水稻OsCNGC10基因抗倒伏性以及抗旱性功能研究
朱忠林, 文月, 周棋, 巫燕飞, 杜雪竹, 盛锋
作物学报
2024, 50 ( 5):
1351-1360.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.32027
环核苷酸门控离子通道是一种配体门控的阳离子通道, 存在于动物和植物体内, 是真核生物信号级联反应的重要组成部分。本研究利用水稻环核苷酸门控离子通道(cyclic nucleotide-gated channel, OsCNGC10)基因, 构建了超表达载体 pU1301-CNGC10-Flag和双靶点敲除载体pRGEB32-CRISPR/cas9-cngc10, 通过农杆菌介导的遗传转化法获得敲除和过表达材料, 并从T2代中分离到纯合植株oscngc10-2及OE-CNGC10-6。转基因植株茎秆特性以及抗倒伏性分析表明, 突变体oscngc10-2茎秆强度和抗倒伏性增强; 茎秆细胞壁组织切片以及组织成分分析则表明突变体oscngc10-2植株抗倒伏性增强是由于茎秆细胞壁茎壁厚度、薄壁组织细胞丰度以及木质素含量增加所致; 过表达OsCNGC10降低了茎秆壁厚、茎秆木质素含量以及茎秆细胞壁细胞丰度, 敲除OsCNGC10增加了茎秆木质素含量且增加了茎秆细胞壁薄壁细胞丰度, 初步证明OsCNGC10与水稻茎秆细胞壁成分合成相关, 负调控水稻抗倒伏性; T2代田间试验结果表明, 与野生型相比, 突变体oscngc10-2植株的株高、有效穗、穗长、穗粒数、结实率、千粒重和单株产量等农艺性状显著提升; 苗期干旱胁迫实验结果表明, 在干旱胁迫下, OsCNGC10基因缺陷型植株体内丙二醛(MDA)含量积累速度加快, 且无法形成足够的游离脯氨酸, 而过表达OsCNGC10植株在遭受干旱胁迫时, 体内游离脯氨酸(Pro)含量大量升高, 且MDA积累速度相对变慢, 初步说明OsCNGC10正向调控水稻苗期抗旱性。本研究结果表明水稻OsCNGC10可能在水稻抗倒伏及抗旱方面有潜在功能, 为培育抗倒伏且高产的水稻新品种提供了理论基础和新的种质资源。
| 名称Primer name | 序列Primer sequence (5'-3') | 用途Usage | | OsCNGC10-F | ATGTTTGGGGCGGGGAAGGTGGACG | 基因扩增 | | OsCNGC10-R | TTACTCACAGGGTTCAGCTGAAAAAT | Gene amplification | | OsCNGC10-Flag-F | GAACGATAGCCGGTACCATGTTTGGGGCGGGGAAGGT | 带载体接头的基因扩增引物 | | OsCNGC10-Flag-R | CTTTGTAATCGGATCCCTCACAGGGTTCAGCTGAAA | Primers for gene amplification with vector connectors | | L5AD5-F | CAGATGATCCGTGGCAACaaagcaccagtggtctag | 获得串联结构 | | L5AD5-R | TTTCTAGCTCTAAAACaaaaaaaaaagcaccgactcg | Obtaining a tandem structure | | OsCNGC10-sgRNA1-F | TCAAGAGGCAGAGAACCGTGgttttagagctagaaata | 获得串联结构 | | OsCNGC10-sgRNA1-R | CACGGTTCTCTGCCTCTTGAtgcaccagccgggaat | Obtaining a tandem structure | | OsCNGC10-sgRNA2-F | CACGGTTCTCTGCCTCTTGAtgcaccagccgggaat | 获得串联结构 | | OsCNGC10-sgRNA2-R | CGCAATTTCCTTTGGATCCGtgcaccagccgggaat | Obtaining a tandem structure | | S5AD5-F | CAGATGATCCGTGGCAACaaag | 获得串联结构 | | S5AD5-R | TTTCTAGCTCTAAAACaaaa | Obtaining a tandem structure | | OsCNGC10-target1-F | GCGGTGTGGTTGACGAGTTC | 靶点1序列 | | OsCNGC10-target1-R | GCCAAATCACTCGCAGGTCG | Sequence of target site 1 | | OsCNGC10-target2-F | ATTGGGACAGACAGGCATTT | 靶点2序列 | | OsCNGC10-target2-R | GTCCTTAGTGTGGTCTGGGC | Sequence of target site 2 | | Hyg-F | ACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCC | 转基因植株阳性鉴定 | | Hyg-R | TTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGG | Identification of the positive transgenic plan | | OsCNGC10-RT-F | TACCACCACTGAGAACGATGT | OsCNCG10表达量分析 | | OsCNGC10-RT-R | TACCACCACTGAGAACGATGT | Relative expression analysis of OsCNGC10 |
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表1
本研究所用核苷酸序列及相应引物
正文中引用本图/表的段落
取幼嫩野生型日本晴水稻叶片, 提取RNA并反转录成cDNA。以cDNA为模板, 设计扩增引物(OsCNGC10-F/OsCNGC10-R)将目的基因片段进行PCR扩增(表1); 将产物与PGEM-Teasy载体连接, 将连接产物转化至大肠杆菌感受态中培养, 挑选克隆进行阳性鉴定, 回收阳性质粒; 设计带载体接头的OsCNGC10引物(OsCNGC10-Flag-F/OsCNGC10-Flag-R), 以回收的阳性质粒为模板进行PCR扩增带载体接头的OsCNGC10基因; 使用限制性核酸内切酶(Kpn I、Bam HI)将pU1301-3×Flag载体双酶切, 利用诺维赞的同源重组酶将带接头的OsCNGC10目的基因和双酶切后线性化的pU1301- 3×Flag载体In-fusion连接, 得到重组载体(pU1301- CNGC10-Flag)。
本研究所用双靶点敲除载体的构建方式是在华中农业大学谢卡斌教授研究团队开创的tRNA串联法的基础上加以调整[18]。依据OsCNGC10 DNA序列以及基因结构, 设计2个gRNA合成接头引物以及gRNA连入表达载体pRGEB32所需的接头引物(表1); 采用infusion重组的方法将串联好的PCR产物到线性化的pRGEB32载体中。将上述反应产物热激转化大肠杆菌DH5α, 挑单克隆进行阳性检测并测序, 保存阳性菌株和质粒, 并将阳性质粒转化根癌农杆菌EHA105感受态(图2)。
结果表明, 与野生型相比, 在每1 g水稻茎秆粉末中, oscngc10-2的木质素含量最高, 且显著高于WT, 而OE-CNGC10-6木质素含量最低。转基因材料与野生型相比, 纤维素以及半纤维素含量则无显著差异(图7)。由此推测, 敲除oscngc10植株茎秆强度增强的原因, 可能是因为敲除该基因影响了控制木质素合成相关途径, 从而引起了木质素合成的大量增加而使其茎秆变粗, 抗倒伏性增强。
作为一种固着生物, 水稻极易受到各种非生物和生物胁迫带来的危害。干旱对水稻产量造成了严重影响, 对水稻的供应构成了威胁。通过现代分子生物学技术提高水稻对干旱胁迫的耐受性, 成为当前维持粮食安全行之有效的途径之一[26-27]。水稻的抗旱性是由多种类型的基因控制的复杂性状, 目前已发现一些基因可以在干旱、盐、低温、高温等非生物胁迫条件下调控水稻产量, 超表达(或敲除)这些基因可以提高转基因水稻的抗性及产量[28]。Hu等[29]研究认为通过基因工程手段聚合或导入外源抗旱基因可以提高水稻抗旱能力。Zhang等[30]将番茄中JERF1基因转入水稻中, 研究发现过表达JERF1可以显著提高水稻耐旱性, 且不影响转基因水稻的生长发育。李兆伟等[31]通过基因编辑对突变体材料的耐旱型进行考察, 表明转录因子OsNAC2d正调控水稻响应干旱胁迫。Xu等[32]研究认为超表达SiMYB56能够上调木质素合成基因和 ABA 信号通路关键基因来提高水稻的抗旱性, 并最终提高产量。杨建昌等[33]研究认为, 耐旱性更强的水稻品种的抗氧化系统更加强大, 能够快速清除积累的MDA, 因此, 能否快速消除积累的MDA可以作为水稻耐旱性的检测标准之一。同时, 以Pro为代表的一类渗透调节物质能够缓解干旱等非生物胁迫对植物造成的伤害, 从而维持植物细胞膨压和正常生理活动[34]。本试验前期通过PEG模拟干旱下OsCNGCs基因家族的表达模式分析表明, OsCNGC10 受PEG胁迫诱导上调明显[16]。苗期干旱胁迫试验结果表明, 干旱胁迫处理15 d后, oscngc10-2植株叶片干枯卷曲, 部分植株死亡; 但过表达材料OE-CNGC10- 6 仅有少数几片叶卷曲, 大部分植株叶片舒展, 生长状态良好。同时, oscngc10植株无法形成足够的游离Pro, 且植株体内MDA含量积累速度加快; 而过表达OsCNGC10植株在遭受干旱胁迫时, 体内游离Pro含量大量升高, 且MDA积累速度相对变慢, 这说明了OsCNGC10正向调控水稻苗期抗旱性。
本文的其它图/表
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