甘蔗硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族6.4基因(ScNPF6.4)克隆及其调控分蘖功能分析
李旭娟, 李纯佳, 田春艳, 孔春艳, 徐超华, 刘新龙
作物学报
2024, 50 ( 8):
2131-2142.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.44002
甘蔗(Saccharum spp. hybrid)是重要的糖料和能源作物, 分蘖是影响其产量的重要性状之一。硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族(NITRATE TRANSPORTER 1 (NRT1)/PEPTIDE TRANSPORTER (PTR) family, NPF)成员在植生长发育中发挥重要作用, 甘蔗中NPF基因的挖掘利用可为甘蔗品种分蘖遗传调控和产业升级奠定重要基础。本研究通过前期转录组数据结合反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)从甘蔗品种ROC22中获得其NPF家族成员6.4基因的cDNA全长序列(命名为ScNPF6.4), 并对其进行序列结构、理化性质、系统进化等分析, 然后开展了该基因在苗期甘蔗中的组织特异性、甘蔗腋芽萌发过程中的表达情况以及响应激素处理的表达模式分析, 最后将该基因遗传转化水稻过表达进行功能验证。结果表明, ScNPF6.4的cDNA包含1个1806 bp的开放阅读框, 编码601个氨基酸, 属于易化子超家族(major facilitator superfamily, MFS)蛋白, 其蛋白分子量为63.9 kD, 理论等电点为9.23, 包含12个跨膜螺旋区。该蛋白不存在信号肽, 具疏水性, 属于一类稳定的非分泌蛋白, 系统进化分析表明其属于NPF 6.4亚族蛋白。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于内质网。组织特异性分析发现, ScNPF6.4在苗期甘蔗根中相对表达量最高, 在叶和茎基部相对表达量较低; ScNPF6.4在不同甘蔗品种腋芽萌发阶段均上调表达; 适量浓度的植物外源激素6-BA、ABA、GA3、IBA、乙烯利和SLs均能诱导苗期甘蔗中ScNPF6.4的上调表达; 水稻中异位过表达ScNPF6.4可增加水稻分蘖数并提前孕穗。以上结果表明, ScNPF6.4正调控甘蔗分蘖芽萌发, 其表达受外源植物激素调控, 该基因过表达可增加水稻分蘖数并促进提前孕穗, 克隆该基因可为甘蔗分蘖早生快发高产育种提供重要的基因资源。
| 引物名称Primer name | 引物序列Primer sequence (5°-3°) | 引物作用 Primer function | | NPF-54F | GTCGTCCTCGCTCCCAGTC | 基因克隆
Gene cloning | | NPF-2143R | CGCCGTATGCCTCCTATGTT | | NPF-138F | ATGGTTTCCGCTGGGG | | NPF-1943R | CTACACGTCCATTCCTTCG | | Q-ScNPF-208F | TCCAACTCCAAGTCCGCCAAC | 表达分析(甘蔗)
Relative expression analysis (in sugarcane) | | Q-ScNPF-358R | CAAGCTCACGCCGGTGGC | | GAPDH-F | CACGGC CAC TGGAAGCA | 内参基因(甘蔗)
Reference gene (in sugarcane) | | GAPDH-R | TCC TCAGGG TTC CTG ATG CC | | Q-ScNPF6.4-F | CGCGAACGCCCGTGGTCCGC | 表达分析(水稻)
Relative expression analysis (in rice) | | Q-ScNPF6.4-R | CGGACACGTTCGCCTTGAGACCCCCC | | OsActin | TGCTATGTACGTCGCCATCCA | 内参基因(水稻)
Reference gene (in rice) | | OsActin | AATGAGTAACCACGCTCCGTC |
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表1
本研究所用的引物信息
正文中引用本图/表的段落
以课题组前期已获得的ScNPF6.4全长转录组序列为模板, 利用primer premier 5.0设计外巢引物NPF-54F/NPF-2143R和内巢引物NPF-138F/NPF-1943R, 引物序列见表1。以甘蔗品种ROC22叶片RNA反转录产物为模板, 利用高保真快酶TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase (全式金, 中国北京)经过2轮PCR扩增获得ScNPF6.4的cDNA序列。PCR体系参考说明书, 反应程序为: 98℃ 2 min; 95℃ 20 s, 56℃ 20 s, 72℃ 1 min, 40个循环; 72℃延伸5 min。巢式PCR以上一轮PCR产物1 μL为模板, 用内巢引物进行, 程序同前, 退火温度为49℃。PCR产物胶回收后与平末端载体(pEASY Blunt Zero Cloning kit, 全式金, 中国北京) 连接克隆后测序分析。
根据ScNPF6.4的CDS序列, 使用primer premier 5.0设计引物Q-ScNPF-208F和Q-ScNPF-358R, 以Ling等[29]发表的GAPDH基因引物序列作为内参基因引物, 引物序列见表1。分别用上述准备好的甘蔗苗期不同组织部位以及激素处理后的蔗苗基部RNA反转录产物为模板, 用全式金PerfectStart Green qPCR SuperMix按试剂盒说明书进行体系配制, 然后在ABI ViiA7 Real time PCR System (Applied Biosystems, 美国)上进行PCR扩增, 每个样品设3次生物学重复和3次技术重复, 利用2-ΔΔCT法计算ScNPF6.4在甘蔗不同组织部位、不同发育阶段分蘖芽以及各激素处理不同时间后的相对表达量, 最后再使用DPS 7.5软件进行单因素完全随机试验统计分析, 运用邓肯法进行多重比较, 分析5%概率水平下的显著性, 运用GraphPad Prism 8制作基因相对表达量柱形图。
构建具Basta抗性, 由35S启动子驱动ScNPF6.4过表达的载体pBWA(V)BS-ScNPF6.4并通过农杆菌EHA105介导遗传转化水稻中花11 (Zhonghua 11, ZH11), 经除草剂筛选和PCR验证最终获得ScNPF6.4过表达水稻阳性苗。避开ScNPF6.4与OsNRT1保守区域, 设计引物Q-ScNPF6.4-F/Q-ScNPF6.4-R (表1)对转基因水稻中的ScNPF6.4进行组织特异性表达分析, 最后进行表型分析。
本文的其它图/表
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