在构建抗病基因 Pi-ta和 Pi-b的多重PCR体系(简称为体系I)时选用南粳44、南粳45、武运粳7号、武运粳8号、武运粳21、武粳15、武香粳14、常农粳5号、盐稻9号、扬粳805。在构建感病等位基因 pi-ta与 pi-b的多重PCR体系(体系II)时选用徐稻3号、徐稻4号、徐稻6号、镇稻88、淮稻5号、淮稻9号、连粳4号、连粳5号、连粳6号、连粳7号。分别以公认的抗稻瘟病品种嘉33作为抗病对照, 丽江新团黑谷作为感病对照^{[ 13, 18]}, 利用开发的多重PCR体系对336份高世代粳稻新品系所含抗病基因 Pi-ta和 Pi-b进行检测, 与单标记检测结果比较, 验证多重PCR体系的可靠性。在江苏省农业科学院粮食作物研究所试验田种植上述材料。5月10日播种, 6月10日移栽, 每个材料种植8行, 每行40株, 株行距13.2 cm × 26.4 cm, 常规田间管理。

在水稻分蘖盛期采取新鲜幼嫩叶片, 按CTAB方法^{[ 19]}, 略有修改, 提取对照品种及供试材料单株基因组DNA。

根据等位基因特异PCR原理, 王忠华等^{[ 20]}利用自身序列设计特异性引物YL155/YL87和YL183/ YL87, 前一对引物能特异扩增出抗病等位基因 Pi-ta的相应序列, 约1042 bp的DNA片段; 后1对引物能特异扩增出感病等位基因 pi-ta的相应序列, 约1042 bp的DNA片段。根据Fjellstrom等^{[ 21]}的序列合成引物 Pi-bdomF/ Pi-bdomR, 能特异扩增出抗病等位基因 Pi-b的相应序列, 约365 bp的DNA片段; 根据刘洋等^{[ 12]}的序列合成引物Lys145F/ Lys145R, 扩增感病等位基因 pi-b的相应序列, 约803 bp的DNA片段。这些引物名称、序列及其扩增片段预期大小见表1。引物均由上海英潍捷基公司合成。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 用于多重PCR 反应的引物名称、序列及预期片段长度 Table 1 Name, sequences, and expected fragment size of specific primers used for Multiplex PCR 目标基因 Target gene 引物 Primer 序列 Sequence (5'-3') 预期片段 Fragment size (bp) 注释 Note 参考文献 Reference Pi-ta YL155 AGCAGGTTATAAGCTAGGCC 1042 抗病 Resistant Wang et al. [11] YL87 CTACCAACAAGTTCATCAAA pi-ta YL183 AGCAGGTTATAAGCTAGCTAT 1042 感病 Susceptible YL87 CTACCAACAAGTTCATCAAAS Pi-b Pi-bdomF GAACAATGCCCAAACTTGAGA 365 抗病 Resistant Fjellstrom et al. [21] Pi-bdomR GGGTCCACATGTCAGTGAGC pi-b Lys145F TCGGTGCCTCGGTAGTCAGT 803 感病 Susceptible 刘洋等[12] Liuyang et al. [12] ys145R GGGAAGCGGATCCTAGGTCTS

表1 用于多重PCR 反应的引物名称、序列及预期片段长度 Table 1 Name, sequences, and expected fragment size of specific primers used for Multiplex PCR

2套多重PCR反应体系均为20 μL, 包括l × PCR buffer (1.5 mmol L^-1 MgCl₂)、200 μmol L^-1 dNTP、1.25 U TaqDNA聚合酶(南京金斯特生物技术有限公司)、100~150 ng模板DNA和适量引物。扩增反应在Tprofessional热循环仪上进行, 扩增参数为95℃预变性3 min; 然后94℃变性1 min, 55℃复性 1 min, 72℃延伸1 min, 6个循环; 再进行94℃变性1 min, 55℃复性50 s, 72℃延伸30 s, 32个循环; 最后72℃延伸6 min。扩增产物加2 μL加样缓冲液, 取10 μL在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离, 缓冲体系为1×TAE溶液, 120 V电泳45 min, 紫外灯下观察并照相。为保证结果的稳定性和可靠性, 每份材料重复扩增3次以上。

先以22个已知基因组成的水稻品种DNA为模板, 利用4个基因的特异引物, 分别进行退火温度的梯度PCR, 明确每对引物出现清晰特异扩增条带的退火温度范围; 筛选出具有相同退火温度且扩增条带差异较大的引物, 组合成多重PCR, 进行下步已知基因组成材料的多重PCR检测。在明确构建体系所涉及的4对引物相同的退火温度后, 再按照原有引物、dNTP、DNA聚合酶等用量配制多重PCR体系, 进行PCR扩增和电泳检测。然后结合对照材料扩增的结果, 主要从引物用量、延伸时间和循环数等方面对体系进行调试优化。实验中先加入等浓度的引物量, 根据扩增结果再调整, 增大弱扩增的引物用量, 减少强扩增的引物用量; 在优化延伸时间时, 弱扩增适当延长。最终, 在2套多重PCR体系中, 使每个标记引物在含目标基因(位点)的已知对照材料中扩增出清晰的特异条带, 而在不含目标基因(位点)的已知对照材料中无特异条带出现。现将构建2套多重PCR体系的具体内容分述如下。

2.1.1 Pi-ta和 Pi-b多重PCR体系 本体系涉及 Pi-ta和 Pi-b两个抗病基因位点的标记, 由引物YL155/YL87和Pi-bdomF/Pi-bdomR构成。以已知基因组成的12个水稻品种(系) DNA为模板, 利用 Pi-ta与 Pi-b基因标记对其相应位点基因进行PCR扩增和电泳, 通过反复调整体系中引物间浓度比例、延伸时间和循环数等条件, 不断优化体系, 最终获得20 μL PCR反应体系I含2.0 μL DNA模板(约20 ng μL^-1), 2.0 μL 10 × PCR buffer (25 mmol L^-1), 2.0 μL d NTPs (2.5 mmol L^-1), 引物浓度是10 μmol L^-1, 每条引物用量0.8~1.2 μL, 用ddH₂O补至20 μL。

在图1多重PCR体系I检测的12个品种中, 南粳44和南粳45等10份材料同时扩增出了与抗病对照嘉33相同的条带, 分别为1042 bp和365 bp; 而感病对照丽江新团黑谷则无目的条带, 与时克等^{[ 15]}和杨杰^{[ 22]}等单一抗病基因PCR的检测结果完全一致, 表明这些品种都含有抗病基因 Pi-ta和 Pi-b。

图1

Fig. 1

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图1 Pi-ta和 Pi-b基因标记的多重PCR琼脂糖凝胶电泳图M: DL2000; 1: 抗病对照嘉33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~12: 分别为南粳44、南粳45、武运粳7号、武运粳8号、武运粳21、武粳15、武香粳14、常农粳5号、盐稻9号和扬粳805。Fig. 1 Multiplex PCR specific for genes Pi-taand Pi-bM: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control Lijiangxintuanheigu; 3-12: tested rice varieties Nanjing 44, Nanjing 45, Nanjing 9108, Nanjing 46, Nanjing 5055, Wuyunjing 7, Wuyunjing 8, Wuyunjing 21, Wujing 15, and Wuxiangjing 14.

2.1.2 感病等位基因 pi-ta与 pi-b多重PCR体系

按照构建多重PCR体系I的方法, 本体系涉及 pi-ta与 pi-b两个感病基因位点的标记, 由引物YL183/ YL87和Lys145F/Lys145R构成。通过不断优化体系, 同样获得了20 μL PCR 反应体系II含2.0 μL DNA模板(约20 ng μL^-1), 2.0 μL 10 × PCR buffer (25 mmol L^-1), 2.0 μL dNTPs (2.5 mmol L^-1), 引物浓度是10 μmol L^-1, 每条引物用量0.8~1.2 μL, 用ddH₂O补至20 μL。

图2为利用感病等位基因 pi-ta与 pi-b多重PCR体系II检测12个已知品种(系)的结果。徐稻3号和徐稻4号等10份材料, 同时扩增出了和感病对照丽江新团黑谷相同的特异条带, 分别为1042 bp和803 bp; 而抗病对照嘉33则未扩增出目的条带, 与杨杰等^{[ 22]}和何重等(待发表)单一感病基因PCR的检测结果完全相同, 表明这些品种都含有感病基因 pi-ta与 pi-b。

图2

Fig. 2

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图2 pi-ta和 pi-b基因标记的多重PCR琼脂糖凝胶电泳图M: DL2000; 1: 抗病对照嘉33; 2: 感病对照丽江新团黑谷, 3~12: 分别为徐稻3号、徐稻4号、徐稻6号、镇稻88、淮稻5号、淮稻9号、连粳4号、连粳5号、连粳6号和连粳7号。Fig. 2 Multiplex PCR specific for genes pi-taand pi-bM: DL2000; 1: susceptible control variety Lijiangxintuanheigu; 2: resistant control variety Jia 33, 3-12: tested rice varieties Xudao 3, Xudao 4, Xudao 6, Zhendao 88, Huaidao 5, Huaidao 9, Lianjing 4, Lianjing 5, Lianjing 6, and Lianjing 7.

利用已建立的2套多重PCR体系, 对本研究团队自主选育的336份高世代育种材料进行抗病基因 Pi-ta和 Pi-b以及感病等位基因 pi-ta与 pi-b的检测。结果显示, 336份供试材料中, 只含有抗性基因 Pi-ta的品系有119份, 占总量的35.42%, 只含有抗性基因 Pi-b的品系有319份, 占总量的94.94%。有112个品系同时扩增出1042 bp和365 bp两条抗病基因目的条带, 占供试材料的33.33%, 这些品系的目的条带与抗病对照嘉33相同, 说明这些品系均含有抗性基因 Pi-ta和 Pi-b; 10份材料均检测到了与感病对照丽江新团黑谷相同的1042 bp和803 bp感病基因目的条带, 占总数的3.0%, 说明这些品系含有感病基因 pi-ta和 pi-b; 有7个品系同时扩增出1042 bp抗病基因目的条带和803 bp感病基因目的条带, 占总数的2.1%, 说明这些品系含有抗性基因 Pi-ta和感病基因 pi-b; 207个品系同时扩增出1042bp感病基因目的条带和365 bp抗病基因目的条带, 占总数的61.61%, 说明这些品系含有感病基因 pi-ta和抗病基因 Pi-b (表2)。上述检测结果与何重等(待发表)单一感病基因PCR的检测结果完全相同。部分品系检测结果见图3和图4。

从以上分析可以看出, 高世代育种材料中聚合2个抗稻瘟病基因的品系比例较少, 抗性基因 Pi-b的分布频率明显高于抗性基因 Pi-ta的分布频率。

图3

Fig. 3

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	图3 部分水稻品系抗病基因 Pi-ta和 Pi-b的多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图M: DL2000; 1: 抗病对照嘉33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~24: 部分检测品系。Fig. 3 Results of multiplex PCR detection of resistance genes Pi-taand Pi-bin partial rice linesM: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control Lijiangxintuanheigu; 3-24: partial rice lines tested.

图4

Fig. 4

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	图4 部分水稻品系感病基因 pi-ta和 pi-b的多重PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图M: DL2000; 1: 抗病对照嘉33; 2: 感病对照丽江新团黑谷; 3~24: 部分检测品系。Fig. 4 Results of multiplex PCR detection of disease genes pi-taand pi-bin partial rice linesM: DL2000; 1: resistant control Jia 33; 2: susceptible control Lijiangxintuanheigu; 3-24: partial rice lines tested.

表2

Table 2

表2(Table 2)

表2 抗病基因 Pi-ta和 Pi-b在336份粳稻品系中的分布 Table 2 Distribution of Pi-ta and Pi-bin 336 japonica rice lines 品系 Line 数量 Number 比例 Ratio (%) 含有 Pi-ta和 Pi-b Containing Pi-ta and Pi-b 112 33.33 含有 Pi-ta和 pi-b Containing Pi-ta and pi-b 7 2.08 含有 pi-ta和 Pi-b Containing pi-ta and Pi-b 207 61.61 含有 pi-ta和 pi-b Containing pi-ta and pi-b 10 2.98 合计 Total 336 100.00

表2 抗病基因 Pi-ta和 Pi-b在336份粳稻品系中的分布 Table 2 Distribution of Pi-ta and Pi-bin 336 japonica rice lines

分子生物学的发展, 极大地推进了稻瘟病抗性遗传研究的进程, 而大量定位的稻瘟病抗性基因为采用MAS 技术开展抗性育种奠定了基础。开发一种高效且不受季节和样品种类限制、能在水稻生长发育早期即可检测其抗性基因组成的方法, 有助于加快水稻抗稻瘟病遗传改良的进度。常规的抗稻瘟病基因型分析, 依赖于抗性鉴定和表型选择, 育种

周期长, 且存在选择效率低、工作量大、操作困难等诸多缺点。分子标记检测样品可以是植株任何部位的组织, 取样不受水稻生长季节和样品种类限制, 操作过程比较简单; 而与单一PCR方法相比, 多重PCR一次可以同时检测多个目标基因, 具有低成本、易操作、高效率等优点, 适合目标位点的分子辅助选择聚合育种。与前人建立的单一PCR检测体系相比, 本研究构建的多重PCR体系涉及更多位点, 特异性和灵敏度较好, 检测效率更高, 更适合抗病基因 Pi-ta和 Pi-b的资源筛选和分子聚合育种。

前人研究表明, Pi-ta和 Pi-b基因在江苏、云南、吉林等地区菌株仍表现较高水平的抗性^{[ 23, 24, 25, 26]}。本研究分子检测结果显示 Pi-ta和 Pi-b在品系中的分布频率存在明显差异, Pi-b的分布频率明显高于 Pi-ta。

分析含 Pi-ta但不含 Pi-b以及不含 Pi-ta只含有 Pi-b这2种基因组合的抗性表现, 发现只含 Pi-b基因的品系, 其感病率明显高于只含 Pi-ta基因品系的感病率, 且稻瘟病菌表现高度的小种专化性。在未来水稻抗稻瘟病育种中, 应当注重改良现有育成品种的抗性基因组成, 使各位点的抗稻瘟病基因尽可能聚合到同一品种中, 选育出抗性优良的水稻新品种。

由于多重PCR实验设计较单一PCR要复杂得多, 技术难度大, 因而在建立多重PCR反应体系时, 必须对其中的主要成分和反应条件进行繁琐的优化^{[ 27]}。根据实践经验, 我们认为采用下面步骤可能会提高构建多重PCR体系的效率。第一, 选择扩增产物差异较大的基因标记来组合多重PCR体系, 这是决定琼脂糖凝胶电泳能否容易、准确分辨结果的保证。第二, 在多重PCR反应中, 退火温度是一个最重要的需要调整的因素。通常依据引物的解链温度选择退火温度, 但有的时候其结果和预期并不一致。最简单的方法就是对每个基因标记的引物采用梯度PCR程序进行单一基因扩增, 确定能够满足每个目标基因扩增的多重PCR的退火温度; 而对没有相同退火温度的多重PCR组建体系, 可以考虑采用touch down扩增程序。第三, 在多重PCR组建体系中对扩增条带较弱的基因增加其引物用量, 而较强的减少用量, 通过不断调整引物的相对用量, 最终达到每个基因标记都能扩增出足够数量的PCR产物。虽然选择基因标记的引物是决定多重PCR成败最关键的因素, 但DNA模板、化学试剂(PCR buffer、Mg²⁺、 Taq聚合酶和dNTP等)和仪器(PCR仪和电泳仪)等因素也会影响多重PCR的结果。建议初期试用不同公司的试剂和不同型号的PCR仪, 确定多重PCR体系和程序; 当体系和程序基本确定后, 最好固定使用仪器和试剂。建议对每条引物稀释后分装使用, 而不要将多条引物混装保存和使用; 尽量避免反复冻融dNTP等试剂, 使用期间最好保存在4℃。与单个基因标记PCR相比, 多重PCR检测试剂成本明显降低、时间显著缩短。将本研究创建的稻瘟病抗病相关基因多重PCR体系与田间抗性鉴定相结合, 开展水稻抗稻瘟病育种, 必将有效提高水稻抗病性改良的效率。