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甘蔗硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族6.4基因(ScNPF6.4)克隆及其调控分蘖功能分析
李旭娟, 李纯佳, 田春艳, 孔春艳, 徐超华, 刘新龙
作物学报    2024, 50 (8): 2131-2142.   DOI: 10.3724/SP.J.1006.2024.44002
摘要   (116 HTML7 PDF(pc) (3121KB)(82)  

甘蔗(Saccharum spp. hybrid)是重要的糖料和能源作物, 分蘖是影响其产量的重要性状之一。硝酸盐转运蛋白1/肽转运蛋白家族(NITRATE TRANSPORTER 1 (NRT1)/PEPTIDE TRANSPORTER (PTR) family, NPF)成员在植生长发育中发挥重要作用, 甘蔗中NPF基因的挖掘利用可为甘蔗品种分蘖遗传调控和产业升级奠定重要基础。本研究通过前期转录组数据结合反转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)从甘蔗品种ROC22中获得其NPF家族成员6.4基因的cDNA全长序列(命名为ScNPF6.4), 并对其进行序列结构、理化性质、系统进化等分析, 然后开展了该基因在苗期甘蔗中的组织特异性、甘蔗腋芽萌发过程中的表达情况以及响应激素处理的表达模式分析, 最后将该基因遗传转化水稻过表达进行功能验证。结果表明, ScNPF6.4的cDNA包含1个1806 bp的开放阅读框, 编码601个氨基酸, 属于易化子超家族(major facilitator superfamily, MFS)蛋白, 其蛋白分子量为63.9 kD, 理论等电点为9.23, 包含12个跨膜螺旋区。该蛋白不存在信号肽, 具疏水性, 属于一类稳定的非分泌蛋白, 系统进化分析表明其属于NPF 6.4亚族蛋白。亚细胞定位分析表明该蛋白定位于内质网。组织特异性分析发现, ScNPF6.4在苗期甘蔗根中相对表达量最高, 在叶和茎基部相对表达量较低; ScNPF6.4在不同甘蔗品种腋芽萌发阶段均上调表达; 适量浓度的植物外源激素6-BA、ABA、GA3、IBA、乙烯利和SLs均能诱导苗期甘蔗中ScNPF6.4的上调表达; 水稻中异位过表达ScNPF6.4可增加水稻分蘖数并提前孕穗。以上结果表明, ScNPF6.4正调控甘蔗分蘖芽萌发, 其表达受外源植物激素调控, 该基因过表达可增加水稻分蘖数并促进提前孕穗, 克隆该基因可为甘蔗分蘖早生快发高产育种提供重要的基因资源。



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附图3 ScNPF6.4二级结构预测结果
红色e为延伸链, 绿色t为β-转角, 蓝色h为α-螺旋, 橙色c为无规则卷曲。
正文中引用本图/表的段落
保守结构域预测表明, ScNPF6.4属于MFS家族蛋白, 预测其蛋白分子量为63.9 kD, 理论等电点为9.23, 不稳定性指数(II)为27.67, 为稳定蛋白, 脂族指数(Aliphatic index)为96.96, 亲水性的大平均值(GRAVY)为0.360, 为疏水蛋白。利用SOPMA预测ScNPF6.4的二级结构, 结果如附图3所示, ScNPF6.4由延伸链(e)、β-转角(t)、α-螺旋(h)和无规则卷曲(c)构成, 其中α-螺旋最多(294个氨基酸, 占比48.92%), 无规则卷曲次之(200个氨基酸, 占比33.28%), 延伸链较少(85个氨基酸, 占比14.14%), β-转角最少(22个氨基酸, 3.66%)。信号肽预测结果表明, ScNPF6.4不存在信号肽, 推测其为非分泌蛋白。Plant- mPLoc亚细胞定位预测显示ScNPF6.4定位于液泡(Vacuole)。跨膜结构域预测表明, ScNPF6.4蛋白共有12个跨膜螺旋区, 其中第6个和第7个跨膜结构域之间存在1个大的亲水环(附图4)。
将构建好的瞬时表达载体进行酶切验证后, 通过PEG介导的原生质体转化成功将空载35S::GFP, 含目的基因载体35S::ScNPF6.4-GFP转入水稻原生质体中, 荧光显微镜观察结果如图3所示, 发现ScNPF6.4-GFP融合蛋白的绿色荧光信号主要集中在内质网区域(表现为聚集在细胞核周围并扩散在整个细胞内部)。
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