花生属四倍体栽培种仲恺花4号和二倍体野生种 A. doigoi(PI 276235)于2007年5月杂交, 获得种间杂种F₁及早期异源多倍体世代群体S₀~S₃, 并于2012年11月13日上午, 选取1株F₁、1株S₀、3株S₁植株(由该S₀植株自交1代获得的后代材料S_1-1、S_1-2、S_1-3)、12株S₂植株(每个S₁植株后代各取4株, 即由S_1-1植株自交1代获得的4株S_2-1材料、S_1-2自交1代获得的4株S_2-2材料、S_1-3自交1代获得的4株材料S_2-3)、13株S₃植株(即S_1-1自交2代获得的4株后代材料S_3-1、S_1-2自交2代获得的4株后代材料S_3-2、S_1-3自交2代获得的5株后代材料S_3-3)及双亲共32份材料的顶部健康幼嫩叶。

T载体(pMD18-T)和逆转录酶(M-MLV)购自TaKaRa公司; 逆转录引物Oligo(dT)₁₈购自Invitrogen公司; 工程菌JM-109购自Transgene公司; DEPC水购自上海捷瑞生物工程有限公司; 琼脂糖凝胶回收试剂盒和DNA聚合酶购自生工生物工程(上海)有限公司, 相关引物合成及测序也由该公司完成。

参考熊发前等^{[ 41]}建立的改良两步LiCl沉淀法提取花生RNA, 分别用1.5%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度, 并将终浓度调成一致, 按逆转录(M-MLV)操作合成cDNA第1链, 将逆转录引物Oligo(dT)₁₈用DEPC水稀释10倍, -80℃分装保存备用。

cDNA-SCoT PCR体系20 μL, 含ddH₂O 15.3 μL、10×PCR buffer (含Mg²⁺) 2 μL、10 mmol L^-1dNTPs 0.5 μL、10倍稀释第1链cDNA 1 μL、10 μmol L^-1引物1 μL、5 U μL^-1 Taq DNA聚合酶0.2 μL。PCR程序为94℃预变性3 min; 94℃变性30 s, 50℃退火60 s, 72℃延伸90 s, 35个循环; 72℃延伸5 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测, EB染色显影。

统计条带时仅考虑条带的有无, 不考虑条带的强弱变化, 有条带记为1, 无条带记为0, 建立SCoT引物在32份花生材料中扩增的cDNA片段有无的分

布表。亲本条带的沉默指条带在亲本中出现而在后代材料中不出现, 激活表达指条带在后代材料中出现而在亲本中不出现。本试验中每条引物均进行2次扩增, 只统计在重复扩增中都能稳定出现的条带。

选取250~2000 bp的差异片段(transcript derived fragments, TDFs)回收纯化, 连接到pMD18-T载体上, 转入大肠杆菌JM109感受态细胞中并进行蓝白斑筛选, 经菌液PCR初步检测后将阳性克隆菌液送生工生物(上海)服务有限公司测序, 利用NCBI数据库中的Blast分析软件比对分析测序结果。

采用本课题组已经建立好的改良两步LiCl沉淀法提取的花生幼叶总RNA经琼脂糖凝胶电泳带型完整且清晰, 说明RNA具有较高的纯度和浓度(图1)。RNA经紫外分光光度计检测, OD₂₆₀/OD₂₈₀比值在1.79~2.00之间, OD₂₆₀/OD₂₃₀比值在2.14~2.30之间, 表明质量较好, 基本无降解, 蛋白质和酚类的污染少, 符合实验要求。逆转录的cDNA第1链在琼脂糖凝胶上呈现均匀弥散状, 大小在200~2000 bp之间(图2), 表明逆转录效果较好, 所获得的cDNA可进行下一步试验。

图1

Fig. 1

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图1 部分花生材料幼叶总RNA的提取Fig. 1 Total RNA extracted from young leaves of partial peanut materials

图2

Fig. 2

	Figure Option ViewDownloadNew Window
	图2 第1链cDNA的合成Fig. 2 Synthesis of the first cDNA strand

采用cDNA-SCoT技术对亲本和种间杂交异源多倍化早期世代(F₁~S₃)的基因表达变化进行分析, 发现在花生属人工异源多倍体进化过程中基因表达变化早在F₁代即发生, 并在多倍体形成之后的当代及以后几个世代中继续发生着变化(图3)。基因表达变化类型主要包括6种: (1)父本二倍体野生种转录物在种间杂种F₁及早期多倍体世代所有材料中沉默(图3); (2)母本四倍体栽培种转录物在种间杂种F₁及早期多倍体世代所有材料中沉默(图4); (3)父本二倍体野生种转录物在种间杂种F₁及早期多倍体世代部分材料中沉默(图3和图4); (4)母本四倍体栽培种转录物在种间杂种F₁及早期多倍体世代部分材料中沉默(图3); (5)双亲转录物都在F₁及早期多倍体世代部分材料中沉默(图4); (6)在杂种F_l及早期多倍体世代材料中出现亲本不具有的特异性新转录物(图3和图4)。

基因表达变化发生频率最高的是S₁, 变化数为72, 60个亲本转录物丢失, 12个新片段产生, 占扩增总片段数的55.56%和11.11%; 其次是S₂, 变化数为62, 48个丢失, 14个新转录物产生, 占总片段数的44.44%和12.96%; 接着是S₃, 变化数为61, 占扩增总片段数的57.41%; 最后是F₁和S₀, 变化数分别为43和36, 分别占扩增总片段数的39.82%和33.33% (表1)。结果表明, 花生属人工异源多倍体进化过程中基因表达发生了快速而剧烈的变化, 变化类型以亲本转录物的沉默为主, 并伴随着大量新转录物的激活表达。

图3

Fig. 3

Figure Option ViewDownloadNew Window

图3 引物SCoT94在花生属种间杂种F1、异源多倍体早期世代(S0~S3)及亲本的cDNA-SCoT扩增a: 父本转录物完全沉默; c: 母本转录物在后代部分材料中沉默; d, e: 亲本转录物在后代部分材料中沉默; b, f: 新转录物激活。 M: DL2000 marker; Fe: 母本; Ma: 父本。Fig. 3 cDNA-SCoT amplification result of F1hybrid, synthesized allopolyploid (S0-S3) and their progenitors in genus Arachisinterspecific hybridization by primer SCoT94a: transcript silencing completely from male parentage; c: transcript silencing from female in some materials; e, d: transcript silencing from male in some materials; b, f: expression of novel transcript. M: DL2000 marker; Fe: female parent; Ma: male parent.

图4

Fig. 4

Figure Option ViewDownloadNew Window

图4 引物SCoT71在花生属种间杂种F1、异源多倍体早期世代(S0~S3)及亲本的cDNA-SCoT扩增f: 母亲转录物完全沉默: b, e: 父本转录物在后代部分材料中沉默; c: 双亲转录都在后代部分材料中沉默; a, d: 新转录物激活; M: DL2000 marker; Fe: 母本; Ma: 父本。Fig. 4 cDNA-SCoT amplification result of F1hybrid, synthesized allopolyploid (S0-S3) and their progenitors in genus Arachisinterspecific hybridization by primer SCoT71f: transcript silencing absolutely from female; b, e: transcript silencing from male in some materials; c: transcript silencing from parents in some materials; d: expression of novel transcript; M: DL2000 marker; Fe: female parent; Ma: male parent.

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 花生属人工异源多倍化早期各世代基因表达变化频率 Table 1 Frequency of fragments variation in the early generations during Arachisartificial allopolyploidization 世代 Generation 发生变化的条带 Fragments in variation 百分率a Percentagea (%) 丢失 Missing 新增 New 条带数 No. of fragments 百分率a Percentagea (%) 条带数 No. of fragments 百分率a Percentagea (%) F1 43 39.82 37 34.26 6 5.56 S0 36 33.33 30 27.78 6 5.56 S1 72 66.67 60 55.56 12 11.11 S2 62 57.41 48 44.44 14 12.96 S3 61 56.48 49 45.37 12 11.11 a Percentage over the total 108 fragments amplified. a占总扩增条带数(108)的百分率。

表1 花生属人工异源多倍化早期各世代基因表达变化频率 Table 1 Frequency of fragments variation in the early generations during Arachisartificial allopolyploidization

从46条SCoT引物中筛选出12条扩增结果稳定、条带清晰的引物。通过12条单引物扩增, 获得

108个100~3000 bp之间的cDNA片段, 其中多态性片段80个, 选取其中的35个500~2000 bp的差异片段(transcripts derived fragments, TDFs)进行克隆和序列分析, 最终成功克隆获得了27条差异片段序列, 回收成功率为77.14%, 其中26个TDF和NCBI数据库已登入的基因具有较高的同源性(表2), 按照其功能可分为5类, 即能量与代谢相关基因(8个, 占阳性克隆总数的29.63%)、抗逆相关基因(4个, 占阳性克隆总数的14.82%)、未知功能蛋白(3个, 占阳性克隆总数的11.11%)、信号转导相关基因(2个, 占阳性克隆总数的7.41%)和反转录转座子相关基因(9个, 占阳性克隆总数的33.33%); 有1个TDFs无显著同源的序列信息(占阳性克隆总数的3.70%), 均称其为未知基因。从表2可以看出, 在后代沉默的并来自父本的12条基因片段中, 有4个与提高抗性相关的基因, 2个反转录转座子相关基因, 2个信号转导相关基因, 4个能量与代谢相关基因; 在后代沉默的并来自母本的4条基因片段中, 有2个未知功能蛋白相关基因, 2个能量与代谢相关基因; 在新增的10条基因片段中, 有7个反转录转座子相关基因, 2个能量与代谢相关基因, 1个未知功能蛋白相关基因。

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 花生属种间杂交多倍化过程中TDFs功能预测 Table 2 Function prediction of TDFs in polyploidization of genus Arachis interspecific hybridization TDFs 大小 Size (bp) TDFs模式 TDFs pattern 同源基因 Homological gene 功能分类 Function category E值 E-value TDF1 401 A Isoleucine N-monooxgenase 2-like 氧化还原酶类之一,与能量、代谢相关 One of oxidoreductase related to energy and metabolism 2E-69 TDF2 403 A Cytochrome P450 体内代谢转换的重要酶系 The important enzyme related to metabolism 1E-66 TDF3 639 A Carboxylestesterase 1-like 羧酸酯水解酶之一,与体内代谢相关 One of carboxylestesterase related to metabolism 6E-48 TDF4 909 B Copia-type polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 4E-32 TDF5 1347 A Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 2E-21 TDF6 1348 B Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 6E-131 TDF7 1914 B Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 2E-32 TDF8 1421 C Hypothetical protein 6E-5 TDF9 1065 B Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 3E-99 TDF10 401 C Hypothetical protein 2E-175 TDF11 1042 B Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 1E-78 TDF12 514 B Transmembrane protein 提高细胞的使用寿命 Advance the life of cell 2E-62 TDF13 1199 B Leucyl-tRNA ligase 为蛋白质合成提供原料 Provide material for protein sythesis 0 TDF14 1589 A Polar amino acid ABC transporter permase 转运通透酶之一, 提高生物抗性 One of transporter permase raising the biology resistance 6E-128 TDF15 1509 A Polar amino acid ABC transporter permase 转运通透酶之一, 提高生物抗性 One of transporter permase raising the biology resistance 7E-127 TDF16 873 B Hypothetical protein 2E-62 TDF17 1271 D P450-dependent fatty acid hydroxylase 一种脂肪酸羧化酶,与能量代谢相关 One of hydroxylase related to energy and metabolism 0 TDF18 1217 C La-related protein 1-like 构成核糖体的组成部分之一 Constitute an integral part of the ribosome 4E-18 TDF19 1930 A Phospholipase B 水解磷脂酶的一种,与能量代谢相关 One of hydrolyzing phospholipase related to energy and metabolism 9E-136 TDF20 1998 D ABC transporter permease 转运通透酶之一, 提高生物抗性 One of transporter permase raising the biology resistance 1E-128 TDF21 1061 A Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 7E-97 TDF22 640 C Carboxylestesterase 1-like 羧酸酯水解酶之一, 与体内代谢相关 One of carboxylestesterase related to metabolism 3E-63 TDF23 911 B Copia-type polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 7E-32 TDF24 1061 B Gag-pol polyprotein 反转录转座子 Retrotransposon 7E-97 TDF25 1431 A Permase 特异性膜运输系统的统称, 与信号转导相关 A general designation of specific membrane system related to signal transduction 1E-80 TDF26 518 A Membrane protein 质膜的重要组成部分, 与信号转导相关 Important constitute part of plasma membranes related to signal transduction 1E-78 A: transcripts from male are absent in some progeny; B: new transcript occurred in progeny; C: transcripts from female are absent in some progeny; D: transcripts from male are absent absolutely in some progeny. A: 父本特有, 后代部分丢失; B: 后代新增; C: 母本特有, 后代部分丢失; D: 父本特有, 后代完全丢失。

表2 花生属种间杂交多倍化过程中TDFs功能预测 Table 2 Function prediction of TDFs in polyploidization of genus Arachis interspecific hybridization

本试验将cDNA-SCoT差异显示技术应用于花生属人工异源多倍体进化过程中的基因表达变化分析,对不同模板、引物、PCR体系和扩增条件等进行了摸索和优化, 最终有12条SCoT引物能在所有供试花生材料中扩增出集中在200~2000 bp之间、重复性好且清晰的片段, 回收差异片段, 成功率高、假阳性低, 与在甘蔗上的研究结果^{[ 39, 40]}一致, 同时该技术兼具操作简单和成本较低等优点, 说明cDNA-SCoT差异显示技术完全适用于花生属基因表达变化分析, 与cDNA-AFLP技术一样是研究异源多倍体中基因表达变化的有效技术^{[ 18, 20, 23]}, 并可以作为其他物种基因差异表达分析技术的有效补充。

在本研究中, 12条SCoT引物在供试材料中共扩增出108个cDNA片段, 杂种F₁及早期多倍体世代S₀~S₃与亲本扩增条带相比, 发生变化的转录物总数为80个, 占扩增总片段数的74.07%。说明在花生属种间杂交早期多倍化过程中, 基因表达表现出强烈的不稳定性, 这与小麦^{[ 18, 19]}、棉花^{[ 20]}、甜瓜属^{[ 23]}、拟南芥^{[ 41]}等作物上所报道的异源多倍化过程中基因表达变化普遍发生、但基因表达变化只是一个小概率事件、多倍体后代能遗传和表达大多数亲本的基因有很大不同。在本研究中基因表达变化频率高达74.07%, 特别是早期多倍体世代S₁~S₃, 片段变化数分别为72、62和61, 分别占总片段数的66.67%、57.41%和56.48%, 这可能与该组合早期世代通过种间杂交从三倍体到六倍体、六倍体经多倍体进化到最终稳定的四倍体过程中, 基因组受到杂合和多倍化的双重冲击而极端不稳定、从而在早期世代之间和同世代的材料之间发生疯狂分离相关。

在本研究中, 基因表达变化起始于F₁代并在多倍体形成当代及以后的自交世代中继续发生, 伴随着整个进化过程, 这与Kashkush等^{[ 18]}报道的小麦异源多倍化过程中基因表达变化起始于F₁代并贯穿整个进化过程一致, 而与Zhuang等^{[ 23]}研究发现的甜瓜属多倍体进化中基因表达变化起始于S₁代不同。另外, 仲恺花4号× A. doigoi杂交组合的基因表达变化以亲本基因的沉默或消失为主, 且父本二倍体野生种基因沉默或消失的比例要比母本四倍体栽培种大, 并伴随着大量基因的激活表达, 与贺梁琼等^{[ 29, 30]}在利用SSR、SCoT标记分析花生栽培种× A. chacoensis组合异源多倍化早期基因组变化的研究结果类似, 在丢失的亲本条带中以父本条带为主, 同时伴有大量新条带的产生, 这可能与花生属种间杂交异源多倍化进程实际上是一个不断进化以接近四倍体栽培种的过程有关, 因而造成二倍体野生种

花生基因更倾向于丢失或沉默、四倍体栽培种花生基因更倾向表达。因此, 有必要开展进一步的研究以探明异源多倍体中沉默的基因是否具有基因组倾向性以及探讨基因表达变化的相关机制。Adams等^{[ 20]}对棉花异源多倍体的研究表明, 发生变化的基因不具有明显的基因组倾向性; Zhuang等^{[ 23]}对甜瓜属异源多倍体研究表明, 二倍体亲本的基因在异源多倍体中发生沉默的频率存在一定的差异, 母本甜瓜属野生种的基因在异源四倍体中沉默的频率较父本栽培种要高, 说明不同的物种在异源多倍化中基因变化的频率不尽相同。

亲本转录物的丢失是亲本基因片段的丢失或沉默造成的, 基因片段的丢失是不可逆而沉默是可逆的。本研究中有4个亲本转录物在后代所有材料中都丢失, 可能是与基因片段丢失引起的不可逆过程相关; 而另外的62个亲本转录物在后代材料中呈现沉默后又表达, 或表达后又沉默, 是一个动态的过程, 可能是由于基因片段沉默引起的可逆过程引起, 这还有待进一步验证。此外, 杂种F₁和S₀代片段变化数分别为43个和36个, 杂交引起转录物变化数有43个, 从杂交到染色体加倍仅有7个转录物发生变化, 由基因组加倍引起的变化并不大, 这与千里光^{[ 43]}、油菜^{[ 21]}、玉米^{[ 44]}相关研究中报道的杂交比基因组加倍对基因表达影响更大的结果类似。可以推断异源多倍体进化过程中染色体杂合所带来的冲击比染色体加倍所产生的影响大得多。

彭海等^{[ 8]}指出在异源多倍体中各种类别的基因都有可能发生表达变化, Adams等^{[ 20]}、Comai等^{[ 42]}、Zhuang等^{[ 23]}和Kashkush等^{[ 18]}研究表明与植物生长发育相关和基因组稳定性相关的基因表达模式在异源多倍化进程中会发生变化, 但不同植物间存在着一定的差异, 此外, Kashkush等^{[ 18]}用cDNA-AFLP技术研究人工异源四倍体小麦基因表达变化中发现激活表达的基因全部为逆转座元件, 而Zhuang等^{[ 23]}的甜瓜属相关研究中没有发现激活表达的基因与逆转座子有关。本研究中的26个TDFs和NCBI数据库已登录的基因具有较高的同源性, 包括能量与代谢相关基因、抗逆相关基因、未知功能蛋白、信号转导相关基因和反转录转座子相关基因, 这与其他异源多倍体的研究结果基本一致。另外, 10个激活表达的基因片段中, 有7个是反转录转座子相关基因, 进一步证明种间杂交作为一种基因组胁迫激发转座子的活性^{[ 45]}。花生属种间杂交人工异源多倍化进程中基因丢失或沉默、逆转录转座子激活的调控机制以及逆转录转座子激活在进化中的作用还有待进一步研究。