烟草脂类合成关键基因NtLPAT的功能验证
吉白璐, 孙艺文, 刘万峰, 钱亚新, 蒋彩虹, 耿锐梅, 刘旦, 程立锐, 杨爱国, 黄立钰, 李晓旭, 蒲文宣, 高军平, 张强, 文柳璎
作物学报
2025, 51 ( 9):
2527-2537.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2025.44216
溶血磷脂酰基转移酶(LPAT)是负责催化溶血磷脂酸(LPA)和脂肪酰基-辅酶A (Acyl-CoA)酯化生成磷脂酸(PA)合成途径的关键酶, 尚不清楚烟草中LPAT的基因功能。本研究从K326中克隆得到NtLPAT基因, 利用CRISPR/Cas9技术获得NtLPAT敲除植株ntlpat, 对其农艺性状和抗病性以及外观质量进行鉴定, 结合脂质组、转录组分析NtLPAT的功能。结果表明, NtLPAT受青枯病菌和黑胫病病菌的诱导。ntlpat株高降低, 对黄瓜花叶病毒病(CMV)与青枯病的抗性提高。脂质组分析表明, ntlpat中甘油酯代谢发生了重排, 三酰甘油含量显著降低, 组成类囊体膜的甘油糖脂含量(MGDG, DGDG)随之上升, 并且鞘脂和磷脂酰肌醇含量也发生变化。转录组分析表明, ntlpat的光合作用、碳固定代谢、鞘脂合成和磷脂酰肌醇信号转导途径的相关基因发生重编程, 因此推测NtLPAT具有脂酰基转移酶活性, 调控三酰甘油的从头合成途径, 并参与细胞信号传导, 影响烟草的生长和对CMV、青枯病菌的抗性, 研究结果为挖掘烟草株型及抗性改良提供基因资源和试验依据。
样品
Sample | 株高
Plant height
(cm) | 茎围
Stem circumference (cm) | 节距
Stem pitch
(cm) | 叶数
Leaf number | 腰叶长
Middle leaf length (cm) | 腰叶宽
Middle leaf width (cm) | | K326 | 103.60±2.07 a | 8.28±4.25 a | 5.05±0.45 a | 17.40±0.89 a | 67.10±2.08 a | 24.00±1.96 a | | ntlpat | 82.50±8.89 b | 8.48±0.45 a | 3.40±0.65 b | 16.75±1.26 a | 63.60±4.59 a | 23.38±2.43 a |
View table in article
表2
ntlpat突变株系主要农艺性状
正文中引用本图/表的段落
溶血磷脂酰基转移酶(lysophosphatidic acid acyltransferase, LPAT)负责催化溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)和脂肪酰基-辅酶A (acyl-coenzyme A, Acyl- CoA)酯化生成磷脂酸(phosphatidic acid, PA) [8]。PA是膜脂、信号和贮存脂类生物合成的关键中间体, 既能进行脱磷酸反应合成TAG, 也能进入磷脂合成途径参与形成生物膜结构, 广泛参与植物生长发育及逆境响应等众多生物学过程[9-11]。LPAT通过调控LPA在不同组织中转化为不同PA的代谢流来调控生物体细胞功能。目前研究人员已经从多种植物中分离出LPAT, 包括拟南芥、花生[12]、油菜[13]、棉花[14]、水稻等。拟南芥中有5个LPAT同系物, AtLPAT1编码质体LPAT, AtLPAT2~AtLPAT5编码细胞质LPAT。AtLPAT1能够在各组织中广泛表达, 影响细胞发育[15]。AtLPAT2也能够在各组织中广泛表达, 突变后导致雌配子体败育[16]; AtLPAT3主要在花粉中表达且活性高于AtLPAT2, 两者存在一定的功能冗余。AtLPAT4和AtLPAT5能在拟南芥各组织中广泛表达但丰度较低, 参与内质网中磷脂和TAG的从头合成, 与其他同源LPAT基因功能冗余, 但是在低氮胁迫下发挥重要作用[17]。在盐胁迫和干旱胁迫下, OsLPAT2被诱导表达, 产生的PA通过介导ABA反应在渗透耐受性中发挥积极作用[18]。在拟南芥中过表达PfLPAT, 不仅提高了种子的含油量, 而且增加了亚麻酸和亚油酸等不饱和脂肪酸的含量[19]。在异源四倍体油菜中, 敲除BnLPAT2和BnLPAT5后, 油体大小增加, 含油量显著降低[20]。
为明确NtLPAT是否影响烟草农艺性状和外观质量, 本研究对打顶后的K326与ntlpat的农艺性状进行测量, 对烤后烟叶的外观质量进行评价(表2和表3)。结果显示, ntlpat打顶后与对照K326相比, ntlpat株高降低21.10 cm, 茎围增加0.20 cm, 节距降低1.65 cm, 叶片数减少0.65片, 腰叶长降低3.40 cm, 腰叶宽降低0.62 cm, 其中ntlpat的株高和节距显著降低, 可见NtLPAT的功能缺失影响了烟草植株的生长。外观质量评价结果显示, ntlpat油分与色度的评价分比K326低, 但是综合评价后K326与ntlpat的量化总分分别为7.71与7.47, 二者没有差异。
综上所述, 本研究利用敲除突变体分析烟草NtLPAT的功能, 明确NtLPAT是脂类代谢的重要基因, 调节了三酰基甘油、甘油磷脂、甘油糖脂、鞘脂的代谢流, 并影响烟草植株的生长发育和对病原菌的抗性。由于脂类以多种方式参与植物对生物胁迫的反应, 包括直接作为防御物质或者作为第二信使等, NtLPAT影响植物抗性的机制较为复杂, 这可能依赖于不同病原菌诱发植物的抗病途径, 故而ntplat表现出对不同病原菌有不同的抗性。另一方面原因是烟草属于异源四倍体植物, NtLPAT在烟草基因组中至少有2个拷贝, 存在功能冗余现象。本研究所用突变体仅敲除1个基因拷贝, 突变体对病原菌的抗性不同也可能受其同源基因影响。本研究所用突变植株ntlpat可为脂类代谢及调控植物光合作用和抗病性提供研究素材, 也为烟草品种改良提供基因资源。
本文的其它图/表
-
图1
NtLPAT基因序列对比以及表达模式分析
图A中, M为DL 2000 marker, 1为阴性对照, 2为目的条带。图B为烟草、马铃薯、辣椒与番茄LPAT序列的比对。图C为NtLPAT在烟草不同组织中的表达量, Root: 地下部; Shoot: 地上部; Shoot apex: 苗端。图D为NtLPAT响应黑胫病的表达模式, 0、6、12、24 hpi表示接菌后0、6、12、24 h, R表示烟草抗黑胫品种BH1000-1, S表示感黑胫烟草品种小黄金1025。图E为NtLPAT响应青枯病表达模式, 3、9、24 hpi表示接菌后3、9、24 h, R表示烟草抗青枯品种反帝三号-丙, S表示烟草感青枯品种红花大金元, CK表示未接菌对照, RS表示接种青枯菌。*、**和***分别表示在0.05、0.01和0.001水平差异显著。
-
图2
ntlpat对青枯病抗性鉴定
图A为转基因材料鉴定峰图; 图B为K326与ntlpat接种青枯病菌后14、18、22、25、28、32、35 d时的病情指数; 图C为K326与ntlpat接种青枯0 d与35 d时的烟苗状态。*表示P < 0.05。
-
表1
ntlpat株系病毒病抗性分析
-
表3
ntlpat突变株系烟叶外观评价
-
图3
ntlpat突变株系脂质组分析图
图A为差异代谢物KEGG分类图; 图B为脂类代谢途径中的差异脂类示意图。TG: 甘油三脂; PG: 磷脂酰甘油; MGDG: 单半乳糖二酰基甘油; DGDG: 二半乳糖二酰基甘油; Cer: 神经酰胺; SPH: 鞘磷脂; PC: 磷脂酰甘油; LPA: 溶血磷脂酸; LPC: 溶血磷脂酰胆碱。
-
图4
ntlpat突变株系代谢组分析图
图A为差异表达基因GO富集柱状图; 图B为差异表达基因KEGG富集气泡图; 图C为磷脂合成途径和光合系统复合体差异表达基因示意图。
|
