补却表现出细胞膜和细胞核上的黄色荧光, 推测可能是AVP1和AtRAB在细胞膜上互作后发生了迁移, 有往核中迁移表达的倾向。至于两者是否发生互作后迁移, 还需要更深入研究。对拟南芥野生型(WT)、突变体 rab和 avp1在高盐、低磷及低钾胁迫条件下的比较表明, 这两个突变体的表型相似, 证明 AtRAB和 AVP1处于同一信号途径, 同时正向调控植物的抗逆反应。另有文献报道, AtRAB对植物的尖生细胞伸长是极其重要的, 能够定位于根毛细胞, 并且推测其通过一个参与极化分泌的细胞壁成分来调节膜运输[ 40]。因此, 我们推测AtRAB可能是通过和AVP1互作调节AVP1的活性, 影响植物对离子的吸收(图6、图8和图10)。它们之间的调控机制需要进一步研究。
AVP1和AtRAB能在细胞膜和细胞核上发生直接的相互作用。 AVP1和 AtRAB突变体在高盐、低磷和低钾胁迫条件下表型相似, 证明 AVP1和 AtRAB处于同一信号途径, 同时正向调控植物的抗逆反应。 AVP1和 AtRAB之间的调控机制还需要进一步研究。