甘蔗硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族6.4基因(ScNPF6.4)克隆及其调控分蘖功能分析
李旭娟, 李纯佳, 田春艳, 孔春艳, 徐超华, 刘新龙
作物学报
2024, 50 ( 8):
2131-2142.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.44002
甘蔗(Saccharum spp. hybrid)是重要的糖料和能源作物, 分蘖是影响其产量的重要性状之一。硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族(NITRATE TRANSPORTER 1 (NRT1)/PEPTIDE TRANSPORTER (PTR) family, NPF)成员在植生长发育中发挥重要作用, 甘蔗中NPF基因的挖掘利用可为甘蔗品种分蘖遗传调控和产业升级奠定重要基础。本研究通过前期转录组数据结合反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)从甘蔗品种ROC22中获得其NPF家族成员6.4基因的cDNA全长序列(命名为ScNPF6.4), 并对其进行序列结构、理化性质、系统进化等分析, 然后开展了该基因在苗期甘蔗中的组织特异性、甘蔗腋芽萌发过程中的表达情况以及响应激素处理的表达模式分析, 最后将该基因遗传转化水稻过表达进行功能验证。结果表明, ScNPF6.4的cDNA包含1个1806 bp的开放阅读框, 编码601个氨基酸, 属于易化子超家族(major facilitator superfamily, MFS)蛋白, 其蛋白分子量为63.9 kD, 理论等电点为9.23, 包含12个跨膜螺旋区。该蛋白不存在信号肽, 具疏水性, 属于一类稳定的非分泌蛋白, 系统进化分析表明其属于NPF 6.4亚族蛋白。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于内质网。组织特异性分析发现, ScNPF6.4在苗期甘蔗根中相对表达量最高, 在叶和茎基部相对表达量较低; ScNPF6.4在不同甘蔗品种腋芽萌发阶段均上调表达; 适量浓度的植物外源激素6-BA、ABA、GA3、IBA、乙烯利和SLs均能诱导苗期甘蔗中ScNPF6.4的上调表达; 水稻中异位过表达ScNPF6.4可增加水稻分蘖数并提前孕穗。以上结果表明, ScNPF6.4正调控甘蔗分蘖芽萌发, 其表达受外源植物激素调控, 该基因过表达可增加水稻分蘖数并促进提前孕穗, 克隆该基因可为甘蔗分蘖早生快发高产育种提供重要的基因资源。
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图4
ScNPF6.4的表达模式分析
A: ScNPF6.4在ROC22不同组织部位的相对表达量; B: ScNPF6.4在华南56-21、桂糖17号和ROC22腋芽发生不同发育阶段表达情况; C: 不同外源植物激素处理下ScNPF6.4的相对表达量。甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)被用作内参基因。误差棒表示重复的平均值 ± 标准差(n = 3)。柱状图上不同的小写字母表示显著差异(邓肯新多量程测试(P < 0.05))。Bud 0: 休眠芽; bud 1: 萌动芽; bud 2: 膨大芽; bud 3: 伸长芽; bud 4: 冒尖叶芽。6-BA: 6-苄氨基嘌呤(400 mg L-1); ABA: 脱落酸(4 mg L-1); GA3: 赤霉素A3 (200 mg L-1); IBA: 吲哚-3-丁酸(400 mg L-1); Ethephone: 乙烯利(100 mg L-1); SLs: 独角酯内酯(20 mg L-1)。
正文中引用本图/表的段落
保守结构域预测表明, ScNPF6.4属于MFS家族蛋白, 预测其蛋白分子量为63.9 kD, 理论等电点为9.23, 不稳定性指数(II)为27.67, 为稳定蛋白, 脂族指数(Aliphatic index)为96.96, 亲水性的大平均值(GRAVY)为0.360, 为疏水蛋白。利用SOPMA预测ScNPF6.4的二级结构, 结果如附图3所示, ScNPF6.4由延伸链(e)、β-转角(t)、α-螺旋(h)和无规则卷曲(c)构成, 其中α-螺旋最多(294个氨基酸, 占比48.92%), 无规则卷曲次之(200个氨基酸, 占比33.28%), 延伸链较少(85个氨基酸, 占比14.14%), β-转角最少(22个氨基酸, 3.66%)。信号肽预测结果表明, ScNPF6.4不存在信号肽, 推测其为非分泌蛋白。Plant- mPLoc亚细胞定位预测显示ScNPF6.4定位于液泡(Vacuole)。跨膜结构域预测表明, ScNPF6.4蛋白共有12个跨膜螺旋区, 其中第6个和第7个跨膜结构域之间存在1个大的亲水环(附图4)。
基于RT-qPCR技术, 以甘蔗嫩叶为参照, 采用2-ΔΔCt法检测了苗期甘蔗各组织ScNPF6.4基因的相对表达量, 结果表明该基因在甘蔗根、茎基部、叶中均有表达, 但表达量具有显著的差异性, 其中在根中的相对表达量最高,显著高于茎基部和叶(P<0.05) (图4-A), 表明该基因在甘蔗根部表现十分活跃, 可能参与甘蔗根部硝酸盐的吸收和运输。
另外, 分别取华南56-21、桂糖17号和ROC22的休眠芽(bud 0)、萌动芽(bud 1)、膨大芽(bud 2)、伸长芽(bud 3)和冒尖叶芽(bud 4)进行ScNPF6.4在腋芽萌动发育不同阶段的表达量分析。结果表明, ScNPF6.4在3份供试材料腋芽萌动过程中(由bud 0~bud 1)均表现为上调表达, 在华南56-21和桂糖17号分蘖芽随后的发育过程中表达量有所下降后又升高并在最后的冒尖叶芽中表达量达最高, 而在ROC22中表现为继续升高随后有所下降的趋势(图4-B)。推测ScNPF6.4可促进甘蔗腋芽萌发进而促进分蘖。
分别用400、4、200、400、20和100 mg L-1的6-BA、ABA、GA3、IBA、SLs和乙烯利喷施甘蔗ROC22幼苗叶片。结果表明, 相应浓度的6-BA、ABA、GA3和IBA分别处理3、6、9 d时间范围内, ScNPF6.4相对表达量较对照没有显著差异, 但处理第12天或第15天时, ScNPF6.4显著上调表达, 其中ABA处理12 d后ScNPF6.4的表达量为对照的4.6倍, 6-BA、GA3和IBA处理15 d时ScNPF6.4表达量分别为对照的24.4、39.5和41.5倍(图4-C)。而ScNPF6.4在分别喷施SLs和乙烯利处理第3天和第6天显著上调表达后又下调表达之后随着处理时间延长, 表达量又增加, 分别为处理第12天和第15天达到最高, 为对照的5.6倍和10.5倍。
本文的其它图/表
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